Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Oxidative stress reflects an imbalance between the systemic manifestation of reactive species and a biological system s ability to readily detoxify the reactive intermediates or to repair the resulting damage. This condition may facilitate the onset of various pathological processes, including infections. Anacardium microcarpum is a native species from the Northeast Brazil, used in folk medicine as a tonic for the treatment of inflammation, rheumatism, tumor, and infectious diseases. However, there is no information in the litterature regarding the involvement of antioxidant and antibacterial activities of A. microcarpum in its pharmacological properties, especially in relation to oxidative stress. Therefore, the first part of this study aimed at evaluating in vitro, the potential antioxidant of ethanolic, methanolic and ethyl acetate fractions from the stem barks of A. microcarpum using chemical and biological models, as well as their possible toxic effects in human leukocytes and erythrocytes. The results demonstrated that all the fractions (1-400 μg/mL) scavenged the 1,1-difenil-2-picrilhidrazila (DPPH) radical, and inhibited lipid peroxidation caused by Fe2+ (10 μM) in rat brain and liver homogenates. The fractions did not have any toxic effect on leukocytes and did not caused hemolysis of erythrocytes. Based on these results, the second part of this work was to investigate the antibacterial potential of these fractions against Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Sthapylococccus aureus, and their modulatory potential in combination with antibiotics drugs. The data revealed that all the fractions exhibited low antibacterial activity against multidrug resistant strains with minimal inhibitory concentration (MIC) of 512 μg/mL. However, the fractions showed notorious synergism with antibiotic drugs, especially from the class of aminoglycosides against E. coli, when they were added to the growth medium at the sub-inhibitory concentration (i.e., MIC/8 = 64 μg/mL). In conclusion, the results demonstrated for the first time the antioxidant activity of A. microcarpum which can be at least in part, attributed to its polyphenolic content. The possible interaction of chemical constituent from A. microcarpum with antibiotics may be associated with the modulation observed. Taken together, the use of A. microcarpum in traditional medicine has a scientific base and could be a promising source for the discovery of new drugs that could assist in the treatment of infectious diseases. / O estresse oxidativo resulta do desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) ou de nitrogênio (ERN) e/ou da diminuição do sistema de defesa antioxidante. Esta condição pode predispor o surgimento de vários processos patológicos, como os infecciosos. Anacardium microcarpum é uma espécie nativa da região Nordeste do Brasil, sendo usada na medicina popular, como tônico no tratamento de inflamação, reumatismo, tumores e doenças infecciosas. Porém, há falta de estudos na literatura sobre o envolvimento da atividade antioxidante e antibacteriana de A. microcarpum em suas propriedades farmacológicas, especialmente em relação ao estresse oxidativo. Sendo assim, a primeira parte deste trabalho avaliou in vitro, o potencial antioxidante das frações etanólica, metanólica e acetato de etila das cascas do caule de A. microcarpum usando modelos químicos e biológicos, bem como, seus possíveis efeitos tóxicos em leucócitos e eritrócitos humanos. Os resultados demonstraram que todas as frações de A. microcarpum (1-400 μg/mL) sequestraram o radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazila (DPPH) e inibiram a peroxidação lipídica induzida pelo Fe2+ (10 μM) em homogeizados de cérebro e fígado de ratos. As frações não apresentaram nenhum efeito tóxico na viabilidade celular em leucócitos, e não induziram a hemólise dos eritrócitos humanos. A partir destes resultados, a segunda parte deste trabalho investigou o potencial antibacteriano destas frações diante de linhagens padrão de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Sthapylococccus aureus e sua atividade moduladora de drogas antibacterianas de uso clínico. Os dados revelaram que houve fraca inibição do crescimento bacteriano na presença das