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Preparação e caracterização de novos anfifílicos funcionalizados com (oligo-e polissacarídeos)Dal-bó, Alexandre Gonçalves 26 October 2012 (has links)
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Quimica, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T04:20:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1
290976.pdf: 10985219 bytes, checksum: 013ea0fd7381604fa7d77978b9097528 (MD5) / Esta tese relata a preparação e caracterização de novos anfifílicos do tipo rod-coil funcionalizados com (oligo-e polissacarídeos) por reações do tipo cicloadição 1,3-dipolar de Huisgen, entre espécies funcionalizadas por um grupamento azida, de um lado, e um alcino terminal do outro catalisadas por cobre. Os anfifílicos foram sintetizados e caracterizados a partir de diferentes partes hidrofóbicas conjugados com o polímero poli(óxido etileno) PEO como braço espaçador hidrofílico e os (oligo-e polissacarídeos) 2-propargil-2-acetamido-2-desoxi-?-D-glicopiranose (GlcNAc) e propargil ?-D-galactopiranosil-(1 4)-?-D-glicopiranose (Lac). A caracterização dos anfifílicos sintetizados foram quanto à estrutura química e composição através de ressonância magnética nuclear (RMN), infravermelho por transformada de Fourier (FTIR), espectrometria de massa (MALDI-TOF-MS e ESI-MS) e alta resolução (HRMS). Após a dissolução em água, os anfifílicos auto-associam em micelas com um diâmetro médio de (2RH ~ 10 nm). Espalhamento de luz dinâmico (DLS), microscopia eletrônica de transmissão (MET) e espalhamentos de raios-X a baixos ângulos (SAXS) foram utilizados para investigar a estrutura e dinâmica desses anfifílicos sacarídicos. A presença de epítopos de carboidratos na superfície das micelas determinada para a segmentação da lectina também foram demonstrados por DLS. Interações específicas dos resíduos GlcNAc e Lac com as lectinas da aglutinina de germe de trigo (WGA) e aglutinina do amendoim (PNA), respectivamente, revela o potencial das aplicações, de tais anfifílicos derivados de carboidratos como sistemas de vetorização simples e específica do local para entrega da droga..
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Estudo da agregação de copolímeros anfifílicos de poliestireno e Poli[5-(N,N-Dialquilamino) Isopreno]Riegel, Izabel Cristina January 2002 (has links)
As propriedades em solução e a auto-associação de copolímeros em bloco de estireno e 5- (N,N-dialquilamino)isopreno foram estudados. Copolímeros di e tribloco são formados por um longo bloco de poliestireno, com um ou dois blocos menores de poli[5-(N,Ndialquilamino) isopreno] em uma ou ambas as extremidades. A polaridade do solvente é determinante na afinidade deste com um ou ambos blocos constituintes do polímero e, conseqüentemente, afetará as propriedades dinâmicas e estruturais do mesmo. Após a quaternização dos sistemas com dimetil sulfato, os agregados foram preparados pela prévia dissolução dos polímeros em um solvente orgânico e subsequente adição de água para induzir a agregação das cadeias insolúveis de PS. Solventes puros (DMF, THF e dioxano), bem como misturas de DMF e THF foram empregados como solvente comum. A concentração crítica de água (cwc) e as morfologias foram estudadas em função da natureza do solvente comum, da concentração inicial, arquitetura e massa molecular do copolímero, por espalhamento de luz estático e microscopia eletrônica de transmissão (MET), respectivamente. Determinou-se que tanto a cwc quanto as morfologias, são predominantemente influenciadas pela natureza do solvente comum. Alguns resultados inesperados foram encontrados para os copolímeros tribloco, incluindo a descoberta de uma nova morfologia formada a partir desse tipo de copolímero- a morfologia bowl-shape. Os agregados bowl-shaped, são essencialmente esferas bastante polidispersas, contendo um vazio alocado assimetricamente em seu interior. A fase contínua é composta de um arranjo de micelas inversas (núcleo de PAI e coroa de PS), sendo que as cadeias hidrofílicas de PAI circundam toda a estrutura na interface polímero/água. Acredita-se que a formação desta morfologia está sob controle cinético e não representa uma estrutura de equilíbrio. Foi proposto um possível mecanismo para a formação deste novo tipo de agregado.
