Orientador : Prof. Dr. Wesley Maurício de Souza / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 13/03/2015 / Inclui referências : fls. 63-69 / Área de concentração: Análises clínicas / Resumo: A Doença Renal Crônica (DRC) atinge todas as faixas etárias e atualmente é considerada um problema de saúde pública, devido ao constante aumento de sua incidência. O acúmulo de substâncias orgânicas, devido ao comprometimento da excreção renal, ocasiona diversos efeitos deletérios como a inflamação, a progressão da aterosclerose e consequente doença cardiovascular, principal causa de morte nesses pacientes. O p-cresol (PC) e seu conjugado p-cresilsulfato (PCS) são toxinas urêmicas que se ligam a proteínas plasmáticas e por isso não são facilmente dialisadas. A presença de tais toxinas pode desencadear a produção de várias moléculas pró-inflamatórias, como a quimiocina monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), primordial nos eventos que precedem a aterosclerose. OAT 1 e OAT 3 (do inglês, organic anion transporter) são transportadores reconhecidamente importantes na excreção renal de xenobióticos através da secreção tubular. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi a investigação in vitro da influência do PC e PCS na produção de MCP-1 e na expressão destes transportadores em células endoteliais humanas. Como modelo experimental foram utilizadas células da linhagem EA.hy926, cultivadas em meio DMEM suplementado com soro fetal bovino (SFB) e antimicrobianos. As células foram submetidas a ensaios com as toxinas nas concentrações normal, urêmica e urêmica máxima, sugeridas pelo European Uremic Toxins Work Group (EUTox). As dosagens de MCP-1 foram realizadas através do ensaio de ELISA direto em sobrenadantes de cultura coletados 0, 3 e 6 horas após os tratamentos. A expressão de OAT 1 OAT 3 foi avaliada através da técnica de Dot Blot, realizada com extratos proteicos de células tratadas com PC e PCS. Estes ensaios foram realizados na presença e ausência do inibidor de transportadores de ânions orgânicos, o Probenecida (Pb). Os resultados obtidos demonstram que a produção de MCP-1 respondeu aos tratamentos de forma dose e tempo dependente, obtendo picos de produção no tempo 6h, na concentração máxima urêmica do PC (646 pg/mL) e na concentração urêmica do PCS (435 pg/mL). No tempo 0h, o Pb suprimiu a produção de MCP-1 consideravelmente em todos os tratamentos, com taxas de inibição de 71%, 66% e 71% nos tratamentos com PC e 58%, 56% e 60% nos tratamentos com PCS na concentração normal, urêmica e urêmica máxima, respectivamente. No tempo 6h foi observada uma taxa de inibição de 37% e 32% nos tratamentos com PC e 36% e 46% nos tratamentos com PCS na concentração urêmica e urêmica máxima, respectivamente. A expressão de OAT 1 nos tratamentos controle, PC e PCS nas concentrações máximas urêmicas foi suprimida por Pb com taxa de inibição de 30%, 23% e 12%, respectivamente. A expressão de OAT 3 nos tratamentos controle, PC e PCS foi suprimida por Pb com taxa de inibição de 45%, 2% e 32%, respectivamente. Como conclusão, os dados obtidos no presente trabalho sugerem que, em células endoteliais humanas, o OAT1 se expressa duas vezes mais que OAT 3. E que, considerando-se a resposta celular relacionada à produção de MCP-1, o OAT 1 tem preferência pelo PC como substrato, enquanto o OAT 3 tem mais afinidade pelo PCS. Palavras chave: doença renal crônica; toxicidade urêmica; p-cresol; p-cresilsulfato; OAT 1; OAT 3; Probenecida; MCP-1. / Abstract: Chronic Kidney Disease (CKD) affects all age and is currently considered a public health problem, due to the constant increase in incidence. The accumulation of organic substances due to the impairment of renal excretion causes many deleterious effects such as inflammation, progression of atherosclerosis and subsequent cardiovascular disease, the mainly cause of death in CKD patients. p-cresol (PC) and its conjugate pcresilsulfato (PCS) are uremic toxins difficult to eliminate by conventional dialysis due to strong bind to plasma proteins. The high presence of such toxins can trigger the production of various proinflammatory molecules such as chemokine monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), which is overriding in the events preceding atherosclerosis. OAT1 and OAT3 (organic anion transporter) are known to be important carriers in the renal excretion of xenobiotics by tubular secretion. Thus, the objective of this study was the in vitro investigation of the PC and PCS influence on the production of MCP-1 and expression of these transporters and on human endothelial cells. As an experimental model, we used the human endothelial cell line EA.hy926 cultured in DMEM supplemented with fetal bovine serum (FBS) and antibiotics. The cells were subjected to tests with the toxins in normal, uremic and maximum uremic concentrations, suggested by the European Uremic Toxins Work Group (EuTox). The levels of MCP-1 were evaluated in culture supernatants collected 0, 3 and 6 hours after treatment through ELISA. The expression of OAT 1 and OAT 3 was evaluated through Dot Blot, performed with protein extracts from cells treated with PC and PCS. These assays were performed in the presence and absence of the organic anion transporters inhibitor Probenecid (Pb). The results shown that the secretion of MCP-1 responded to the treatment in a dose and time dependent pattern, resulting in production peaks at 6h in PC maximum uremic concentration (646 pg/ml) and PCS uremic concentration (435 pg / ml). At 0h, Pb suppressed the production of MCP-1 significantly in all treatments, with inhibition rates of 71%, 66% and 71% in treatments with PC and 58%, 56% and 60% in treatments with PCS on the normal, uremic and maximum uremic concentrations, respectively. At 6h, an inhibition rate of 37% and 32% was observed in treatments with PC and 36% and 46% in treatments with PCS in uremic and maximum uremic concentration, respectively. The expression of the OAT 1 in the control, PC and PCS treatments under uremic maximum concentration was suppressed by Pb with a inhibition rate of 30%, 23% and 12%, respectively. The expression of the OAT 3 in the control, PC and PCS treatments under uremic maximum concentration was suppressed by Pb with a inhibition rate of 45%, 2% and 32%, respectively. As a conclusion, the data of the present study suggest that, in human endothelial cells, OAT1 is expressed two times more than OAT 3. And, considering the cell response related to the production of MCP-1, PC is the substrate for OAT 1 and OAT 3 has more affinity for PCS. Key-words: chronic kidney disease; uremic toxicity; p-cresol; p-cresilsulfate; OAT 1; OAT 3; Probenecid; MCP-1.

Orientadora : Profª. Drª. Iara José de Messias-Reason / Co-orientadora : Profª. Drª. Angelica B. Winter Boldt / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 23/02/2015 / Inclui referências / Área de concentração: Análises clínicas / Resumo: A hanseníase é causada pelo patógeno intracelular obrigatório Mycobacterium leprae, que infecta principalmente macrófagos e células Schwann do hospedeiro. A lectina ligante de manose (MBL) e as ficolinas (FCNs) reconhecem padrões de açúcares e resíduos acetilados (PAMP), respectivamente, em uma ampla variedade de patógenos, incluindo o M. leprae. Este reconhecimento desencadeia a transativação das serina-proteases 1 e 2, associadas a MBL (MASP-1 e MASP-2), e em seguida, a ativação da via das lectinas do sistema complemento. O gene MASP1 apresenta diversos polimorfismos que estão associados à modulação das concentrações de MASP-1 e de mais duas outras proteínas, resultantes de processamento alternativo do pré-mRNA: MASP-3 e a forma não-enzimática MAp44, ambas envolvidas na regulação negativa do sistema complemento, através da competição pelos sítios de ligação aos PAMP nas moléculas de reconhecimento. Neste estudo, avaliamos possível associação entre polimorfismos do gene MASP1 e concentrações séricas de MASP-1, MASP-3 e MAp44 em 389 indivíduos da população brasileira e 210 da dinamarqueses (segundo grupo controle), assim como com a susceptibilidade à hanseníase em 196 pacientes e 193 controles do Sul do Brasil. As amostras foram genotipadas por PCR sequência-específica multiplex para g.8113G>A (rs7609662) e g.8795C>T (rs13064994), localizados no intron 01, e g.61897C>G (rs72549262), g.62223C>T (rs1109452) e g.62224G>A (rs850314), localizados no exon 12 do gene MASP1. Os níveis séricos das proteínas foram quantificados com ensaio imunofluorimétrico cronometrado (TRIFMA). Pacientes com hanseníase apresentaram concentrações séricas de MASP-3 e MAp44 menores do que controles (medianas: 4603 ng/ml vs. 5606 ng/ml para MASP-3, p<0.005; 1732 vs. 2350 ng/ml para MAp44, p<0.0001). Pacientes com a forma lepromatosa de hanseníase também apresentaram concentrações reduzidas de MASP-3 e MAp44, quando comparados a não-lepromatosos (P=0,0016 e P<0,0001). Houve também uma associação entre a presença do alelo T para o SNP rs1109452 e níveis séricos elevados de MASP-1 e diminuídos de MASP-3 nos três diferentes grupos analisados. O haplótipo GC CCG se associou com a susceptibilidade à hanseníase (P=0,028, OR=1,43 [IC95%=1,04-1,94]). O haplótipo do exon 12 apresentou associação com os níveis de MASP-3 em controles (P=0,012) e no grupo comparação (P=0,0006), e os genótipos destas variantes também apresentaram associação com níveis de MAp44 em pacientes (P=0,023), e com os níveis de MASP-3 nos controles (P=0,024) e no grupo de dinamarqueses (P<0,0001). Concentrações baixas de MAp44 e MASP-3 em pacientes com hanseníase podem ser decorrentes de polimorfismos no gene MASP1. Este efeito pode estar aliado a possível consumo das proteínas no processo da doença e/ou baixa produção das mesmas nesses indivíduos. Palavras-chave: MASP1, MASP-3, MAp44, serina protease associada a MBL, complemento, via das lectinas, hanseníase. / Abstract: Leprosy is caused by the obligate intracellular pathogen Mycobacterium leprae, which infects mainly macrophages and Schwann cells of the host. The mannose-binding lectin (MBL) and Ficolins (FCNs) recognize sugar patterns and acetylated molecules (PAMP) respectively in a wide range of pathogens including M. leprae. This recognition triggers the transactivation of mannan-binding lectin serine protease 1 and 2 (MASP-1 e MASP-2) followed by the activation of complement system lectin pathway. MASP1 gene presents several polymorphisms associated to the modulation of MASP-1 concentration as well as two other proteins resulting from alternative processing of pre-mRNA: MASP-3 and the non-enzimatic MAp44, both involved in the down-regulation of complement system by competing for PAMP binding sites at the recognition molecules. Here, we aimed to assess possible associations between MASP1 gene polymorphisms and the serum levels of MASP-1, MASP-3 and MAp44 in 389 individuals from Brazil and 210 from Denmark (second control group), as well as with susceptibility to Leprosy in 196 patients and 193 control subjects from South Brazil. Samples were genotyped by multiplex sequence-specific PCR for g.8113G>A (rs7609662) and g.8795C>T (rs13064994) located in intron 01 and g.61897C>G (rs72549262), g.62223C>T (rs1109452) and g.62224G>A (rs850314) located in exon 12 of MASP1 gene. Protein serum levels were quantified by time-resolved immunofluorometric assays (TRIFMA). Leprosy patients presented lower MASP-3 and MAp44 serum levels (median: 4603 ng/ml vs. 5606 ng/ml for MASP-3, p<0.005; 1732 vs. 2350 ng/ml for MAp44, p<0.0001). Patients presenting the lepromatous clinical form of Leprosy also showed lower MASP-3 and MAp44 serum levels when compared to non-lepromatous patients (P=0.0016 and P<0.0001). There was an association between the T allele of rs1109452 with higher MASP-1 and lower MASP-3 serum levels in all three groups. The GC CCG haplotype was related to susceptibility to Leprosy (P=0.028, OR=1.43 [CI95%=1.04-1.94]). The exon 12 haplotype distribution is associated to MASP-3 levels in controls (P=0.012) and Danish (P=0.0006), and the genotypes of this variants, also revealed an association with MAp44 levels in patients (P=0.023), with MASP-3 levels in controls (P=0.024) and MASP-3 levels in the Danish cohort group (P<0,0001). Low MASP-3 and MAp44 serum levels in leprosy may be conferred by haplotypes/genotypes of MASP1 gene in addition to possible protein consumption and/or low production in leprosy patients. Key-words: MASP1, MASP-3, MAp44, MBL-associated serine-protease, complement, lectin pathway, leprosy.