frações com a CIM (concentração inibitória mínima) de 512 μg/mL. Entretanto, as frações apresentaram efeito modulatório relevante em combinação com antibacterianos, sendo os resultados especialmente notórios, para um sinergismo com aminoglicosídeos contra cepas multirresistentes de E. coli quando elas foram adicionadas ao meio de crescimento a uma concentração sub-inibitória (CIM/8 = 64 μg/mL). Em conclusão, os resultados apresentados demonstram de forma inédita, a atividade antioxidante de A. microcarpum, o que pode pelo menos em parte, ser atribuído ao seu conteúdo polifenólico. É possível sugerir que a interação dos constituintes químicos de A. microcarpum com os antibióticos provavelmente está relacionada aos efeitos moduladores observados. Com base nestes estudos, pode-se dizer que o uso de A. microcarpum na medicina tradicional apresenta base científica e a espécie é promissora para a descoberta de novas drogas que poderiam auxiliar no tratamento de doenças infecciosas.

Submitted by Ana Damasceno (ana.damasceno@unipampa.edu.br) on 2017-05-09T19:13:02Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Efeito neuroprotetor de Anacardium Microcapum-duke em dano induzido por 6-ohda em córtex cerebral de Pintainhos.pdf: 1865633 bytes, checksum: 3c3083e33b14387c66dd69ed3da41472 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-09T19:13:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Efeito neuroprotetor de Anacardium Microcapum-duke em dano induzido por 6-ohda em córtex cerebral de Pintainhos.pdf: 1865633 bytes, checksum: 3c3083e33b14387c66dd69ed3da41472 (MD5) Previous issue date: 2017-04-05 / A Doença de Parkinson (DP) é uma doença degenerativa, crônica e progressiva, acomete o sistema nervoso central e é responsável pela degeneração dos neurônios dopaminérgicos. Sabese que alterações genéticas e ambientais como exposição a agroquímicos, estresse oxidativo e disfunção mitocondrial estão associados à progressão da doença. A neurotoxina 6hidroxidopamina (6-OHDA), é um análogo estrutural da catecolamina dopamina, servindo como um modelo de neurotoxicidade por mecanismos semelhantes ao observado na DP. O mecanismo de citotoxicidade atribuído a 6-OHDA está diretamente ligado com a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) oriundas da inibição da respiração mitocondrial e sua auto-oxidação. A busca por terapias alternativas como os antioxidantes tem crescido ao longo dos anos, buscando atenuar a progressão da DP através de compostos bioativos de plantas. Neste estudo buscou-se avaliar o efeito neuroprotetor de Anacardium microcarpum frente ao dano induzido pela neurotoxina 6-OHDA em fatias corticais de pintainhos. Fatias foram incubada por 2h na presença da neurotoxina e diferentes concentrações do extrato hidroalcoólico (AMHE) e frações acetato de etila (AMEAF) e metanólica (AMMF) de A. microcarpum. AMHE, AMMF e AMEAF (1-1000 µg/mL) não apresentaram citotoxicidade per se nas fatias corticais. AMMF e AMEAF restauraram a queda da viabilidade induzida por 6OHDA (500 µM) a partir da concentração de 100 µg/mL, sendo a AMMF nesta mesma concentração, capaz de reverter a peroxidação lipídica causada pelo composto. 6-OHDA aumentou a atividade de GST e TrxR e diminuiu a atividade da GPx, além de diminuir os níveis de GSH total e aumentar a razão GSH/GSSG. Tais efeitos não foram observados na presença de AMME. Ainda, 6-OHDA inibiu o complexo I da cadeia respiratória mitocondrial, sendo que a fração não reverteu este efeito. Além disso, a auto-oxidação de 6-OHDA não foi revertida pela planta. A fosforilação de p38, JNK1/2, ERK1/2 e AKT bem como clivagem de PARP foi avaliada frente ao tratamento com neurotoxina e fração metanólica. A fração não levou a aumentos significativos na fosforilação das MAPKs bem como na expressão destas, também não levou à clivagem da proteína PARP. Entretanto, na presença de fração e 6-OHDA houve aumento significativo na fosforilação de ERK1/2 sem alterar sua expressão. Averiguou-se o envolvimento de ERK1/2 e AKT, proteínas envolvidas nos mecanismos de sobrevivência, na neurotoxicidade induzida por 6-OHDA através do uso de inibidores. Observou-se que na presença de inibidor, o extrato não foi capaz de proteger contra o dano promovido por 6-OHDA. Nossos resultados sugerem que o extrato tem ação antioxidante contra o