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Estudo da agregação de copolímeros anfifílicos de poliestireno e Poli[5-(N,N-Dialquilamino) Isopreno]Riegel, Izabel Cristina January 2002 (has links)
As propriedades em solução e a auto-associação de copolímeros em bloco de estireno e 5- (N,N-dialquilamino)isopreno foram estudados. Copolímeros di e tribloco são formados por um longo bloco de poliestireno, com um ou dois blocos menores de poli[5-(N,Ndialquilamino) isopreno] em uma ou ambas as extremidades. A polaridade do solvente é determinante na afinidade deste com um ou ambos blocos constituintes do polímero e, conseqüentemente, afetará as propriedades dinâmicas e estruturais do mesmo. Após a quaternização dos sistemas com dimetil sulfato, os agregados foram preparados pela prévia dissolução dos polímeros em um solvente orgânico e subsequente adição de água para induzir a agregação das cadeias insolúveis de PS. Solventes puros (DMF, THF e dioxano), bem como misturas de DMF e THF foram empregados como solvente comum. A concentração crítica de água (cwc) e as morfologias foram estudadas em função da natureza do solvente comum, da concentração inicial, arquitetura e massa molecular do copolímero, por espalhamento de luz estático e microscopia eletrônica de transmissão (MET), respectivamente. Determinou-se que tanto a cwc quanto as morfologias, são predominantemente influenciadas pela natureza do solvente comum. Alguns resultados inesperados foram encontrados para os copolímeros tribloco, incluindo a descoberta de uma nova morfologia formada a partir desse tipo de copolímero- a morfologia bowl-shape. Os agregados bowl-shaped, são essencialmente esferas bastante polidispersas, contendo um vazio alocado assimetricamente em seu interior. A fase contínua é composta de um arranjo de micelas inversas (núcleo de PAI e coroa de PS), sendo que as cadeias hidrofílicas de PAI circundam toda a estrutura na interface polímero/água. Acredita-se que a formação desta morfologia está sob controle cinético e não representa uma estrutura de equilíbrio. Foi proposto um possível mecanismo para a formação deste novo tipo de agregado.
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Avaliação antimicrobiana de derivados anfifílicos de quitosana: estudo in vitro contra os fungos Alternaria solani, Alternaria alternata e Penicillium expansum / Antimicrobial Evaluation of Amphiphilic Derivatives of Chitosan: In vitro study against fungi Alternaria solani, Alternaria alternata and Penicillium expansumBarros, Tullio Henrique Cano de Haro 28 June 2018 (has links)
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barros_thch_me_sjrp.pdf.pdf: 1544265 bytes, checksum: a6f5f0bd88b4957b4f0ca22899ec9aae (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-13T17:48:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2018-06-28 / Este estudo teve como objetivo a síntese e caracterização de dietilaminoetilquitosana (QHdDEAE) e dodecil-dietilaminoetil-quitosana (QHdDEAEDOD) de baixa massa molar (Mw), para avaliar suas atividades antifúngicas contra os fungos Alternaria solani, Alternaria alternata e Penicilliun expansum, que provoca um grande impacto na produção e preservação de alimentos processados e minimamente processados. Os derivados de baixa massa molar (Mw) foram obtidos por reação de degradação de quitosana desacetilada com nitrito de sódio, seguido pela inserção de grupos DEAE e Dodecil na estrutura do polímero. O grau de desacetilação (DD) e de substituição (DS) por grupos dietilaminoetil (DEAE) e dodecil foram determinados usando ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN-H) e caracterizados por infravermelho (IR). O grau de desacetilação e o grau de substituição por grupos DEAE foram de 94,8% 39,8%, respectivamente. Os derivados hidrofóbicos obtidos foram substituídos com 15% e 39,8% de grupos dodecil, conforme determinado por RMN-H. As massas molares foram determinadas usando Cromatografia de Permeação em Gel (GPC) e um Mw de 9,2 kDa foi obtido para quitosana desacetilada degradada. Ensaios in vitro contra os fungos Alternaria alternata, Peninicillium expansum e Alternaria solani foram realizados. Na concentração de 0,5g.L-1, QHdDEAEDOD e QHdDEAE foram mais eficazes que as quitosanas comercial e desacetilada e apresentaram