Resumo: Infecções do trato urinário (ITU) são muito frequentes, perdendo apenas para as respiratórias. Este trabalho determinou a incidência de bactérias causadoras de ITU em pacientes de Curitiba e realizou análise de grupos filogenéticos e fatores de virulência em 313 estirpes de Escherichia coli, o principal patógeno urinário. Pacientes foram divididos em classes levando-se em conta características que influenciam aquisição e desenvolvimento de ITU: mulheres abaixo de 14 anos, de 14-47 anos (idade fértil), gestantes, mulheres acima de 47 anos (climatério), diabéticas e homens. No geral, a bactéria Escherichia coli se confirmou como bactéria mais prevalente (54,7%), seguida por Streptococcus agalactiae (18,8%), Proteus mirabilis (5,6%), Enterococcus spp (5,2%), Staphylococcus spp (4,8%) e Klebsiella spp (3,9%). Houve diferença significativa na distribuição das bactérias entre as classes de pacientes. Com relação à filogenia de E. coli, o grupo D foi o que mais ocorreu, seguido pelos grupos A, B2 e B1 respectivamente. Entre os homens, porém, o grupo B2 foi mais frequente, e as diabéticas apresentaram distribuição diferente do restante das mulheres. Os fatores de virulência que mais ocorreram foram traT e aer, seguidos de PAICFT073I, hemólise em ágar sangue, sfa, pap, cnf1, afa, formação de cápsula e hly. A ocorrência do gene aer foi significativamente maior entre as mulheres menores de 14 anos. Os grupos filogenéticos B2 e D apresentaram mais fatores de virulência que os grupos A e B1. Foram avaliadas as contagens de bactérias e de leucócitos do exame parcial de urina, sendo que as mulheres de 14-47 anos, independente de gestação, apresentaram mais bactérias que os demais. Mulheres abaixo de 14 anos e homens tiveram maior quantidade de leucócitos. O antibiograma também foi analisado: quinolonas apresentaram maior resistência entre os pacientes mais idosos. Na análise por grupos filogenéticos, B2 mostrou maior sensibilidade às quinolonas em relação aos outros grupos.

Poucos estudos quantificam o risco relativo da saúde humana na transmissão spillover de doenças zoonóticas de populações de animais silvestres, estudos cruciais na compreensão da história natural das zoonoses. Coccídios, em particular os da família Sarcocystidae, são importantes agentes transmissíveis na interface homens - animais domésticos e silvestres. O diagnóstico da coccidiose é prejudicado pela limitada disponibilidade de amostras resultantes de populações animais de espécies em risco de extinção. O objetivo deste estudo foi detectar através da amplificação do locus ITS-1, protozoários das subfamílias Sarcocystinae e Toxoplasmatinae em amostras teciduais de Puma yagouaroundi, Leopardus geoffroyi, L. tigrinus, L. wiedii, L. colocolo e L. pardalis, depositados em coleções biológicas do Rio Grande do Sul, Brasil. Um objetivo adicional foi a obtenção de informações que permitissem avaliar o papel epidemiológico dos protozoários no ciclo silvestre dos parasitas e seu possível impacto sobre as populações de animais silvestres e na saúde pública. Noventa pequenos felídeos neotropicais de vida livre, representando seis espécies, foram amostrados. Destes, 31 felídeos (34,4%), de todas as seis espécies, foram positivos para Toxoplasma gondii e DNA foi detectado em 63 das 433 (14,6%) amostras de tecidos primários coletados a partir de língua (28,6%), cérebro (18,6%), músculo esquelético (17,1%), musculatura ocular (13,6%), globo ocular (13,6%), coração (11,1%), diafragma (5,4%) e humor vítreo (4,5%). Doze amostras primárias positivas ao T. gondii foram genotipadas com os marcadores moleculares SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22- 8, c29-2, L358, PK1, Apico e CS3 e a técnica multilocus PCR-RFLP, a amostra Py#36m foi totalmente caracterizada como do tipo I com alelo II no BTUB e um novo genótipo atípico Py#21M, ambos isolados de Puma yagouaroundi e nunca descrito no Brasil. Nove outras amostras tiveram caracterização