INTRODUÇÃO: O melanoma primário da cavidade oral é uma neoplasia agressiva, rara e originada a partir da proliferação de melanócitos malignos da mucosa. Ele representa aproximadamente de 0,2 a 8% de todos os melanomas. Estudos recentes apontam algumas vias moleculares tem sido encontradas por estarem envolvidas na patogenia dos melanomas. Dentre essas vias destaca-se a via proliferativa da MAPK (mitogen activated protein kinase), esta cascata de sinalização está envolvida no controle do crescimento celular, proliferação e migração, e tem sido relacionada com um papel importante no desenvolvimento e progressão do melanoma cutâneo. OBJETIVOS: Analisar a expressão proteica e mutação pontual dos componentes da via MAPK e correlacionar com os dados clínicos-histológicos. MATERIAL E MÉTODOS: Através da imunoistoquímica avaliar a expressão proteica dos anticorpos RAS; BRAF; MEK1; MEK2; ERK1 e ERK2 em 35 casos de melanomas orais organizados em matriz (TMA: Tissue Microarray) e através de pirosequenciamento avaliar a mutação pontual dos genes BRAF; NRAS; KRAS em 14 casos de melanomas orais. RESULTADOS: Idade dos pacientes entre 9 e 91 anos, sem predileção por sexo, 75% caucasianos, 71,42% acometeram o palato, 80% com aspecto histológico grau III. A análise da expressão proteica foi: RAS (28,57%); BRAF (82,85%); MEK1 (0%); MEK2 (51,43%); ERK1 (20%)e ERK2 (74,28%). Na análise molecular observamos mutações para BRAF (9/14 casos) e NRAS (2/14 casos). CONCLUSÃO: Todos os aspectos da via MAPK necessita de outras elucidações em melanomas de áreas foto-protegidas e melanomas de mucosa e comparando diferentes populações. Entretanto, os resultados deste presente estudo apontam importante alterações na cascata RAS-RAF-MEK-ERK e estes são indicadores de prognóstico ruim em melanomas primários da mucosa oral, independente da exposição solar / BACKGROUND: Primary melanoma of the oral cavity is an aggressive and rare neoplasm and originated from the proliferation of malignant melanocytes of the mucosa. It represents approximately 0.2 to 8% of all melanomas. Recent studies indicate some molecular pathways have been found to be involved in the pathogenesis of melanomas. Among these means there is a proliferative MAPK pathway (\"mitogen activated protein kinase\"), this signaling pathway is involved in controlling cell growth, proliferation and migration, and it has been associated with a role in the development and progression of melanoma skin. OBJECTIVES: To analyze protein expression and mutation of components of the MAPK pathway and to correlate with the clinical, histological data. MATERIALS AND METHODS: Using immunohistochemistry to evaluate the protein expression of RAS, BRAF, MEK1, MEK2, ERK1 and ERK2 antibodies in 35 cases of oral melanomas organized array (TMA: Tissue Microarray) and using pyrosequencing to assess the mutation of the BRAF, NRAS, KRAS in 14 cases of oral melanomas. RESULTS: Age of patients between 9 and 91 years, regardless of gender, 75% Caucasian, 71.42% in palate, 80% with histologic grade III. Analysis of protein expression was: RAS (28.57%); BRAF (82.85%); MEK1 (0%), MEK2 (51.43%); ERK1 (20%) and ERK2 (74.28%). Molecular analysis we found BRAF mutations (9/14 cases) and NRAS (2/14 cases). CONCLUSION: All aspects of the MAPK pathway requires further elucidation in melanomas of photo-protected areas and mucosal melanomas and comparing different populations. However, the results of this study indicate important changes in the cascade RAS-RAF-MEK-ERK and these are indicators of poor prognosis in primary melanomas of the oral mucosa, regardless of sun exposure

Estudos de variações genéticas raras têm caracterizado com sucesso regiões do genoma e processos biológicos envolvidos no risco de desenvolver transtornos psiquiátricos. Dentro deste contexto, o sequenciamento de nucleotídeos em larga escala de exons do genoma inteiro para a observação de variações raras, conhecidas em inglês como single-nucleotide variation (SNV), e mutações espontâneas (\"de novo\" - DNM) tornou-se uma abordagem essencial na descoberta de novos genes de risco para transtornos psiquiátricos. Até o presente momento, nenhum estudo de SNV e variações de novo com sequenciamento de todas as regiões codificantes foi relatado no transtorno obsessivo-compulsivo (TOC). No presente estudo, este sequenciamento foi feito em 20 casos esporádicos de TOC e seus pais, para investigar a presença de variações raras de novo e herdadas nos probandos. A partir da observação de que os produtos de genes (proteínas) associados a uma mesma doença interagem em uma rede de interação proteína-proteína (IPP), foi feita uma rede de IPP com os genes (proteína) que apresentaram variações de novo não sinônimas, para observar dentre estes genes o de maior importância na rede de IPP. A fim de investigar a relevância desta rede, foi aplicado um algoritmo de grau informativo para redes, baseado na priorização de genes relacionados com doenças (Degree-Aware Algorithms for Network-Based Disease Gene Prioritization - DADA) que ordenou os genes com variações de novo não sinônimas, embasado na associação destes com uma lista de genes envolvidos em conferir risco para TOC provenientes de uma meta-análise de genética em TOC. Além disso, foi feita uma análise de processos biológicos envolvidos com os genes que apresentavam