Orientador: Luis Roberto Furlan / Resumo: Este estudo foi conduzido com novilhos pertencentes a diferentes grupos genéticos, Angus x Nelore (n=31), Simental x Nelore (n=30) e Canchim (n=30), objetivando identificar SSCPs (Polimorfismos de Conformação de Cadeia Simples) e RFLP (Polimorfismo no Comprimento do Fragmento de Restrição) no gene da obesidade e relacionar esses polimorfismos com a área-de-olho-de-lombo (AOL) e a espessura de gordura subcutânea (EGS) na carcaça. Cinco pares de oligonucleotídeos iniciadores foram desenhados com base na seqüência do gene da leptina bovina depositada no Genbank (U50365), para a amplificação por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) de fragmentos a partir do DNA genômico extraído dos leucócitos. Os fragmentos LEPT1, LEPT2, LEPT3 e LEPT7 foram submetidos à eletroforese em géis de poliacrilamida para identificação dos SSCPs. O fragmento LEPT4 foi digerido com a enzima de restrição Sau3AI para detecção do RFLP. Os fragmentos LEPT1, LEPT2 e LEPT7 apresentaram sete, quatro e cinco padrões diferentes de migração, respectivamente, enquanto o fragmento LEPT3 apresentou padrão monomórfico. O genótipo LEPT7-A foi relacionado à maior AOL (P<0,05), sendo que este genótipo foi mais freqüente no grupo Simental x Nelore, o qual também apresentou menor EGS (P<0,05) em relação aos animais Angus x Nelore. As freqüências do alelo A e do genótipo homozigoto AA do RFLP foram as maiores nas três populações estudadas, com valores de 90, 93 e 80%; e de 84, 87 e 68% para Angus x Nelore, Canchim e Simental x Nelore, respectivamente. Polimorfismos no exon 3 do gene da obesidade são potenciais candidatos para serem utilizados como marcadores moleculares para características de carcaça nos programas de melhoramento genético de bovinos de corte. / Abstract: This study was carried out with Angus x Nelore (n=31), Simental x Nelore (n=30) and Canchim (n=30) in order to identify SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) and RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) within obese (leptin) gene and to relate these polymorphisms with carcass's ribeye area (REA) and subcutaneous fat layer (SFL). Based on bovine leptin gene sequence (Genbank acession number: U50365), five primers were designed for PCR (Polymerase Chain Reaction) amplification of fragments using genomic DNA extracted from leukocyte. LEPT1, LEPT2, LEPT3 and LEPT7 fragments were eletrophoresed through polyacrilamide gel for SSCPs identification. LEPT4 was digested with Sau3AI for RFLP detection. LEPT1, LEPT2 and LEPT7 fragments showed seven, four and five migration patterns, respectively, while LEPT3 showed monomorphic pattern. LEPT7-A genotype was associated with higher REA (P<0.05), and this genotype was more frequent within Simmental x Nelore group, which had lesser SFL (P<0.05) in relation to Angus x Nelore. In LEPT4-RFLP, the frequencies of A allele and AA genotype were higher within three studied populations, their values were 90, 93 and 80%; and 84, 87 and 68% for Angus x Nelore, Canchim and Simental x Nelore, respectively. Polymorphisms within exon 3 of obese gene are potential candidates for using as molecular markers of carcass traits in beef cattle breed improvement programs. / Doutor

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2013-11-04T12:15:31Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado Felipe Leprevost.pdf: 8130365 bytes, checksum: 2af7aa9ac89832c8e4c552a4d889c5e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-04T12:15:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado Felipe Leprevost.pdf: 8130365 bytes, checksum: 2af7aa9ac89832c8e4c552a4d889c5e9 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Atualmente novas abordagens e metodologias de pesquisa nos permitem iniciar projetos de caracterização de um conjunto de proteínas de um determinado organismo em escalas superiores aos realizados há algum tempo. Novas tecnologias para seqüenciamento, clonagem e expressão protéica permitem a geração de uma quantidade grande de novas informações numa fração de tempo relativamente curta. Organismos como o Trypanosoma cruzi, que possuem praticamente metade de seu genoma sem função conhecida, necessitam que estudos sejam realizados para que se consiga atribuir às proteínas de função desconhecida características funcionais. Em um esforço para se conhecer melhor os genes de função desconhecida deste parasita, um grupo de 10 genes foi selecionado com base na sua expressão