parcial. Treze dos 90 felídeos foram positivos para Sarcocystis spp. (14,4%) e outros 18 felídeos, representando cinco espécies albergaram S. felis-like [Py (#75m, #83m, #35m, #20li, #55li), Lg (#80m, #70m, #88m, #71li, #67mOi), Lt (#19m, #48m, #89m, #84m), Lw (#12, #73d) e Lc (#82m, #76m)]. Um único felino de L. pardalis foi negativo. DNA do parasita foi detectado em 11,8% dos tecidos examinados (51/433): musculatura esquelética (26,5%), língua (23,2%), musculatura ocular (13,6%), diafragma (10,7%), cérebro (2,3%), coração (1,6%) e globo ocular (4,5%), nenhuma das 44 amostras de humor vítreo foi positiva. Esta é a primeira detecção e caracterização genética de T. gondii e de S. felislike em felídeos silvestres brasileiros de vida livre, demonstrando a presença destes agentes no ciclo silvestre e, a potencial transmissibilidade ao homem e a outros animais domésticos e silvestres. O uso de amostras de tecidos de animais silvestres depositados em coleções biológicas para estudos epidemiológicos de doenças monstraram serem de grande utilidade. / Few studies have quantified the relative risk of human health from spillover of zoonotic diseases from populations of wild animals; these studies are crucial for understanding the natural history of zoonoses. Coccidia, particularly from the family Sarcocystidae, are important transmissible agents at the interface of man and domestic and wild animals. The diagnosis of Coccidiosis is hampered by the limited availability of samples resulting from protection of natural populations of the species at risk of extinction. The aim of this study was to detected, by amplification of ITS-1 locus, protozoa from the subfamilies Sarcocystinae and Toxoplasmatinae in tissue samples from Puma yagouaroundi, Leopardus geoffroyi, L. tigrinus, L. wiedii, L. colocolo and L. pardalis, deposited in biological collections of the State of Rio Grande do Sul, Brazil. An additional aim was to obtain information that would enable assessment of the epidemiological role of the protozoa in the sylvatic cycle of the parasite, and its possible impact on wildlife populations and public health. Ninety free-living small wild felines, representing 6 species, were sampled. Of these, 31 felids (34.4%) of all six species were positive for T. gondii and DNA was detected in 63 of 433 (14.6%) primary tissue samples collected from the tongue (28.6%), brain (18.6%), skeletal muscle (17.1%), ocular muscles (13.6%), eye (13.6%), heart (11.1%), diaphragm (5.4%) and vitreous humor (4.5%). Twelve primary samples positive for T. gondii were genotyped with molecular markers SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1, and apical CS3. Using the multilocus PCR-RFLP technique, sample Py#36m was fully genotyped as Type I with allele II in locus BTUB, and a new atypical Py#21M, both isolates from Puma yagouaroundi and never described in Brazil. Nine other samples had a partial characterization. Thirteen of the 90 felids were positive for Sarcocystis spp. (14.4%) and another 18 felids, representing 5 species, harbored S. felis-like organisms [Py (#75m, #83m, #35m, #20li, #55li), Lg (#80m, #70m, #88m, #71li, #67mOi), Lt (#19m, #48m, #89m, #84m), Lw (#12, #73d) and Lc (#82m, #76m)]. A single felid of L. pardalis was negative. Parasite DNA was detected in 11.8% (51/433) of the tissues examined: muscle skeletal (26.5%), tongue (23.2%), ocular muscles (13.6%), diaphragm (10.7 %), brain (2.3%), heart (1.6%) and eye (4.5%); none of the 44 samples of vitreous humor was positive. This is the first description of the detection and genetic characterization of T. gondii and S. felis-like in free-living Brazilians wild felids, demonstrating the presence of these agents in the sylvatic cycle, and the potential transmition to humans and other domestic and wild animals. The use of tissue samples from wild animals deposited in biological collections for epidemiological studies of diseases demonstrated to be of great utility.