variações raras herdadas. No total, 10 variações de novo não sinônimas (9 missense e 1 nonsense) foram validadas utilizando-se o sequenciamento Sanger. Os genes WWP1, AP1G1 e CR1, advindos da lista inicial de genes com variações não sinônimas, foram altamente conectados na rede de IPP. O gene WWP1 foi o gene com maior pontuação no ranking de resultados do algoritmo DADA. Os resultados de processos biológicos envolvendo estes genes sugerem o envolvimento do sistema imunológico em TOC. Além disso, todos os genes com variações de novo não sinônimas, exceto um, são genes com expressão no cérebro e envolvidos com sinaptogênese e morte neuronal / Studies of rare variations have been used successfully to characterize regions of the genome and molecular pathways conferring risk for developmental neuropsychiatric disorders. Within this context, whole-exome sequencing for rare single-nucleotide variation (SNV) and de novo mutation (DNM) mutation has become an essential approach for gene discovery in psychiatric disease. To date, few if any studies of SNVs and de novo variation using this technology have been reported for obsessive-compulsive disorder (OCD). In the present study, all coding regions of the genome were sequenced for 20 sporadic probands with OCD and their parents, to investigate de novo and inherited rare variations in probands. Subsequently, based on the observation that the products of genes associated with similar diseases are likely to interact with each other heavily in a network of proteinprotein interactions (PPIs), a PPI network was generated, with the genes (protein) with non-synonymous de novo variation, to observe the most important genes in the network. To investigate the relevance of this network to OCD further, degree-aware disease gene prioritization (DADA) was applied, to rank all genes with non-synonymous de novo variation based on their relatedness to a set of genes previously identified in an OCD genetics meta-analysis. In addition, pathway analyses using de novo and inherited variation were completed. Altogether, 10 non-synonymous de novo variations (9 missense, 1 nonsense) were successfully validated by Sanger sequencing. We found that the genes WWP1, AP1G1 and CR1, from the initial non-synonymous de novo variation gene list, were highly interconnected in the PPI. The WWP1 gene had the highest rank in the DADA analyses. Results of the pathway analyses suggest the enrichment of genes involved in immunological systems. In short, almost all genes involved in the DNMs of the present study are expressed in the human brain and implicated in synaptogenesis and neuronal apoptosis

Orientador: Reginaldo Palazzo Júnior / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação / Made available in DSpace on 2018-08-26T03:06:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_DiogoGuilherme_M.pdf: 2278721 bytes, checksum: d52e9ddea8e27d992073c5cf8ba3674f (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: É evidente os benefícios proporcionados pela aplicação da teoria da informação nas análises dos processos de codificação genética. Este trabalho propõe o desenvolvimento de algoritmos, e sua implementação computacional, para a realização de análises em sequências de DNA por meio dos códigos BCH. O primeiro programa irá calcular diversos polinômios geradores que serão utilizados pelos outros programas. O segundo programa se utiliza destes polinômios geradores para realizar análises em sequências de DNA e identificar palavras-código na forma de novas sequências de DNA. Já o terceiro programa, de iniciativa inédita, se utiliza tanto dos polinômios geradores quanto as palavras-código e realiza um processo de decodificação com o intuito de rastrear as mutações passiveis de ocorrer em sequências de DNA / Abstract: The benefits provided by the application of information theory in the analyses of genetic coding processes are evident. In this work the development of algorithms and their computational implementations are proposed, with the aim at performing analyses of DNA sequences by use of BCH codes. The first program calculates several generator polynomials which are used by other programs. The second program uses generator polynomials to perform DNA sequence analyses and to identify the codewords in the form of new DNA sequences. The third program by using both the generator polynomials as well as the codewords to perform a decoding process in order to predict mutations that may occur in DNA sequences / Mestrado / Telecomunicações e Telemática / Mestre em Engenharia Elétrica