inibições de 80% contra Alternaria alternata e Alternaria solani. A quitosana deacetilada degradada foi mais eficiente na inibição do crescimento fúngico de Penicillium expansum e para 0,5 g.L-1 atingiu cerca de 80% de inibição. Todos os derivados apresentaram viabilidade celular superior a 70% em células 3T3, demonstrando uma boa citocompatibilidade e potencial para aplicações na conservação de alimentos / This study aimed at the synthesis and characterization of Diethylaminoethyl-Chitosan (QHdDEAE) and Dodecyl-Diethylaminoethyl-Chitosan (QHdDEAEDOD) of low molar mass(Mw), to evaluate their antifungal activities against the fungi Alternaria solani, Alternaria alternata and Penicilliun expansum, which causes a great impact on the production and preservation of processed and minimally processed foods. The low Mw derivatives were obtained by degradation reaction with sodium nitrite, followed by the insertion of DEAE and Dodecyl groups on the polymer backbone. The degrees of deacetylation (DD) and substitution (DS) for DEAE and Dodecyl groups were determined using nuclear magnetic resonance of hydrogen (¹H-NMR) and characterized by FTIR. The degree of deacetylation and degree of substitution by DEAE gropus were 94,8% 39,8%, respectively. The obtained hydrophobicized derivatives were substituted with 15% and 39,8% of dodecyl groups as evaluated by ¹H-NMR. The molar masses were determined by using Gel Permeation Chromatography (GPC) and a Mw of 9,2kDa was obtained for deacetylated chitosan. In vitro assays against the fungi Alternaria alternata, Peninicillium expansum and Alternaria solani. At the concentration of 0.5 g.L-1 both, QHdDEAEDOD and QHdDEAE were more effective than commercial and deacetylated chitosans and exhibited inhibitions of 80% against Alternaria alternata and Alternaria solani. Degraded deacetylated chitosan was more efficient in inhibiting the fungal growth of Penicillium expansum and for 0.5 g.L-1 reached around 80% of inhibition. All the derivatives presented cell viabilities higher 70% on 3T3 demonstrated a good cytocompatibility and potential for applications in food preservation.
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Estudo da agregação de copolímeros anfifílicos de poliestireno e Poli[5-(N,N-Dialquilamino) Isopreno]Riegel, Izabel Cristina January 2002 (has links)
As propriedades em solução e a auto-associação de copolímeros em bloco de estireno e 5- (N,N-dialquilamino)isopreno foram estudados. Copolímeros di e tribloco são formados por um longo bloco de poliestireno, com um ou dois blocos menores de poli[5-(N,Ndialquilamino) isopreno] em uma ou ambas as extremidades. A polaridade do solvente é determinante na afinidade deste com um ou ambos blocos constituintes do polímero e, conseqüentemente, afetará as propriedades dinâmicas e estruturais do mesmo. Após a quaternização dos sistemas com dimetil sulfato, os agregados foram preparados pela prévia dissolução dos polímeros em um solvente orgânico e subsequente adição de água para induzir a agregação das cadeias insolúveis de PS. Solventes puros (DMF, THF e dioxano), bem como misturas de DMF e THF foram empregados como solvente comum. A concentração crítica de água (cwc) e as morfologias foram estudadas em função da natureza do solvente comum, da concentração inicial, arquitetura e massa molecular do copolímero, por espalhamento de luz estático e microscopia eletrônica de transmissão (MET), respectivamente. Determinou-se que tanto a cwc quanto as morfologias, são predominantemente influenciadas pela natureza do solvente comum. Alguns resultados inesperados foram encontrados para os copolímeros tribloco, incluindo a descoberta de uma nova morfologia formada a partir desse tipo de copolímero- a morfologia bowl-shape. Os agregados bowl-shaped, são essencialmente esferas bastante polidispersas, contendo um vazio alocado assimetricamente em seu interior. A fase contínua é composta de um arranjo de micelas inversas (núcleo de PAI e coroa de PS), sendo que as cadeias hidrofílicas de PAI circundam toda a estrutura na interface polímero/água. Acredita-se que a formação desta morfologia está sob controle cinético e não representa uma estrutura de equilíbrio. Foi proposto um possível mecanismo para a formação deste novo tipo de agregado.