Poucos estudos quantificam o risco relativo da saúde humana na transmissão spillover de doenças zoonóticas de populações de animais silvestres, estudos cruciais na compreensão da história natural das zoonoses. Coccídios, em particular os da família Sarcocystidae, são importantes agentes transmissíveis na interface homens - animais domésticos e silvestres. O diagnóstico da coccidiose é prejudicado pela limitada disponibilidade de amostras resultantes de populações animais de espécies em risco de extinção. O objetivo deste estudo foi detectar através da amplificação do locus ITS-1, protozoários das subfamílias Sarcocystinae e Toxoplasmatinae em amostras teciduais de Puma yagouaroundi, Leopardus geoffroyi, L. tigrinus, L. wiedii, L. colocolo e L. pardalis, depositados em coleções biológicas do Rio Grande do Sul, Brasil. Um objetivo adicional foi a obtenção de informações que permitissem avaliar o papel epidemiológico dos protozoários no ciclo silvestre dos parasitas e seu possível impacto sobre as populações de animais silvestres e na saúde pública. Noventa pequenos felídeos neotropicais de vida livre, representando seis espécies, foram amostrados. Destes, 31 felídeos (34,4%), de todas as seis espécies, foram positivos para Toxoplasma gondii e DNA foi detectado em 63 das 433 (14,6%) amostras de tecidos primários coletados a partir de língua (28,6%), cérebro (18,6%), músculo esquelético (17,1%), musculatura ocular (13,6%), globo ocular (13,6%), coração (11,1%), diafragma (5,4%) e humor vítreo (4,5%). Doze amostras primárias positivas ao T. gondii foram genotipadas com os marcadores moleculares SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22- 8, c29-2, L358, PK1, Apico e CS3 e a técnica multilocus PCR-RFLP, a amostra Py#36m foi totalmente caracterizada como do tipo I com alelo II no BTUB e um novo genótipo atípico Py#21M, ambos isolados de Puma yagouaroundi e nunca descrito no Brasil. Nove outras amostras tiveram caracterização parcial. Treze dos 90 felídeos foram positivos para Sarcocystis spp. (14,4%) e outros 18 felídeos, representando cinco espécies albergaram S. felis-like [Py (#75m, #83m, #35m, #20li, #55li), Lg (#80m, #70m, #88m, #71li, #67mOi), Lt (#19m, #48m, #89m, #84m), Lw (#12, #73d) e Lc (#82m, #76m)]. Um único felino de L. pardalis foi negativo. DNA do parasita foi detectado em 11,8% dos tecidos examinados (51/433): musculatura esquelética (26,5%), língua (23,2%), musculatura ocular (13,6%), diafragma (10,7%), cérebro (2,3%), coração (1,6%) e globo ocular (4,5%), nenhuma das 44 amostras de humor vítreo foi positiva. Esta é a primeira detecção e caracterização genética de T. gondii e de S. felislike em felídeos silvestres brasileiros de vida livre, demonstrando a presença destes agentes no ciclo silvestre e, a potencial transmissibilidade ao homem e a outros animais domésticos e silvestres. O uso de amostras de tecidos de animais silvestres depositados em coleções biológicas para estudos epidemiológicos de doenças monstraram serem de grande utilidade. / Few studies have quantified the relative risk of human health from spillover of zoonotic diseases from populations of wild animals; these studies are crucial for understanding the natural history of zoonoses. Coccidia, particularly from the family Sarcocystidae, are important transmissible agents at the interface of man and domestic and wild animals. The diagnosis of Coccidiosis is hampered by the limited availability of samples resulting from protection of natural populations of the species at risk of extinction. The aim of this study was to detected, by amplification of ITS-1 locus, protozoa from the subfamilies Sarcocystinae and Toxoplasmatinae in tissue samples from Puma yagouaroundi, Leopardus geoffroyi, L. tigrinus, L. wiedii, L. colocolo and L. pardalis, deposited in biological collections of the State of Rio Grande do Sul, Brazil. An additional aim was to obtain information that would enable assessment of the