No presente estudo, foram selecionados 33 pacientes infectados com HCV genótipo 3a, tratados com IFN e Ribavirina, incluindo pacientes cirróticos (C) e não-cirróticos (NC), respondedores (R) e não-respondedores (NR). Foi realizado o seqüenciamento das regiões E2 e NS5A do genoma do HCV. As seqüências geradas foram analisadas quanto a presença de mutações para correlacionarmos com a resposta virológica sustentada ao tratamento e com a presença de cirrose. Na análise estatística as mutações na região E2 não apresentaram diferença significante. As mutações conservadoras encontradas nas regiões NLS e V3 da NS5A apresentaram diferença significante. Estudos funcionais envolvendo a proteína NS5A são necessários para que possamos avaliar o valor preditivo das mutações conservadoras e não-conservadoras encontradas na NS5A / The aim of this study was to analyse the sequences of fragments of E2 and NS5A regions from 33 outpatients infected with HCV genotype 3, including cirrhotic (C) and non-cirrhotic (NC) patients that have responded (R) or not (NR) to treatment. In the E2 region, we did observe few amino acids changes between patients without statistical significance. In the NLS region and in V3 domain, we found conservatives mutations with statistical significance. In conclusion, our results confirm that the ISDR domain is not predictive for treatment success in patients infected with HCV genotype 3. The carboxy-terminal region and especifically V3 domain region showed most of variations. Structure-function studies are required to identify precisely how NS5A and IFN interact

A síndrome de Noonan (SN) é uma doença de herança autossômica, relativamente frequente na população e que apresenta heterogeneidade genética. Caracteriza-se por dismorfismos faciais, baixa estatura, pescoço curto/alado, alterações cardíacas, deformidades esternais e criptorquia. A SN apresenta sobreposição dos achados clínicos com outras síndromes mais raras, denominadas síndromes Noonan-like (SNL): síndrome cardio-facio-cutânea (CFC), síndrome de Costello (SC), neurofibromatose-síndrome de Noonan (NFSN), síndrome de Noonan com manchas lentiginosas/síndrome de LEOPARD (SL), síndrome de Noonan-like com perda de cabelos anágenos (SNL-PCA) e síndrome de Noonan-like com leucemia mielomonocítica juvenil (SNL-LMMJ). As SN e SNL decorrem de mutações em genes pertencentes à via de sinalização RAS/MAPK alguns dos quais são protooncogenes, o que tem despertado o interesse na caracterização do risco de desenvolvimento de neoplasias nessas síndromes. Os objetivos deste estudo visam o sequencimento conjunto dos genes PTPN11, SOS1, RAF1, KRAS, SHOC2, BRAF e HRAS em pacientes com diagnóstico clínico das SN e SNL a fim de: determinar a frequência de mutação; estabelecer uma correlação genótipo-fenótipo; estabelecer um fluxograma para o estudo molecular a partir dos hotspots; e avaliar se a variabilidade fenotípica apresentada nos pacientes com SN pode ser explicada pela presença de mutações em mais de um gene da via RAS/MAPK. Foram avaliados 194 probandos - 152 com SN e 42 com SNL (19 CFC, 15 NFNS, 4 CS e 4 LS). Mutações foram identificadas em 99 pacientes 80 com SN (53%); 19 com SNL. Apenas um paciente com SN apresentou mutação em dois genes da via RAS/MAPK (PTPN11 e SOS1). O estudo molecular na SN mostrou, assim como na literatura, um maior envolvimento do gene PTPN11 (34%), seguido dos genes SOS1 (12%) e RAF1 (7%). A comparação dos achados clínicos, levando em consideração as alterações gênicas, também confirma as correlações já descritas na literatura; entre elas observamos que pacientes com SN e mutação no gene: PTPN11, apresentaram maior frequência de estenose pulmonar valvar (EPV) e baixa estatura; SOS1, apresentaram maior frequência de EPV; RAF1, apresentaram maior frequência de miocardiopatia hipertrófica, e menor frequência de EPV e déficit intelectual; SHOC2, apresentaram anormalidades de cabelo. Na nossa casuística também foram observados alguns achados raros: craniosinostose, tumor expansivo em fossa posterior e a primeira descrição de um tumor sólido (schwanomatose) em um paciente com mutação no gene KRAS. A partir deste estudo foi possível estabelecer um fluxograma para investigação molecular devido à correlação genótipo-fenótipo, que embora não seja totalmente precisa, explica parte da grande variabilidade clínica observada em especial quanto ao tipo de cardiopatia. A presença de mutações em diferentes genes da via RAS/MAPK não é frequente, além de não agravar o fenótipo e não explicar a variabilidade fenotípica observada. Embora um grande avanço no conhecimento sobre SN e SNL tenha sido alcançado, vários aspectos precisam ser melhor elucidados, como: caracterização precisa da propensão ao desenvolvimento de neoplasias, estudos que permitam avaliar as consequências biológicas das mutações, identificação de outros genes responsáveis, assim como outros fatores genéticos e/ou ambientais que possam explicar a variabilidade clínica inter e intrafamilial / Noonan syndrome (NS) is a relatively common, autosomal dominant disease that presents a marked genetic heterogeneity. It is characterized by facial dysmorphisms, short stature, webbed/short neck, cardiac abnormalities, esternal anomalies and cryptorchidism. NS shows clinical overlap of some of its findings with other rarer syndromes, known as Noonan-like syndromes (NLS): cardio-facio-cutaneous syndrome (CFC), Costello syndrome (CS), neurofibromatosis-Noonan syndrome (NFNS), Noonan syndrome with lentiginous stains/LEOPARD syndrome (LS), Noonan-like syndrome with loose anagen hair (NLS-LAH) and Noonan-like syndrome with juvenile myelomonocytic leukemia (NLS-JMML). NS and NLS are related to mutations in genes belonging of RAS-MAPK signaling pathway. Some of these genes are classified as proto-oncogenes. This fact also arouses the interest in the characterization of the risk for cancer development in this group of patients. The objectives of this study are to sequence the genes associated with NS and NLS (PTPN11, SOS1, RAF1, KRAS, SHOC2, HRAS and BRAF) in patients that fulfilled clinical