diferencial durante a metaciclogênese, consistindo de genes anotados como ‘proteína hipotética’ em banco de dados públicos, com domínio identificado pelo banco de famílias protéicas PFAM e com ortólogos em outros organismos. Os 10 genes selecionados foram amplificados e clonados na plataforma de clonagem Gateway e as proteínas recombinantes foram expressas em Escherichia coli. Dos 10 genes destinados à expressão protéica, 8 expressaram proteínas insolúveis as quais foram utilizadas para obtenção de soro policlonal. Os soros obtidos foram utilizados em ensaios de Western Blot para averiguação da expressão protéica ao longo da metaciclogênese do parasita e ensaios de localização celular por microscopia ótica e eletrônica. Foram realizados também ensaios de transfecção em T. cruzi para a expressão das proteínas fusionadas com GFP, visando à determinação da localização celular, utilizando um vetor compatível com a plataforma Gateway, e foram realizados ensaios de imunoprecipitação para todas as 8 proteínas expressas. Os resultados obtidos no presente trabalho auxiliam na atribuição de informações experimentais a genes e proteínas anotados como ‘proteína hipotética de função desconhecida’ e avaliam a possibilidade de implementação de um estudo sistemático com este para uma aplicação em média/larga escala / Recent research approaches and methodologies allow us to develop projects for the characterization of proteins of a given organism in scales greater than possible some time ago. New technologies for sequencing, cloning and protein expression allow the generation of large amounts of new information in relatively short time. Organisms such as Trypanosoma cruzi, which have nearly half of its genome with no known function, require studies to assign functions to proteins of unknown function. In an effort to characterize the genes of unknown function of this parasite, a group of 10 genes was selected based on their differential expression during metacyclogenesis. The genes were annotated as 'hypothetical protein' in public databases, with domains identified in the PFAM database and with orthologs in other organisms. The 10 selected genes were amplified and cloned in Gateway cloning platform and the recombinant proteins were expressed in Escherichia coli. Eight of the 10 genes expressed insoluble proteins which were used to obtain polyclonal serum. The sera were used in Western Blot analysis to verify protein expression throughout the parasite metacyclogenesis as well as cellular localization by optical and electron microscopy. To determine cellular localization, transfection experiments were conducted in T. cruzi for the expression of proteins fused with GFP using a vector compatible with the Gateway platform. Immunoprecipitation assays were also performed for the 8 expressed proteins. The results obtained in this work uncover experimental information of genes annotated as 'hypothetical protein of unknown function' and assess the possibility of implementing a systematic approach with this methodology in medium to large scale

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003-07Bitstream added on 2014-06-13T20:44:29Z : No. of bitstreams: 1 salman_akd_dr_botfmvz.pdf: 275057 bytes, checksum: 5bc5665febfc65df6266f4e7dc57a759 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este estudo foi conduzido com novilhos pertencentes a diferentes grupos genéticos, Angus x Nelore (n=31), Simental x Nelore (n=30) e Canchim (n=30), objetivando identificar SSCPs (Polimorfismos de Conformação de Cadeia Simples) e RFLP (Polimorfismo no Comprimento do Fragmento de Restrição) no gene da obesidade e relacionar esses polimorfismos com a área-de-olho-de-lombo (AOL) e a espessura de gordura subcutânea (EGS) na carcaça. Cinco pares de oligonucleotídeos iniciadores foram desenhados com base na seqüência do gene da leptina bovina depositada no Genbank (U50365), para a amplificação por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) de fragmentos a partir do DNA genômico extraído dos leucócitos. Os fragmentos LEPT1, LEPT2, LEPT3 e LEPT7 foram submetidos à eletroforese em géis de poliacrilamida para identificação dos SSCPs. O fragmento LEPT4 foi digerido com a enzima de restrição Sau3AI para detecção do RFLP. Os fragmentos LEPT1, LEPT2 e LEPT7 apresentaram sete, quatro e cinco padrões diferentes de migração, respectivamente, enquanto o fragmento LEPT3 apresentou padrão monomórfico. O genótipo LEPT7-A foi relacionado à maior AOL (P<0,05), sendo que este genótipo foi mais freqüente no grupo Simental x Nelore, o qual também apresentou menor EGS (P<0,05) em relação aos animais Angus x Nelore. As freqüências do alelo A e do genótipo homozigoto AA do RFLP foram as maiores nas três populações estudadas, com valores de 90, 93 e 80%; e de 84, 87 e 68% para Angus x Nelore, Canchim e Simental x Nelore, respectivamente. Polimorfismos no exon 3 do gene da obesidade são potenciais candidatos para serem utilizados como marcadores moleculares para características de carcaça nos programas de melhoramento genético de bovinos de corte. / This study was carried out with Angus x Nelore (n=31), Simental x Nelore (n=30) and Canchim (n=30) in order to identify SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) and RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) within obese (leptin) gene and to relate these polymorphisms with carcass’s ribeye area (REA) and subcutaneous fat layer (SFL). Based on bovine leptin gene sequence (Genbank acession number: U50365), five primers were designed for PCR (Polymerase Chain Reaction) amplification of fragments using genomic DNA extracted from leukocyte. LEPT1, LEPT2, LEPT3 and LEPT7 fragments were eletrophoresed through polyacrilamide gel for SSCPs identification. LEPT4 was digested with Sau3AI for RFLP detection. LEPT1, LEPT2 and LEPT7 fragments showed seven, four and five migration patterns, respectively, while LEPT3 showed monomorphic pattern. LEPT7-A genotype was associated with higher REA (P<0.05), and this genotype was more frequent within Simmental x Nelore group, which had lesser SFL (P<0.05) in relation to Angus x Nelore. In LEPT4-RFLP, the frequencies of A allele and AA genotype were higher within three studied populations, their values were 90, 93 and 80%; and 84, 87 and 68% for Angus x Nelore, Canchim and Simental x Nelore, respectively. Polymorphisms within exon 3 of obese gene are potential candidates for using as molecular markers of carcass traits in beef cattle breed improvement programs.

Orientador: Sergio Roberto Peres Line / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-28T15:30:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Trevilatto_PaulaCristina_M.pdf: 3125878 bytes, checksum: 6c22f296426df0c0ec2347f87a129c94 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: O estudo visou buscar polimorfismos do gene da amelogenina X (AMGX). Para tanto, analisou 79 indivíduos do sexo feminino (158 cromossomos), de etnias diferentes, quanto à presença de variações de sítios de restrição (RFLP) em cinco segmentos intragênicos amplificados por PCR. Uma deleção de aproximadamente 700 pb foi evidenciada em uma paciente, provavelmente em região intrônica, pois não foi observada qualquer alteração fenotípica no esmalte dental. Foram detectadas duas formas variantes com relação ao padrão de restrição da enzima Rsa I no segundo intron do gene. O trabalho também reportou a extração e amplificação de DNA genômico de alta massa molecular a partir de células epiteliais em processo de descamação da mucosa bucal. O método de obtenção de DNA a partir dessas células é não-invasivo, rápido, fácil e barato, sendo especialmente indicado na coleta de DNA de crianças e pessoas relutantes em doar sangue. Além disso, não apresenta riscos de infecção e dispensa a supervisão médica, podendo ser utilizado com sucesso em amostragens populacionais de larga escala e em estudos epidemiológicos / Abstract: The study aimed to search for polymorphisms of the amelogenin X (AMGX) gene. It analyzed 79 female individuaIs (158 chromosomes), from different races, as for the variations of restriction sites (RFLP) of five fragments of the AMGX amplified by PCR. A deletion of about 700 bp was observed in one of the patients, probably in an intronic region. No phenotypic alterations were noted in the dental enamel of this individual. Two variant forms were visualized with two different pattems of restriction of the enzyme Rsa I in the second intron of the gene. The number of women studied is small to precisely determine the frequency of the alleles in the population. The work also reported the extraction and amplification of genomic DNA of high molecular mass from epithelial cells of the bucal mucosa. The method using DNA obtained from these cells is easy, rapid, cheap and non-invasive, being especially indicated for DNA collection of children and people reluctant to donate blood. In addition, it does not present risks of infection and require no medical supervision. It can be successfully employed in large scale populational samplings and in epidemiological studies / Mestrado / Mestre em Biologia e Patologia Buco-Dental