estresse oxidativo decorrente da inibição da respiração mitocondrial e auto-oxidação da neurotoxina, sem no entanto interferir nestes processos. Além disso, sugere-se que as proteínas anti-apoptóticas ERK1/2 e AKT estejam envolvidas no efeito neuroprotetor da fração por mecanismos ainda não conhecidos. Nossos dados mostram pela primeira vez a ação neuroprotetora de A. microcarpum frente ao dano neuronal induzido pela 6-OHDA em fatias cerebrais e / Parkinson's disease (PD) is a degenerative, chronic and progressive disease, which affects the central nervous system and it is responsible for degeneration of dopaminergic neurons. It is known that genetic and environmental factors such as exposure to agrochemical, oxidative stress and mitochondrial dysfunction are associated with progression of the disease. 6hydroxydopamine (6-OHDA) is a structural analogue of catecholamine dopamine, used as a model of neurotoxicity by similar mechanism in PD. The mechanism of cytotoxicity attributed to 6-OHDA is linked to the production of reactive oxygen species (ROS) from inhibition of mitochondrial respiration and its autoxidation. The search for alternative therapies such as antioxidants has grown over the years, seeking to mitigate the progress of PD through bioactive plant compounds. This study aimed to evaluate the neuroprotective effect of Anacardium microcarpum on the damage induced by neurotoxin 6-OHDA in cortical slices of chicks. Slices were incubated for 2 h in the presence of neurotoxin and different concentrations of hydroalcoholic extract (AMHE) and ethyl acetate (AMEAF) and methanol (AMMF) fractions of A. microcarpum. AMHE, AMMF and AMEAF (1-1000 μg/mL) did not show cytotoxicity per se in the cortical slices. AMMF and AMEAF restored the drop in viability caused by 6OHDA (500 μM) from the concentration of 100 μg/mL. 6-OHDA increased GST and TrxR activity while GPx activity and total GSH levels was decreased with an augmented ratio GSH / GSSG. These effects were not observed in the presence of AMMF and 6-OHDA. Furthermore, 6-OHDA inhibited the complex I of the mitochondrial respiratory chain but this effect was not reversed by fraction as well as the self-oxidation of 6-OHDA was not avoided by the plant. Phosphorylation of p38, JNK1/2, ERK1/2 and AKT as well as PARP cleavage was evaluated against treatment with neurotoxin and methanolic fraction. The methanolic fraction and 6OHDA did not alter phosphorylation of MAPKs, as well as expression of these proteins, not did it result in the cleavage of the PARP protein in the time studies. However, in the presence of fraction and 6-OHDA there was a significant increase in ERK1/2 phosphorylation without altering its expression. The involvement of ERK1/2 and AKT proteins in protective mechanism of fraction was analyzed through the use of inhibitors. It was observed that in presence of inhibitor, the extract was not able to protect against the damage promoted by 6-OHDA. Our results suggest that the extract presented antioxidant action against oxidative stress resulted from the inhibition of mitochondrial respiration and neurotoxin autoxidation. In addition, it is suggested that antiapoptotic proteins ERK1/2 and AKT are involved in neuroprotective effect of the fraction. Our data show for the first time a neuroprotective action of A. microcarpum against neuronal damage induced by 6-OHDA in cerebral slices and highlights the potential of this plant as a source of bioactive compounds with therapeutic potential

O homem sempre buscou nas plantas uma alternativa no tratamento para resolver suas patologias. As plantas medicinaisvêm sendo utilizados para fins terapêuticos e em alguns casos sem conhecer o princípio ativo e a toxicidade destes, o Anacardium occidentale L (caju) planta com pseudofruto suculento, é característico da região tropical do Brasil. O Anacardium microcarpum D (cajui) presente na região dos cerrados da Amazônia e das regiões Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste brasileiro. O metabolismo secundário das folhas, cascas e pseudofruto dessas plantas produz compostos fenólicos,com atividades anti-inflamatória, antioxidante e antimicrobiana. Os objetivos deste estudo foi realizar a prospecção fitoquímica,avaliar a atividade antimicrobiana, antioxidante e anti-inflamatória, in vivo e in