diagnostic criteria for NS or NLS to: determine the frequency of the mutations; establish a genotype-phenotype correlation; estabilish a flowchart for molecular study from the hotspots; and evaluate when the phenotypic variability presented in NS patients can be explained by the presence of mutations in more than one gene of the RAS/MAPK pathway. This study evaluated 194 probands 152 with NS e 42 with NLS (19 CFC, 15 NFSN, 4 SC e 4 SL). Mutations were identified in 99 patients 80 with NS (53%), 19 with NLS. Only one patient presented mutation in two different genes of the RAS/MAPK pathway (PTPN11 and SOS1). The molecular analysis showed a predominance of mutations in the PTPN11 gene (34%), followed by the SOS1 (12%) and RAF1 (7%) genes in patients with NS, in accordance with the literature. Patients with NS and mutation in the: PTPN11 gene, presented a higher frequency of valvular pulmonary stenosis (VPS) and short stature; SOS1 gene, showed a higher frequency of VPS; RAF1 gene, showed a higher frequency of hypertrophic cardiomyopathy and lower frequency of VPS and intellectual deficit; and SHOC2 gene, showed more hair abnormalities. This genotype-phenotype correlations is also concordant with the literature. In our study, we also observed some rare finds in some patients: craniosynostosis, expansive tumor in the posterior fossa and the first description of a solid tumor (schwanomatose) in a patient with NS and KRAS gene mutation. Based on this genotype-phenotype correlation, we have proposed a flowchart for molecular investigation. The presence of mutation in more them one gene of the RAS/MAPK pathway was not frequent; additionally, it did not aggravate the phenotype and could not explain the phenotypic variability observed. Although a great advance in the knowledge about SN and SNL has been achieved, several aspects remain to be clarified, as the exact risk for cancer development, functional studies to assess the biological consequences of the mutations and the identification of other genes, as well as other genetic and/or environmental factors that influence the interand intrafamilial clinical variability

Os insulinomas são os tumores neuroendócrinos pancreáticos funcionantes mais frequentes, entretanto, os aspectos moleculares envolvidos em sua tumorigênese precisam ser melhor esclarecidos. As características morfológicas e histoquímicas dos insulinomas não conseguem predizer completamente seu comportamento biológico, apenas o fenótipo invasivo local e a presença de metástase são as formas confiáveis do diagnóstico maligno. A presente investigação teve por objetivos analisar a expressão gênica por reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real e a expressão protéica por imuno-histoquímica dos componentes da via de sinalização do fator de crescimento hepatocítico (HGF) e seu receptor (c-MET) em 27 amostras de insulinomas, sendo: 16 tumores benignos grau 1 (G1), seis tumores benignos grau 2 (G2), dois insulinomas malignos grau 3 (G3) e três metástases hepáticas. Além disso, realizou-se a pesquisa de mutações somáticas no gene MET. Observou-se (1) o aumento da expressão dos genes HGF, MET e ST14 (codificante para a matriptase) e a baixa expressão do gene HAI-1 (codificante para a protease inibidora tipo-kunitz do tipo 1) nos insulinomas malignos e metástases quando comparados aos insulinomas benignos G1; (2) uma correlação positiva entre a expressão do mRNA do gene MET e o gene ST14 e índice proliferativo Ki-67, bem como uma correlação inversa entre a expressão do mRNA do gene HAI-1 e os genes MET, HGF, ST14 e o índice mitótico; (3) uma correlação positiva entre a expressão do gene ST14 e a expressão do mRNA do gene HGF; (4) maior expressão protéica de c-MET nos insulinomas malignos G3 em relação aos insulinomas G1/G2 e (5) ausência de mutações nos éxons 2, 10, 14, 16, 17 e 19 do gene MET. Concluiu-se que os genes HGF, MET, ST14 e HAI-1 estão diferencialmente expressos entre insulinomas malignos e benignos, o que pode ter implicações diagnósticas e terapêuticas / In an attempt to better understand the molecular processes involved in the tumourigenesis of islet beta-cells, the present study evaluated the expression of genes belonging to the hepatocyte growth factor and its receptor (HGF/MET) system, namely, MET, HGF; HGFAC and ST14 (encode HGF activator and matriptase, respectively, two serine proteases that catalyze conversion of pro-HGF to active HGF); and SPINT1 and SPINT2 (encode serine peptidase inhibitors Kunitz type 1 and type 2, respectively, two potent inhibitors of HGF activator and of matriptase) in 27 sporadic insulinomas; 16 grade 1 (G1), six grade 2 (G2), two grade 3 (G3) and three hepatic metastases. Quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction was employed to assess RNA expression of the target genes and immunohistochemical analysis was used to evaluate the expression of MET and SPINT1. Somatic mutations of MET gene were searched by direct sequencing of exons 2, 10, 14, 16, 17 and 19. Overexpression of MET was observed in grouped G3 insulinomas and metastases concomitantly with upregulation of the genes encoding HGF and matriptase and downregulation of SPINT1. Positive correlations were observed between MET RNA expression and Ki-67 proliferation index while a negative correlation was detected between SPINT1 expression and the mitotic index. No somatic mutations were found in MET gene. The final effect of the increased expression of HGF, its activator (matriptase) and its specific receptor (MET) together with a decreased expression of one potent inhibitor of matriptase (SPINT1) is probably a contribution to tumoural progression and malignancy in insulinomas