Entre as doenças causadas por bactérias do gênero Mycobacterium, a tuberculose por M. tuberculosis é a mais conhecida. O diagnóstico da doença é feito utilizando-se um conjunto de exames que possibilitam a identificação da mesma (WATT, 2000). Contudo, sabe-se que o diagnóstico combinado de microscopia direta e com o posterior isolamento em meio de cultivo é o “padrão-ouro”. A principal desvantagem desse método é que tal bactéria possui um crescimento lento (cerca de 8 semanas). Recentemente, a detecção de doenças através da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) tem proporcionado avanços significativos no diagnóstico. O uso da amplificação específica de genes, para identificar a M. tuberculosis, tais como rDNA 16S, IS6110 ou a região intergênica senX3-regX3, tem apresentado algumas restrições, ao nível de confiabilidade e sensibilidade, para a aplicação da técnica de PCR. O presente estudo mostra a construção e a aplicação de um novo alvo para a aplicação da PCR no diagnóstico da tuberculose, baseado no ensaio da diferença de organização gênica do operon plcA, B e C diferenciando a M. tuberculosis das demais micobactérias. Neste trabalho, foram examinadas 273 amostras de pacientes com suspeita de tuberculose, sendo estas submetidas ao estudo comparativo da técnica de PCR versus cultivo (padrão ouro). A PCR amplificou fragmentos de 439pb. Os resultados mostram 93,7% de acurácia para PCR/Cultivo (p<000,1), 93,1% de sensibilidade com intervalo de confiança de 88,7-96,0 e especificidade de 96,4% com intervalo de confiança de 96,4-99,4. O valor da estatística Kappa (k) foi de 0,82 com erro padrão de 0,041, demonstrando um alinhamento quase perfeito para a verificação do grau de concordância entre os testes. Desta forma, o uso desta nova região para a amplificação da PCR se mostra uma importante e confiável ferramenta no diagnóstico específico da tuberculose. Outra região que compreende parte dos genes mbaA e inhA foi utilizada para diferenciar o Complexo tuberculosis do Complexo avium. Porém, novos experimentos serão necessários para o emprego desta região como uma ferramenta de diagnóstico.

Resumo não disponível.

Entre as doenças causadas por bactérias do gênero Mycobacterium, a tuberculose por M. tuberculosis é a mais conhecida. O diagnóstico da doença é feito utilizando-se um conjunto de exames que possibilitam a identificação da mesma (WATT, 2000). Contudo, sabe-se que o diagnóstico combinado de microscopia direta e com o posterior isolamento em meio de cultivo é o “padrão-ouro”. A principal desvantagem desse método é que tal bactéria possui um crescimento lento (cerca de 8 semanas). Recentemente, a detecção de doenças através da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) tem proporcionado avanços significativos no diagnóstico. O uso da amplificação específica de genes, para identificar a M. tuberculosis, tais como rDNA 16S, IS6110 ou a região intergênica senX3-regX3, tem apresentado algumas restrições, ao nível de confiabilidade e sensibilidade, para a aplicação da técnica de PCR. O presente estudo mostra a construção e a aplicação de um novo alvo para a aplicação da PCR no diagnóstico da tuberculose, baseado no ensaio da diferença de organização gênica do operon plcA, B e C diferenciando a M. tuberculosis das demais micobactérias. Neste trabalho, foram examinadas 273 amostras de pacientes com suspeita de tuberculose, sendo estas submetidas ao estudo comparativo da técnica de PCR versus cultivo (padrão ouro). A PCR amplificou fragmentos de 439pb. Os resultados mostram 93,7% de acurácia para PCR/Cultivo (p<000,1), 93,1% de sensibilidade com intervalo de confiança de 88,7-96,0 e especificidade de 96,4% com intervalo de confiança de 96,4-99,4. O valor da estatística Kappa (k) foi de 0,82 com erro padrão de 0,041, demonstrando um alinhamento quase perfeito para a verificação do grau de concordância entre os testes. Desta forma, o uso desta nova região para a amplificação da PCR se mostra uma importante e confiável ferramenta no diagnóstico específico da tuberculose. Outra região que compreende parte dos genes mbaA e inhA foi utilizada para diferenciar o Complexo tuberculosis do Complexo avium. Porém, novos experimentos serão necessários para o emprego desta região como uma ferramenta de diagnóstico.