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Análogos fluorescentes de agentes anti-parasitários: interações com agregados anfifílicos / Fluorescent analogues of antiparasitic agents: interactions with amphiphilic aggregatesBerardi, Marina 26 August 2010 (has links)
Esse trabalho é sobre a agregação da droga leishmanicida miltefosina e um análogo fluorescente e sua interação com vesículas fosfolipídicas. A leishmaniose é uma doença tropical causada por diferentes espécies do gênero Leishmania que atinge boa parte do mundo e, nas duas últimas décadas, sua manifestação visceral reapareceu de forma preocupante, uma vez que sua letalidade vem aumentando de forma gradativa. Vários medicamentos estão sendo testados, incluindo o análogo lipídico sintético hexadecilfosfocolina (miltefosina), que é um agente antitumoral e antileishmania administrado oralmente que age nas membranas celulares e pode induzir apoptose. O primeiro local de interação dos análogos de fosfolipídios é a membrana celular e eles apresentam atividade citotóxica não específica em concentrações acima da sua concentração micelar crítica, sendo importante o conhecimento de suas propriedades de agregação em meio aquoso e sua forma de interação com outros agregados presentes no meio. Além disso, derivados fluorescentes da miltefosina permitem o uso de técnicas de fluorescência para a caracterização de sua atividade leishmanicida. Neste trabalho examinamos propriedades de agregação da miltefosina (MT) e de seu análogo fluorescente MT-BODIPY em meio aquoso, utilizando técnicas baseadas em medidas de tensão superficial e de espectroscopia de fluorescência, tanto estática como com resolução temporal. Os resultados de cmc da miltefosina, a 25oC utilizando diferentes métodos, foram 60M em meio aquoso puro (água Milli-Q), 50M em tampão fosfato 10mM (pH 7,4), e 35M em tampão fosfato com NaCl 150mM. Através do estudo de vários parâmetros de fluorescência, verificamos que para a MT-BODIPY, um limite superior para sua cmc é de 10M. Utilizando a sonda fluorescente amino-hexadecil-benzamida (Ahba) estudamos a interação entre a miltefosina e vesículas fosfolipídicas de DMPC e DPPC, analisando os espectros de absorção e emissão fluorescente, a anisotropia estática e os decaimentos da intensidade fluorescente e da anisotropia. O conjunto de resultados mostrou que os efeitos do acréscimo de miltefosina às vesículas, no intervalo de razões molares entre 1:100 e 5:100, não são monitorados pela sonda Ahba, uma sonda localizada na região das cabeças polares. Por outro lado, a análise da fluorescência intrínseca da MT-BODIPY mostrou que seu acréscimo, no mesmo intervalo de razões molares, promove desorganização da bicamada lipídica. Como nesse caso o grupo fluorescente localiza-se no final da cadeia alifática, concluimos que os maiores efeitos da miltefosina sobre as bicamadas ocorrem na região interna das cadeias apolares. / This work is about the aggregation of the leishmanicidal drug miltefosine and a fluorescent analogue and their interaction with phospholipid vesicles. Leishmaniasis is a complex of tropical diseases caused by different species of the genus Leishmania which reaches almost the whole world, including Brazil, and, on the last decades, its visceral form reappeared with hundreds of million people at risk of infection, and the mortality rate increases every year. Several drugs have been used to treat the disease, and miltefosine, a synthetic phospholipid analogue, has been tested and it is already used in some countries. This drug has a confirmed antitumor and orally antileishmanial action on the cell membranes, which is the first local of interaction of a phospholipid analogue. The cytotoxic activity is not specific on concentrations above its critical micelle concentration (cmc), and the knowledge of the aggregation properties of the drug in aqueous medium becomes important, as well as its interaction with other aggregates presents in the environment. Fluorescent analogues of miltefosine allow the use of fluorescent techniques to characterize the antileishmanial activity of miltefosine. In this work we have investigated the aggregation properties of the drug miltefosine (MT), and the fluorescent analogue MT-BODIPY in aqueous medium, by using techniques of surface tension measurements and both, steady-state and time-resolved fluorescence spectroscopy. The values of miltefosine cmc at 25°C from different methods were about 60M in pure aqueous medium (Milli-Q water), 50M in phosphate buffer 10mM (pH 7,4), and 35M in phosphate buffer with the addition of NaCl 150mM. The fluorescent probe amino-hexadecyl-benzamide (Ahba) was used to study the interaction of miltefosine with phospholipid vesicles of DMPC and DPPC, from absorption and fluorescent emission spectra, steady-state anisotropy and fluorescence and anisotropy decays. The results have shown that the effects of miltefosine addition in the vesicles, with molar ratios between 1:100 and 5:100, are not monittored by the probe Ahba, which is located on the polar head groups region on the bilayer. On the other hand, analysing the intrinsic fluorescence of the analogue MT-BODIPY, we concluded that when the molecule is added, in the same molar ratio intervals, there is a disorder in the lipidic bilayer. The fluorescent group BODIPY is located on the aliphatic chain of MT, therefore, the more accentuated effects of miltefosine in the bilayers occur in the region of the apolar tails.