INTRODUÇÃO: O bócio é um termo genérico usado para descrever o aumento no volume da glândula tireoide que pode estar associado à formação de múltiplos nódulos, o chamado bócio multinodular. Camundongos transgênicos tireoide específicos com depleção do Pten ou aumento de expressão do Dream, dois importantes genes que têm sido implicados nas vias de sinalização das células foliculares, apresentam desenvolvimento de bócio. Em humanos, uma larga porcentagem de pacientes com doença de Cowden apresentam bócio ou outras anormalidades tireoidianas associadas a mutações germinativas no PTEN. OBJETIVO: O objetivo desse estudo foi investigar a expressão dos genes PTEN e DREAM em tecido hiperplásico tireoidiano, bem como mutações germinativas e somáticas no PTEN e mutações somáticas no DREAM, em pacientes portadores de bócio multinodular, com a finalidade de avaliar o papel destes genes na etiologia do bócio. MÉTODOS: Foram investigados 60 pacientes com bócio multinodular (54 mulheres). A extração do DNA genômico foi realizada a partir de tecido hiperplásico da tireoide e do sangue periférico dos pacientes enquanto o RNA foi obtido apenas do tecido glandular. A quantificação relativa do RNA mensageiro do PTEN e do DREAM foi avaliada pelo método de 2-??Ct utilizando o GAPDH como normalizador em dados produzidos pela PCR em tempo real. A alta e a baixa expressão de PTEN e DREAM foram definidas, respectivamente, por valores de quantificação superiores a 2.0 e inferiores a 0.5 em comparação a um pool comercial de RNA de tireoide normal de humanos. Análise de mutação foi realizada por amplificação da região codificante dos genes PTEN e DREAM pela PCR convencional seguida por sequenciamento automático (RQ = quantificação relativa; x? = média e DP = desvio padrão). RESULTADOS: Foi observada alta expressão do PTEN em 58,3% dos pacientes portadores de bócio (x RQ = 3,81; DP = 2,26) enquanto apenas dois casos apresentaram baixa expressão (x? RQ = 0,34; DP= 0,09). Nos 38,3% casos restantes foi observada expressão normal de PTEN (x? RQ = 1,35; DP = 0,35). Em relação ao gene DREAM, alta e baixa expressão foram observadas em 33,3% (x RQ = 6,07; DP = 5,02) e 15,0% (x RQ = 0,30; DP = 0,10) dos pacientes com bócio respectivamente, enquanto pouco mais da metade dos casos (51,6%) teve expressão normal RQ = 1,12 ; DP = 0,40). A Análise de mutações do PTEN e do DREAM revelaram apenas polimorfismos intrônicos, previamente descritos no banco de dados do NCBI, tanto nos DNA de sangue e/ou de tecido hiperplásico. CONCLUSÕES: Nossos resultados demonstraram uma expressão aumentada de PTEN em bócio multinodular, sugerindo que este pode estar hiperexpresso, ou pelo menos tem sua expressão mantida, nesta hiperplasia benigna da tireoide. Alterações na sequência gênica codificante do PTEN não foram observadas. Na análise mutacional e de expressão do DREAM não foram encontradas alterações que pudessem ser relacionadas à patogênese de bócio em humanos / BACKGROUND: Multinodular goiter is a clinicopathological entity characterized by an increased volume of the thyroid gland with formation of nodules. A high proliferative status of thyroid follicular cells and goiter were observed in mutants mice with specifically deleted Pten or Dream overexpression in thyrocytes. In humans, a large percentage of patients with Cowden disease have goiters or other thyroid abnormalities associated with germ-line PTEN mutations. OBJECTIVE: The aim of this study was to investigate the tissue expression of PTEN and DREAM, as well as germ-line and somatic PTEN mutations and somatic DREAM mutations, in patients with multinodular goiter to evaluated the role of these genes in goitrogenesis. METHODS: We investigated 60 multinodular goiter patients (54 females). Genomic DNA was extracted from both patients\' hyperplastic thyroid tissue and peripheral blood whereas RNA was obtained only from glandular tissue. Relative quantification of PTEN and DREAM messenger RNA was evaluated using 2-Ct method normalized to GAPDH expression on data produced by real-time PCR. PTEN and DREAM over and lower expression were respectively defined by value > 2.0-fold and < 0.5-fold relative to a commercial pool of normal human thyroid RNA. Mutations analyses were performed by amplification of PTEN and DREAM coding region by PCR followed by automatic sequencing. RQ = relative quantification; x = average; SD = standard deviation. RESULTS: We observed a high expression of PTEN in 58.3% of multinodular goiter patients (RQ x = 3.81; SD = 2.26) and only two cases with lower expression (RQ x = 0.34; SD = 0.09). In the remaining 38.3% of patients expression of PTEN was normal (RQ x = 1.35; SD = 0.35). For the DREAM, over and lower expression were observed in 33.3% (RQ x = 6.07; SD = 5.02) and 15.0% (RQ x = 0.30; SD = 0.10) of patients respectively, whereas 51.6% had normal expression (RQ x = 1.12; SD = 0.40). Regarding PTEN and DREAM mutations analysis, only previously described intronic polymorphisms were observed in DNA from blood and/or thyroid hyperplastic tissue. CONCLUSIONS: Our results demonstrated that PTEN expression is higher in multinodular goiter suggesting that this gene is overregulated (or at least has its expression maintained) in this benign hyperplastic thyroid lesions. No evidence for the involvement of DREAM in goitrogenesis was observed in our cohort of multinodular goiter patients