epidemiological role of the protozoa in the sylvatic cycle of the parasite, and its possible impact on wildlife populations and public health. Ninety free-living small wild felines, representing 6 species, were sampled. Of these, 31 felids (34.4%) of all six species were positive for T. gondii and DNA was detected in 63 of 433 (14.6%) primary tissue samples collected from the tongue (28.6%), brain (18.6%), skeletal muscle (17.1%), ocular muscles (13.6%), eye (13.6%), heart (11.1%), diaphragm (5.4%) and vitreous humor (4.5%). Twelve primary samples positive for T. gondii were genotyped with molecular markers SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1, and apical CS3. Using the multilocus PCR-RFLP technique, sample Py#36m was fully genotyped as Type I with allele II in locus BTUB, and a new atypical Py#21M, both isolates from Puma yagouaroundi and never described in Brazil. Nine other samples had a partial characterization. Thirteen of the 90 felids were positive for Sarcocystis spp. (14.4%) and another 18 felids, representing 5 species, harbored S. felis-like organisms [Py (#75m, #83m, #35m, #20li, #55li), Lg (#80m, #70m, #88m, #71li, #67mOi), Lt (#19m, #48m, #89m, #84m), Lw (#12, #73d) and Lc (#82m, #76m)]. A single felid of L. pardalis was negative. Parasite DNA was detected in 11.8% (51/433) of the tissues examined: muscle skeletal (26.5%), tongue (23.2%), ocular muscles (13.6%), diaphragm (10.7 %), brain (2.3%), heart (1.6%) and eye (4.5%); none of the 44 samples of vitreous humor was positive. This is the first description of the detection and genetic characterization of T. gondii and S. felis-like in free-living Brazilians wild felids, demonstrating the presence of these agents in the sylvatic cycle, and the potential transmition to humans and other domestic and wild animals. The use of tissue samples from wild animals deposited in biological collections for epidemiological studies of diseases demonstrated to be of great utility.

Poucos estudos quantificam o risco relativo da saúde humana na transmissão spillover de doenças zoonóticas de populações de animais silvestres, estudos cruciais na compreensão da história natural das zoonoses. Coccídios, em particular os da família Sarcocystidae, são importantes agentes transmissíveis na interface homens - animais domésticos e silvestres. O diagnóstico da coccidiose é prejudicado pela limitada disponibilidade de amostras resultantes de populações animais de espécies em risco de extinção. O objetivo deste estudo foi detectar através da amplificação do locus ITS-1, protozoários das subfamílias Sarcocystinae e Toxoplasmatinae em amostras teciduais de Puma yagouaroundi, Leopardus geoffroyi, L. tigrinus, L. wiedii, L. colocolo e L. pardalis, depositados em coleções biológicas do Rio Grande do Sul, Brasil. Um objetivo adicional foi a obtenção de informações que permitissem avaliar o papel epidemiológico dos protozoários no ciclo silvestre dos parasitas e seu possível impacto sobre as populações de animais silvestres e na saúde pública. Noventa pequenos felídeos neotropicais de vida livre, representando seis espécies, foram amostrados. Destes, 31 felídeos (34,4%), de todas as seis espécies, foram positivos para Toxoplasma gondii e DNA foi detectado em 63 das 433 (14,6%) amostras de tecidos primários coletados a partir de língua (28,6%), cérebro (18,6%), músculo esquelético (17,1%), musculatura ocular (13,6%), globo ocular (13,6%), coração (11,1%), diafragma (5,4%) e humor vítreo (4,5%). Doze amostras primárias positivas ao T. gondii foram genotipadas com os marcadores moleculares SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22- 8, c29-2, L358, PK1, Apico e CS3 e a técnica multilocus PCR-RFLP, a amostra Py#36m foi totalmente caracterizada como do tipo I com alelo II no BTUB e um novo genótipo atípico Py#21M, ambos isolados de Puma yagouaroundi e nunca descrito no Brasil. Nove outras amostras tiveram caracterização parcial. Treze