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Desenvolvimento de vesículas poliméricas de poli(etileno glicol)-b-poli(ε-caprolactona) (PEG-PCL) para veiculação de L-asparaginase / Development of polyethylene glycol-polycaprolactone polymer vesicles for L-AsparaginaseVasconcelos, Juliana de Almeida Pachioni 21 June 2018 (has links)
A L-Asparaginase (ASNase) é um importante agente quimioterapêutico utilizado para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda (ALL) há mais de 40 anos. No entanto, devido à origem biológica da ASNase, enzima produzida por Escherichia coli, problemas como a imunogenicidade e baixa meia vida-plasmática devem ser considerados. Com o objetivo de minimizar essas desvantagens, várias ASNases homólogas bem como formulações de ASNase de E. coli foram investigadas. Nenhuma das formulações desenvolvidas, entretanto, foi capaz de resolver definitivamente esses problemas associados à sua origem. Nesse sentido, considerando os recentes avanços na ciência de polímeros com a possibilidade do obtenção de vesículas poliméricas usando copolímeros, este trabalho concentrou-se no desenvolvimento de polimerossomos de poli(etileno glicol)-b-poli(ε-caprolactona) (PEG-PCL) para encapsular a ASNase. Diversas condições experimentais foram investigadas e, ao final, os polimerossomos foram produzidos pela técnica de hidratação do filme polimérico utilizando a centrifugação como técnica de pós-filme para remoção de copolímero precipitado, produzindo assim vesículas polímericas de 120 a 200nm com PDI de aproximadamente 0,250. A eficiência de encapsulação da ASNase, utilizando as metodologias de centrifugação ou cromatografia de exclusão molecular, revelou taxas de encapsulação de 20-25% e 1 a 7%, repectivamente. Esses resultados apontam a importância de se determinar a eficiência de encapsulação por cromatografia de exclusão molecular ou método direto no caso de nanoestruturas auto-agregadas formadas por copolímeros, devido a valores superestimados com o emprego da centrifugação. Ainda que estudos complementares se façam necessários para liberação da enzima encapsulada ou penetração da L-asparagina nas vesículas, nossos resultados demonstram o potencial de polimerossomos para veiculação de ASNase, bem como de outras proteínas terapêuticas. / L-Asparaginase (ASNase) is an important chemotherapeutic agent used for the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) for more than 40 years. However, due to the biological origin of ASNase (produced by Escherichia coli) some drawbacks such as immunogenicity and low plasma half life are present. In order to minimize the disadvantages, several ASNases proteoforms and formulations of E. coli ASNase were investigated. However, none of this formulations completely solved the main drawbacks of ASNase. In this sense, considering the recents advances in polymers science with the possibility to develop polymeric vesicles using copolymers, this work aimed at the development of poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone) (PEG-PCL) vesicles to encapsulate ASNase. Different experimental conditions were investigated and, the final polymersomes formulation was prepared by film hydratation using centrifugation as a post-film technique to remove the bulky coplymer. Polymeric vesicles of 120 to 200nm with PDI of approximately, 0.250 were obtained. The encapsulation efficiency of ASNase was determined indirectly by centrifugation and directly by size exclusion chromatography, resulting in encapsulation rates of 20-25% and 1 to 7%, respectively. These results indicate the importance of determining the efficiency of encapsulation by size exclusion chromatography or direct method in the case of self-aggregated nanostructures formed by copolymers, due to values overestimated with the use of centrifugation. Our results point to the potential of polymersomes for ASNase delivery, as well as other therapeutic proteins. Nonetheless, complimentary studies are still necessary for ASNase release or L-asparagine penetration into the vesicles.