A síndrome de Noonan (SN) é uma doença de herança autossômica, relativamente frequente na população e que apresenta heterogeneidade genética. Caracteriza-se por dismorfismos faciais, baixa estatura, pescoço curto/alado, alterações cardíacas, deformidades esternais e criptorquia. A SN apresenta sobreposição dos achados clínicos com outras síndromes mais raras, denominadas síndromes Noonan-like (SNL): síndrome cardio-facio-cutânea (CFC), síndrome de Costello (SC), neurofibromatose-síndrome de Noonan (NFSN), síndrome de Noonan com manchas lentiginosas/síndrome de LEOPARD (SL), síndrome de Noonan-like com perda de cabelos anágenos (SNL-PCA) e síndrome de Noonan-like com leucemia mielomonocítica juvenil (SNL-LMMJ). As SN e SNL decorrem de mutações em genes pertencentes à via de sinalização RAS/MAPK alguns dos quais são protooncogenes, o que tem despertado o interesse na caracterização do risco de desenvolvimento de neoplasias nessas síndromes. Os objetivos deste estudo visam o sequencimento conjunto dos genes PTPN11, SOS1, RAF1, KRAS, SHOC2, BRAF e HRAS em pacientes com diagnóstico clínico das SN e SNL a fim de: determinar a frequência de mutação; estabelecer uma correlação genótipo-fenótipo; estabelecer um fluxograma para o estudo molecular a partir dos hotspots; e avaliar se a variabilidade fenotípica apresentada nos pacientes com SN pode ser explicada pela presença de mutações em mais de um gene da via RAS/MAPK. Foram avaliados 194 probandos - 152 com SN e 42 com SNL (19 CFC, 15 NFNS, 4 CS e 4 LS). Mutações foram identificadas em 99 pacientes 80 com SN (53%); 19 com SNL. Apenas um paciente com SN apresentou mutação em dois genes da via RAS/MAPK (PTPN11 e SOS1). O estudo molecular na SN mostrou, assim como na literatura, um maior envolvimento do gene PTPN11 (34%), seguido dos genes SOS1 (12%) e RAF1 (7%). A comparação dos achados clínicos, levando em consideração as alterações gênicas, também confirma as correlações já descritas na literatura; entre elas observamos que pacientes com SN e mutação no gene: PTPN11, apresentaram maior frequência de estenose pulmonar valvar (EPV) e baixa estatura; SOS1, apresentaram maior frequência de EPV; RAF1, apresentaram maior frequência de miocardiopatia hipertrófica, e menor frequência de EPV e déficit intelectual; SHOC2, apresentaram anormalidades de cabelo. Na nossa casuística também foram observados alguns achados raros: craniosinostose, tumor expansivo em fossa posterior e a primeira descrição de um tumor sólido (schwanomatose) em um paciente com mutação no gene KRAS. A partir deste estudo foi possível estabelecer um fluxograma para investigação molecular devido à correlação genótipo-fenótipo, que embora não seja totalmente precisa, explica parte da grande variabilidade clínica observada em especial quanto ao tipo de cardiopatia. A presença de mutações em diferentes genes da via RAS/MAPK não é frequente, além de não agravar o fenótipo e não explicar a variabilidade fenotípica observada. Embora um grande avanço no conhecimento sobre SN e SNL tenha sido alcançado, vários aspectos precisam ser melhor elucidados, como: caracterização precisa da propensão ao desenvolvimento de neoplasias, estudos que permitam avaliar as consequências biológicas das mutações, identificação de outros genes responsáveis, assim como outros fatores genéticos e/ou ambientais que possam explicar a variabilidade clínica inter e intrafamilial / Noonan syndrome (NS) is a relatively common, autosomal dominant disease that presents a marked genetic heterogeneity. It is characterized by facial dysmorphisms, short stature, webbed/short neck, cardiac abnormalities, esternal anomalies and cryptorchidism. NS shows clinical overlap of some of its findings with other rarer syndromes, known as Noonan-like syndromes (NLS): cardio-facio-cutaneous syndrome (CFC), Costello syndrome (CS), neurofibromatosis-Noonan syndrome (NFNS), Noonan syndrome with lentiginous stains/LEOPARD syndrome (LS), Noonan-like syndrome with loose anagen hair (NLS-LAH) and Noonan-like syndrome with juvenile myelomonocytic leukemia (NLS-JMML). NS and NLS are related to mutations in genes belonging of RAS-MAPK signaling pathway. Some of these genes are classified as proto-oncogenes. This fact also arouses the interest in the characterization of the risk for cancer development in this group of patients. The objectives of this study are to sequence the genes associated with NS and NLS (PTPN11, SOS1, RAF1, KRAS, SHOC2, HRAS and BRAF) in patients that fulfilled clinical diagnostic criteria for NS or NLS to: determine the frequency of the mutations; establish a genotype-phenotype correlation; estabilish a flowchart for molecular study from the hotspots; and evaluate when the phenotypic variability presented in NS patients can be explained by the presence of mutations in more than one gene of the RAS/MAPK pathway. This study evaluated 194 probands 152 with NS e 42 with NLS (19 CFC, 