vitrode extratos das folhas do Anacardium occidentaleL (caju)e Anacardium microcarpumD (cajui). Os resultados estão divididos em três artigos, sendo composto poruma revisão sistemática das ações antimicrobiana e antioxidantedo caju (Anacardium occidentale), do cajuí (Anacardium microcarpum)e dopequí (Caryocar brasiliense), edois artigos originais, um com ensaios antioxidante e antimicrobiano in vitroe outro com ensaios do controle metabólico, estresse oxidativo e hepatoxicidadein vivo. Artigo 1. Antioxidant and antimicrobial activities of crude extracts and fractions of cashew (Anacardium occidentale L.), cajui (Anacardium microcarpum) and pequi (Caryocar brasiliense C). A systematic review. Elaborou-se uma revisão sistemática dos trabalhos que apresentassem resultados de ensaios com extratos das partes das espécies vegetais acima mencionadas. Foram analisadas as bases de dados Pubmed/Medline, Biblioteca virtual em Saúde (Lilacs e Scielo) e Science Direct.De um total de 425 artigos, 32 foram incluídos, sendo19 estudos com Anacardiumoccidentale,3 com Anacardiummicrocarpum e 10 comCaryocar brasiliense.A técnica para avaliação da capacidade antioxidante in vitro mais utilizada foi de DPPH e da atividade microbiológica foi a concentração inibitória mínima e difusão em discos. A maioria dos ensaios que foram descritos demonstraram resultados potencialmente positivos às ações antioxidantes e antimicrobianas quando da utilização das espécies estudadas. Os resultados trazem importantes dados e perspectivas para a utilização de produtos naturais que possam contribuir para o tratamento de várias enfermidades, destacando-se principalmente as doenças e agravos não transmissíveis. Artigo 2. Caracterização fitoquímica e análise das atividades antimicrobiana e antioxidante de folhas de Anacardium occidentale L. e Anacardium microcarpum D., in vitro. A partir das folhas secas trituradas foram preparados extratos brutos etanólicos de A. occidentale L e A. microcarpum D. Realizou-se a composição centesimal da matéria seca, para determinar a quantidade de lipídios, proteínas, cinzas, umidade e carboidratos totais. A cromatografia de camada delgada foi a técnica de escolha para a prospecção fitoquímica. Por espectrofotometria e regressão linear foram quantificados os fenólicos e flavonoides totais dos extratos. A Cromatografia Líquida de Alta Permance (HPLC) foi utilizada para verificar a presença de ácido anacárdico. No ensaio antioxidante utilizaram-se as metodologias de captura de radicais estáveis DPPH (2,2-difenil-1-picrilidrazila)e a atividade antioxidante por meio da captura do radical 2,2´- azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)-ABTS. Para os testes microbiológicos utilizou-se a concentração inibitória mínima em microplacas de 96 poços a partir de cepas multirresistentes de origem hospitalar.Os extratos etanólicos de Anacardium occidentaleL e AnacardiummicrocarpumDapresentaram captura de radicais DPPH e ABTS semelhantes e foram encontrados 2,32 e 1,64 mg EAG (equivalentes de ácido gálico) de fenólicos totais e valores de flavonóides totais de 0,34 e 0,29 mg ER (equivalentes de rutina), respectivamente.Na prospecção fitoquímicados dois extratos foi verificada a presença deflavonoides, taninos, saponinas, óleos essenciais e triterpenos. O A. microcarpumDfoio extrato que apresentou a menor concentração inibitória mínima, com valor de 0,78 mg/mLem cepas de S.aureus. Os extratos etanólicos das folhasapresentaram capacidade microbicida e antioxidante in vitro, o que sugereserem potenciais produtos para aelaboração de um fitoterápico. Artigo 3. Atividade antioxidante, análises bioquímicas e histopatológica de folhas de A. occidentale L. e A. microcarpum D. em camundongos knockout para interleucina 10. Para os ensaios foram utilizados camundongos knockout para interleucina 10, divididos em seis grupos: controle (G1) apenas água e ração; Anacardium occidentale (G2) água, ração e extrato; Anacardium microcarpum (G3) água, ração e extrato;paracetamol (G4) indução com paracetamol por oito dias; paracetamol+Anacardium occidentale (G5), tratados após injúria; paracetamol+Anacardium microcarpum (G6), tratados após injúria. Após serem anestesiadosfoi coletado o sangue retroorbital para contagem de leucócitos e para análises bioquímicas da alanina aminotransferase (ALT), aspartato transferase (AST), gama glutamil transferase (GGT), fosfatase alcalina (FAO), colesterol total e triglicerídeos. O macerado do fígado foi utilizado para as análises do estresse oxidativo a partir dos ensaios de malondialdeído (MDA), superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa e proteína carbonilada. Foi realizada a histopatologia do fígado, a partir da análise da presença ou ausência de alterações do núcleo; congestão sinusóide; esteatose; infiltrado inflamatório, colestase e vacuolização do citoplasma.A análise doestresse oxidativo em macerado de fígado apresentou melhores resultados nos camundongos tratados com Anacardium microcarpumD, na maioria das enzimas. Os camundongos tratados com os dois extratos, sem injúria por paracetamol e tratados com A. microcarpum após injúria, apresentaram resultados significativos para SOD e CAT, demonstrando eficiência na eliminação de espécies reativas de oxigênio. Destaca-se também o resultado da proteína carbonilada com redução efetiva nos grupos tratados com os dois extratos após injúria com paracetamol. Na análise histopatológica do fígado os camundongos tratados com os dois extratos apresentaram redução no infiltrado inflamatório e na colestase, demonstrando diminuição no processo inflamatório após a injúria pelo paracetamol. Os resultados confirmam a hipótese de atividade antioxidante das folhas do Anacardium occidentale L e do Anacardium microcarpum D, o que sugerea utilização das folhas para desenvolver um produto fitoterápico. / Mankind has always sought in plants alternative treatments to pathologies, and the knowledge and use of them, for many traditional communities, may be the only therapeutic option. Medicinal plants have been used for therapeutic purposes, in some cases without so much as the knowledge of their active ingredients and toxicity. On the other hand, there are several known actions performed by plant derivatives, being some: antiviral, antispasmodic, analgesic, antimicrobial, healing, expectorant, relaxing, antiseptic, respiratory, larvicidal, vermifuge and anti-inflammatory action. The increase of multiresistant bacteria stimulates interest in the search for new therapeutic alternatives with antimicrobial power. This has caused an emergence of research in the area, especially from plant resources. The Anacardium occidentale L (cashew) plant with a succulent pseudofruit, is characteristic of the tropical region of Brazil, and has pharmacological activities proven by the anti-inflammatory, astringent and antitumoral effects. Anacardium microcarpum (cajuí), present in the Cerrado region of the Amazon and in the Northeast, Center-West and Southeast regions of Brazil, presents a small pseudofruit and in its secondary metabolism produces phenolics, compounds with anti-inflammatory, antioxidant and antimicrobial activities. The aims of this study were to evaluate the antimicrobial activity of leaf extracts of Anacardium occidentale (cashew) and Anacardium microcarpum (cajuí) against multiresistant bacteria, and its antioxidant actions in vitro and in IL-10 knockout mice. The results were divided into three articles, which are composed of a review of the antimicrobial and antioxidant actions of pequi (Caryocar brasiliense), cashew (Anacardium occidentale) and cajuí (Anacardium microcarpum) and two original articles, one with antioxidant and antimicrobial in vitro and another with in vivo oxidative stress assays. Article 1. Antioxidant and antimicrobial activities of crude extracts and fractions of cashew (Anacardium occidentale L.), cajuí (Anacardium microcarpum) and pequi (Caryocar brasiliense C). A systematic review. A systematic review of the works that presented results of tests with extracts of the parts of the vegetal species mentioned above was elaborated. The databases Pubmed / Medline, Virtual Health Library (Lilacs and Scielo) and Science Direct were analyzed. Of a total of 425 articles, 32 were included, being 19 studies with Anacardium occidentale, 3 with Anacardium microcarpum and 10 with Caryocar brasiliense. The most used in vitro antioxidant capacity evaluation technique was DPPH and the most used microbiological capacity evaluation technique was the minimum inhibitory concentration and disk diffusion. Many articles were not found due to the