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Desenvolvimento e caracterização de polimerossomos para veiculação de L-asparaginase / Development and characterization of polymersomes for the release of L-asparaginaseAlexsandra Conceição Apolinário 03 October 2018 (has links)
A enzima L-Asparaginase (ASNase) é um biofámaco utilizado no tratamento da leucemia linfoblástica aguda, no entanto, a evolução da produção da ASNase como um medicamento desde o final da década de 1970 resultou em apenas quatro alternativas disponíveis no mercado farmacêutico, com relatos de graves reações imunogênicas e toxicidade. Desse modo, a nanotecnologia é uma plataforma que pode ser explorada para administração dessa enzima diminuindo a exposição da mesma a proteases e aumentando a sua meia-vida aparente. Os polimerossomos (PL) são opções que pela nanoestrutura vesicular poderiam encapsular a ASNase em seu core aquoso e pela presença de uma membrana polimérica, são mais robustos que os lipossomos. Assim, neste trabalho objetivou-se desenvolver PL para encapsulação da ASNase como uma alternativa às formulações deste biofármaco existentes. Foram desenvolvidos PL de PEG-PLA, PMPC-PDPA, PEG-PDPA e Pluronic® L-21. Foram estudados fatores relacionados à composição dos copolímeros (fração hidrofílica, responsividade a fatores externos tais como pH e temperatura) e métodos de elaboração (hidratação do filme polimérico, troca de pH e temperatura) bem como foi feita a caracterização dos PL obtidos (tamanho, índice de polidispersão, espessura de membrana, formação de excessivo bulk polimérico, obtenção de micelas). Também foi feito um planejamento racional para encapsulação da ASNase (hidratação direta do filme polimérico e encapsulação por eletroporação, autoagregação com encapsulação por troca de pH ou de temperatura). Para os PL preparados com PEG-PLA, a extrusão resultou em distribuição de tamanhos mais estreitos correspondentes aos valores de PDI de 0,345, 0,144 e 0,081 para PEG45-PLA69, PEG114-PLA153 e PEG114-PLA180, respectivamente. Foi demonstrado que copolímeros com menor fração hidrofóbica resultam em maior eficiência de encapsulação para proteínas, já que possuem volumes aquosos maiores. Com o PMPC25-PDPA72 foi possível encapsular em média três unidades de ASNase por vesículas através da eletroporação ou troca de pH, sendo que no primeiro método houve formação de túbulos e no último método as micelas não foram completamente removidas. Para PEG100-PDPA80, grandes agregados permaneceram após a purificação levando a um PDI alto, mas não foi observada a formação de túbulos, já a troca de pH para este copolímero resultou em maior perda de copolímeros como bulk polimérico precipitado. Para o copolimero tribloco Pluronic® L-121, foi observado que as vesículas eram estáveis durante uma semana à temperatura ambiente, contrariando o que era descrito na literatura. Nesses sistemas, quando preparados por hidratação do filme, a encapsulação da ASNase foi realizada por eletroporação mas a proteína não foi detectada dentro das vesículas. Atribuímos a não-encapsulação à organização da bicamada Pluronic® L-121 sem conformação definida das cadeias poliméricas, dificultando a reorganização do bloco hidrofílico na porção interna do poro durante eletroporação. Por troca de temperatura, cerca de 5 % de ASNase foi encapsulada e o método resultou em total recuperação da atividade da enzima. Desse modo foram obtidos diferentes PL com diferentes características nanoestruturais de acordo com os copolímeros utilizados para carreamento da ASNase. / The enzyme L-Asparaginase (ASNase) is a biopharmaceutical used in the treatment of acute lymphoblastic leukemia, still the industrial production of ASNase as a marketable drug since the late 1970s has resulted in only four alternatives available in the pharmaceutical market, with reports of severe immunogenic reactions and toxicity. In this sense, nanotechnology is a platform that can be exploited to administer this enzyme by decreasing its exposure to proteases and increasing its apparent half-life. Polymerosomes (PL) are interesting routes which by its intrinsically vesicular nanostructure could encapsulate the ASNase in its aqueous core and by the presence of a polymeric membrane, being more robust than the liposomes. Thus, in this work it was intended to develop PL for ASNase encapsulation