15 NFSN, 4 SC e 4 SL). Mutations were identified in 99 patients 80 with NS (53%), 19 with NLS. Only one patient presented mutation in two different genes of the RAS/MAPK pathway (PTPN11 and SOS1). The molecular analysis showed a predominance of mutations in the PTPN11 gene (34%), followed by the SOS1 (12%) and RAF1 (7%) genes in patients with NS, in accordance with the literature. Patients with NS and mutation in the: PTPN11 gene, presented a higher frequency of valvular pulmonary stenosis (VPS) and short stature; SOS1 gene, showed a higher frequency of VPS; RAF1 gene, showed a higher frequency of hypertrophic cardiomyopathy and lower frequency of VPS and intellectual deficit; and SHOC2 gene, showed more hair abnormalities. This genotype-phenotype correlations is also concordant with the literature. In our study, we also observed some rare finds in some patients: craniosynostosis, expansive tumor in the posterior fossa and the first description of a solid tumor (schwanomatose) in a patient with NS and KRAS gene mutation. Based on this genotype-phenotype correlation, we have proposed a flowchart for molecular investigation. The presence of mutation in more them one gene of the RAS/MAPK pathway was not frequent; additionally, it did not aggravate the phenotype and could not explain the phenotypic variability observed. Although a great advance in the knowledge about SN and SNL has been achieved, several aspects remain to be clarified, as the exact risk for cancer development, functional studies to assess the biological consequences of the mutations and the identification of other genes, as well as other genetic and/or environmental factors that influence the interand intrafamilial clinical variability

Os insulinomas são os tumores neuroendócrinos pancreáticos funcionantes mais frequentes, entretanto, os aspectos moleculares envolvidos em sua tumorigênese precisam ser melhor esclarecidos. As características morfológicas e histoquímicas dos insulinomas não conseguem predizer completamente seu comportamento biológico, apenas o fenótipo invasivo local e a presença de metástase são as formas confiáveis do diagnóstico maligno. A presente investigação teve por objetivos analisar a expressão gênica por reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real e a expressão protéica por imuno-histoquímica dos componentes da via de sinalização do fator de crescimento hepatocítico (HGF) e seu receptor (c-MET) em 27 amostras de insulinomas, sendo: 16 tumores benignos grau 1 (G1), seis tumores benignos grau 2 (G2), dois insulinomas malignos grau 3 (G3) e três metástases hepáticas. Além disso, realizou-se a pesquisa de mutações somáticas no gene MET. Observou-se (1) o aumento da expressão dos genes HGF, MET e ST14 (codificante para a matriptase) e a baixa expressão do gene HAI-1 (codificante para a protease inibidora tipo-kunitz do tipo 1) nos insulinomas malignos e metástases quando comparados aos insulinomas benignos G1; (2) uma correlação positiva entre a expressão do mRNA do gene MET e o gene ST14 e índice proliferativo Ki-67, bem como uma correlação inversa entre a expressão do mRNA do gene HAI-1 e os genes MET, HGF, ST14 e o índice mitótico; (3) uma correlação positiva entre a expressão do gene ST14 e a expressão do mRNA do gene HGF; (4) maior expressão protéica de c-MET nos insulinomas malignos G3 em relação aos insulinomas G1/G2 e (5) ausência de mutações nos éxons 2, 10, 14, 16, 17 e 19 do gene MET. Concluiu-se que os genes HGF, MET, ST14 e HAI-1 estão diferencialmente expressos entre insulinomas malignos e benignos, o que pode ter implicações diagnósticas e terapêuticas / In an attempt to better understand the molecular processes involved in the tumourigenesis of islet beta-cells, the present study evaluated the expression of genes belonging to the hepatocyte growth factor and its receptor (HGF/MET) system, namely, MET, HGF; HGFAC and ST14 (encode HGF activator and matriptase, respectively, two serine proteases that catalyze conversion of pro-HGF to active HGF); and SPINT1 and SPINT2 (encode serine peptidase inhibitors Kunitz type 1 and type 2, respectively, two potent inhibitors of HGF activator and of matriptase) in 27 sporadic insulinomas; 16 grade 1 (G1), six grade 2 (G2), two grade 3 (G3) and three hepatic metastases. Quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction was employed to assess RNA expression of the target genes and immunohistochemical analysis was used to evaluate the expression of MET and SPINT1. Somatic mutations of MET gene were searched by direct sequencing of exons 2, 10, 14, 16, 17 and 19. Overexpression of MET was observed in grouped G3 insulinomas and metastases concomitantly with upregulation of the genes encoding HGF and matriptase and downregulation of SPINT1. Positive correlations were observed between MET RNA expression and Ki-67 proliferation index while a negative correlation was detected between SPINT1 expression and the mitotic index. No somatic mutations were found in MET gene. The final effect of the increased expression of HGF, its activator (matriptase) and its specific receptor (MET) together with a decreased expression of one potent inhibitor of matriptase (SPINT1) is probably a contribution to tumoural progression and malignancy in insulinomas