Orientador: Estela Kaminagakura Tango / Banca: Ana Lia Anbinder / Banca: Silvana Pasetto / Resumo: O carcinoma de células escamosas (CEC) de boca é uma neoplasia incomum em pacientes jovens. Na literatura de língua inglesa não há relatos de estudos que investiguem a amplificação do EGFR e a expressão desta proteína neste grupo etário. O objetivo deste estudo foi investigar a amplificação do EGFR através da técnica de hibridização por fluorescência in situ (FISH) e correlacionar os resultados obtidos através da imunomarcação da proteína EGFR com a epidemiologia e com o prognóstico dos pacientes avaliados. Ao final dos testes de FISH e imunohistoquímicos, 21 amostras do grupo teste (pacientes ≤ 40 anos) e 39 amostras do grupo controle (pacientes ≥ 50 anos) foram consideradas adequadas para avaliação. As variáveis clínicas e anatomopatológicas foram comparadas pelos testes Qui-Quadrado ou exato de Fisher. A expressão do marcador EGFR e do método de FISH foi comparada entre os grupos por meio do teste não paramétrico de Mann-Whitney. As curvas de sobrevida foram calculadas utilizando o método de Kaplan-Meier e suas curvas foram comparadas através do teste de log-rank. Houve maior número de pacientes do sexo masculino, leucodermas, tabagistas e etilistas. A amplificação do EGFR foi maior no grupo teste (p = 0,018). A amplificação do EGFR associou-se estatisticamente com a variável estadiamento clínico avançado (p = 0,013), independente do grupo. A expressão da proteína EGFR correlacionou-se com tumores bem diferenciados (p = 0,011) e a presença de metástase (p = 0,035), independente da idade. A presença de amplificação foi mais frequente no grupo tese. Alguns casos de pacientes ≥40 anos de idade podem ser adequados ao emprego da terapia anti-EGFR, devido à amplificação do EGFR / Abstract: Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is uncommon neoplasia in young patients. In the English literature, there are no reports of studies that investigate the amplification of EGFR and expression of this protein in this age group. The aim of this study was to investigate the amplification of EGFR by fluorescence in situ hybridization (FISH) and to correlate the results by immunostaining of EGFR protein with clinicopathological features and prognosis. After FISH and immunohistochemistry, 21 samples of the test group (≤ 40 years) and 39 samples of control group (≥ 50 years) were suitable for evaluating. Categorical variables were compared by the Pearson chi-square test or Fisher's exact test. Associations between protein levels and FISH results with clinicopathological characteristics of the patients were analyzed by Mann-Whitney U test. Survival rates were calculated using the Kaplan-Meier method and the curves were compared by the log-rank test. There was predominance for male patients, leucoderma, smoking and alcohol consumption. The EGFR amplification was higher in the test group (p = 0.018) and it was associated statistically with advanced clinical stage (p = 0.013), independent of the group. The expression of EGFR protein was correlated to well differentiated tumors (p = 0.011) and presence of metastasis (p = 0.035), regardless of age. Presence of EGFR amplification and/or expression. Some cases of patients ≥40 years old might be suitable for anti-EGFR therapy because of EGFR amplification / Mestre

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