limitations of the database search. Most of the tests described demonstrated potentially positive results to the antioxidant and antimicrobial actions when using the species studied. The results provide important data and perspectives for the use of natural products that can contribute to the treatment of various diseases, especially non-communicable diseases (NCD). Article 2. Phytochemical characterization, antimicrobial and antioxidant activities of Anacardium occidentale L and Anacardium microcarpum leaves, in vitro. Ethanolic extracts of A. occidentale L and A. microcarpum were prepared from crunched dry leaves for use in the trials. The DPPH and ABTS methodologies were used to evaluate the antioxidant power in vitro. Thin-layer chromatography was the technique of choice for phytochemical prospecting and HPLC (high performance liquid chromatography) to verify the presence of anacardic acids. The phenolics and total flavonoids of the extracts were quantified by spectrophotometry and linear regression. For the microbiological tests, the minimum inhibitory concentration in 96 microplates from hospital originated multiresistant strains was used. The ethanolic extracts of Anacardium occidentale and Anacardium microcarpum showed capture of similar DPPH and ABTS radicals and 2.34 and 1.64 mg GAE (galic acid equivalents) of total phenolics and total flavonoid values of 0.34 and 0, 29 mg RE (routine equivalents), respectively. The phytochemical prospection showed the presence of flavonoids, tannins, saponins, essential oils and triterpenes. The presence of the secondary flavonoid metabolites and tannins may favor the digestion of nutrients, the organic functioning of the body, activate the antioxidant capacity and modify the synthesis of eicosanoids, with anti-inflammatory response. A. microcarpum was the extract with the lowest minimum inhibitory concentration, with a value of 0.78 mg / mL in S. aureus strains. The ethanolic extracts of the leaves presented microbicidal and antioxidant capacity in vitro, which leads us to believe that they are potential products for the elaboration of a phytotherapeutic medicine. However, more studies are fundamental to uncover the gaps still existing in the knowledge about these plants. Article 3. Antioxidant activity of Anacardium occidentale D. and Anacardium microcarpum L. leaves in interleukin-10 knockout mice. For the tests, interleukin-10 knockout mice were used, divided into six groups (control, with injury and treated): control; paracetamol; paracetamol + Anacardium occidentale; paracetamol + Anacardium microcarpum; Anacardium occidentale and Anacardium microcarpum. Retroorbital blood was collected for leukocyte count and serum was separated for analysis of the biochemical profile of alanine aminotransferase (ALT), aspartate transferase (AST), gamma glutamyl transferase (GGT), alkaline phosphatase (FA), total cholesterol and triglycerides. Liver maceration was used for the analysis of oxidative stress from the malondialdehyde (MDA), catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), glutathione and carbonylated protein assays. The histopathological analysis of the liver was performed, observing the changes in the tissue in each group, analyzing the presence or absence of changes in the cytoplasm and nucleus; steatosis; inflammatory infiltrate and cholestasis. Oxidative stress in liver maceration showed better results in mice treated with Anacardium microcarpum in most of the enzymes. The result of the carbonylated protein with a value of 33.17 nmol / mg of the paracetamol group and 13.03 nmol/mg was also highlighted. The mice treated with the two extracts, without paracetamol injury and treated with A. microcarpum after injury, presented significant results for SOD and CAT, demonstrating efficiency in the elimination of reactive oxygen species. In the histopathological analysis of the liver, the mice treated with the two extracts presented reduction in the inflammatory infiltrate and cholestasis, demonstrating a decrease in the inflammatory process after the injury by paracetamol. The results confirm the hypothesis of antioxidant activity of the leaves of Anacardium occidentale and Anacardium microcarpum, which suggests, from more detailed studies, the use of leaves to develop a phytotherapeutic agent.