INTRODUÇÃO: O bócio é um termo genérico usado para descrever o aumento no volume da glândula tireoide que pode estar associado à formação de múltiplos nódulos, o chamado bócio multinodular. Camundongos transgênicos tireoide específicos com depleção do Pten ou aumento de expressão do Dream, dois importantes genes que têm sido implicados nas vias de sinalização das células foliculares, apresentam desenvolvimento de bócio. Em humanos, uma larga porcentagem de pacientes com doença de Cowden apresentam bócio ou outras anormalidades tireoidianas associadas a mutações germinativas no PTEN. OBJETIVO: O objetivo desse estudo foi investigar a expressão dos genes PTEN e DREAM em tecido hiperplásico tireoidiano, bem como mutações germinativas e somáticas no PTEN e mutações somáticas no DREAM, em pacientes portadores de bócio multinodular, com a finalidade de avaliar o papel destes genes na etiologia do bócio. MÉTODOS: Foram investigados 60 pacientes com bócio multinodular (54 mulheres). A extração do DNA genômico foi realizada a partir de tecido hiperplásico da tireoide e do sangue periférico dos pacientes enquanto o RNA foi obtido apenas do tecido glandular. A quantificação relativa do RNA mensageiro do PTEN e do DREAM foi avaliada pelo método de 2-??Ct utilizando o GAPDH como normalizador em dados produzidos pela PCR em tempo real. A alta e a baixa expressão de PTEN e DREAM foram definidas, respectivamente, por valores de quantificação superiores a 2.0 e inferiores a 0.5 em comparação a um pool comercial de RNA de tireoide normal de humanos. Análise de mutação foi realizada por amplificação da região codificante dos genes PTEN e DREAM pela PCR convencional seguida por sequenciamento automático (RQ = quantificação relativa; x? = média e DP = desvio padrão). RESULTADOS: Foi observada alta expressão do PTEN em 58,3% dos pacientes portadores de bócio (x RQ = 3,81; DP = 2,26) enquanto apenas dois casos apresentaram baixa expressão (x? RQ = 0,34; DP= 0,09). Nos 38,3% casos restantes foi observada expressão normal de PTEN (x? RQ = 1,35; DP = 0,35). Em relação ao gene DREAM, alta e baixa expressão foram observadas em 33,3% (x RQ = 6,07; DP = 5,02) e 15,0% (x RQ = 0,30; DP = 0,10) dos pacientes com bócio respectivamente, enquanto pouco mais da metade dos casos (51,6%) teve expressão normal RQ = 1,12 ; DP = 0,40). A Análise de mutações do PTEN e do DREAM revelaram apenas polimorfismos intrônicos, previamente descritos no banco de dados do NCBI, tanto nos DNA de sangue e/ou de tecido hiperplásico. CONCLUSÕES: Nossos resultados demonstraram uma expressão aumentada de PTEN em bócio multinodular, sugerindo que este pode estar hiperexpresso, ou pelo menos tem sua expressão mantida, nesta hiperplasia benigna da tireoide. Alterações na sequência gênica codificante do PTEN não foram observadas. Na análise mutacional e de expressão do DREAM não foram encontradas alterações que pudessem ser relacionadas à patogênese de bócio em humanos / BACKGROUND: Multinodular goiter is a clinicopathological entity characterized by an increased volume of the thyroid gland with formation of nodules. A high proliferative status of thyroid follicular cells and goiter were observed in mutants mice with specifically deleted Pten or Dream overexpression in thyrocytes. In humans, a large percentage of patients with Cowden disease have goiters or other thyroid abnormalities associated with germ-line PTEN mutations. OBJECTIVE: The aim of this study was to investigate the tissue expression of PTEN and DREAM, as well as germ-line and somatic PTEN mutations and somatic DREAM mutations, in patients with multinodular goiter to evaluated the role of these genes in goitrogenesis. METHODS: We investigated 60 multinodular goiter patients (54 females). Genomic DNA was extracted from both patients\' hyperplastic thyroid tissue and peripheral blood whereas RNA was obtained only from glandular tissue. Relative quantification of PTEN and DREAM messenger RNA was evaluated using 2-Ct method normalized to GAPDH expression on data produced by real-time PCR. PTEN and DREAM over and lower expression were respectively defined by value > 2.0-fold and < 0.5-fold relative to a commercial pool of normal human thyroid RNA. Mutations analyses were performed by amplification of PTEN and DREAM coding region by PCR followed by automatic sequencing. RQ = relative quantification; x = average; SD = standard deviation. RESULTS: We observed a high expression of PTEN in 58.3% of multinodular goiter patients (RQ x = 3.81; SD = 2.26) and only two cases with lower expression (RQ x = 0.34; SD = 0.09). In the remaining 38.3% of patients expression of PTEN was normal (RQ x = 1.35; SD = 0.35). For the DREAM, over and lower expression were observed in 33.3% (RQ x = 6.07; SD = 5.02) and 15.0% (RQ x = 0.30; SD = 0.10) of patients respectively, whereas 51.6% had normal expression (RQ x = 1.12; SD = 0.40). Regarding PTEN and DREAM mutations analysis, only previously described intronic polymorphisms were observed in DNA from blood and/or thyroid hyperplastic tissue. CONCLUSIONS: Our results demonstrated that PTEN expression is higher in multinodular goiter suggesting that this gene is overregulated (or at least has its expression maintained) in this benign hyperplastic thyroid lesions. No evidence for the involvement of DREAM in goitrogenesis was observed in our cohort of multinodular goiter patients