dos 90 felídeos foram positivos para Sarcocystis spp. (14,4%) e outros 18 felídeos, representando cinco espécies albergaram S. felis-like [Py (#75m, #83m, #35m, #20li, #55li), Lg (#80m, #70m, #88m, #71li, #67mOi), Lt (#19m, #48m, #89m, #84m), Lw (#12, #73d) e Lc (#82m, #76m)]. Um único felino de L. pardalis foi negativo. DNA do parasita foi detectado em 11,8% dos tecidos examinados (51/433): musculatura esquelética (26,5%), língua (23,2%), musculatura ocular (13,6%), diafragma (10,7%), cérebro (2,3%), coração (1,6%) e globo ocular (4,5%), nenhuma das 44 amostras de humor vítreo foi positiva. Esta é a primeira detecção e caracterização genética de T. gondii e de S. felislike em felídeos silvestres brasileiros de vida livre, demonstrando a presença destes agentes no ciclo silvestre e, a potencial transmissibilidade ao homem e a outros animais domésticos e silvestres. O uso de amostras de tecidos de animais silvestres depositados em coleções biológicas para estudos epidemiológicos de doenças monstraram serem de grande utilidade. / Few studies have quantified the relative risk of human health from spillover of zoonotic diseases from populations of wild animals; these studies are crucial for understanding the natural history of zoonoses. Coccidia, particularly from the family Sarcocystidae, are important transmissible agents at the interface of man and domestic and wild animals. The diagnosis of Coccidiosis is hampered by the limited availability of samples resulting from protection of natural populations of the species at risk of extinction. The aim of this study was to detected, by amplification of ITS-1 locus, protozoa from the subfamilies Sarcocystinae and Toxoplasmatinae in tissue samples from Puma yagouaroundi, Leopardus geoffroyi, L. tigrinus, L. wiedii, L. colocolo and L. pardalis, deposited in biological collections of the State of Rio Grande do Sul, Brazil. An additional aim was to obtain information that would enable assessment of the epidemiological role of the protozoa in the sylvatic cycle of the parasite, and its possible impact on wildlife populations and public health. Ninety free-living small wild felines, representing 6 species, were sampled. Of these, 31 felids (34.4%) of all six species were positive for T. gondii and DNA was detected in 63 of 433 (14.6%) primary tissue samples collected from the tongue (28.6%), brain (18.6%), skeletal muscle (17.1%), ocular muscles (13.6%), eye (13.6%), heart (11.1%), diaphragm (5.4%) and vitreous humor (4.5%). Twelve primary samples positive for T. gondii were genotyped with molecular markers SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1, and apical CS3. Using the multilocus PCR-RFLP technique, sample Py#36m was fully genotyped as Type I with allele II in locus BTUB, and a new atypical Py#21M, both isolates from Puma yagouaroundi and never described in Brazil. Nine other samples had a partial characterization. Thirteen of the 90 felids were positive for Sarcocystis spp. (14.4%) and another 18 felids, representing 5 species, harbored S. felis-like organisms [Py (#75m, #83m, #35m, #20li, #55li), Lg (#80m, #70m, #88m, #71li, #67mOi), Lt (#19m, #48m, #89m, #84m), Lw (#12, #73d) and Lc (#82m, #76m)]. A single felid of L. pardalis was negative. Parasite DNA was detected in 11.8% (51/433) of the tissues examined: muscle skeletal (26.5%), tongue (23.2%), ocular muscles (13.6%), diaphragm (10.7 %), brain (2.3%), heart (1.6%) and eye (4.5%); none of the 44 samples of vitreous humor was positive. This is the first description of the detection and genetic characterization of T. gondii and S. felis-like in free-living Brazilians wild felids, demonstrating the presence of these agents in the sylvatic cycle, and the potential transmition to humans and other domestic and wild animals. The use of tissue samples from wild animals deposited in biological collections for epidemiological studies of diseases demonstrated to be of great utility.