as an alternative to existing formulations of this biopharmaceutical. PL of PEG-PLA, PMPC-PDPA, PEG-PDPA and Pluronic® L-21 were developed. It was studied the copolymers composition (i.e. hydrophilic fraction, responsiveness to external factors such as pH and temperature), PL design (i.e. polymer film hydration, pH change and temperature) and PL characterization (i.e. size, polydispersity index - PDI, membrane thickness, formation of excessive polymer bulk, micelles production). A suitable experimental planning for ASNase encapsulation (i.e. direct hydration of the polymeric film and encapsulation by electroporation, self-aggregation with encapsulation by pH or temperature change) was also performed. For the PL prepared with PEG-PLA, the extrusion resulted in narrower size distribution corresponding to the PDI values of 0.345, 0.144 and 0.081 for PEG45-PLA69, PEG114-PLA153 and PEG114-PLA180, respectively. It has been shown that copolymers with lower hydrophobic fraction result in higher encapsulation efficiency for proteins, since they have larger aqueous volumes. With PMPC25-PDPA72 PL, it was possible to encapsulate three units of ASNase per vesicles through electroporation or pH change. In the first method, tubules were formed and in the latter one the micelles were not completely removed. For PEO100-PDPA80 PL, large aggregates remained after purification leading to a high PDI value, nevertheless no tubule formation was observed, since the pH change for this copolymer resulted in greater loss of copolymers as a precipitated polymer bulk. For the Pluronic® L-121 triblock copolymer PL, it was observed that the vesicles were stable for one week at room temperature, contrary to what was described in the literature. These PLs were prepared by film hydration method and ASNase encapsulation was performed by electroporation, nonetheless the protein was not detected within the vesicles. It is attributed the non-encapsulation to the organization of the Pluronic® L-121 bilayer without defined conformation of the polymer chains, making it difficult to reorganize the hydrophilic block in the internal portion of the pore during electroporation. By temperature change, about 5% of ASNase was encapsulated and the method resulted in complete recovery of enzyme activity. In conclusion, several PLs with a vast range of differential nanostructural characteristics were obtained according to the copolymers used for ASNase loading.
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Desenvolvimento de vesículas poliméricas de poli(etileno glicol)-b-poli(ε-caprolactona) (PEG-PCL) para veiculação de L-asparaginase / Development of polyethylene glycol-polycaprolactone polymer vesicles for L-AsparaginaseJuliana de Almeida Pachioni Vasconcelos 21 June 2018 (has links)
A L-Asparaginase (ASNase) é um importante agente quimioterapêutico utilizado para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda (ALL) há mais de 40 anos. No entanto, devido à origem biológica da ASNase, enzima produzida por Escherichia coli, problemas como a imunogenicidade e baixa meia vida-plasmática devem ser considerados. Com o objetivo de minimizar essas desvantagens, várias ASNases homólogas bem como formulações de ASNase de E. coli foram investigadas. Nenhuma das formulações desenvolvidas, entretanto, foi capaz de resolver definitivamente esses problemas associados à sua origem. Nesse sentido, considerando os recentes avanços na ciência de polímeros com a possibilidade do obtenção de vesículas poliméricas usando copolímeros, este trabalho concentrou-se no desenvolvimento de polimerossomos de poli(etileno glicol)-b-poli(ε-caprolactona) (PEG-PCL) para encapsular a ASNase. Diversas condições experimentais foram investigadas e, ao final, os polimerossomos foram produzidos pela técnica de hidratação do filme polimérico utilizando a centrifugação como técnica de pós-filme para remoção de copolímero precipitado, produzindo assim vesículas polímericas de 120 a 200nm com PDI de aproximadamente 0,250. A eficiência de encapsulação da ASNase, utilizando as metodologias de centrifugação ou cromatografia de exclusão molecular, revelou taxas de encapsulação de 20-25% e 1 a 7%, repectivamente. Esses resultados apontam a importância de se determinar a eficiência de encapsulação por cromatografia de exclusão molecular ou método direto no caso de nanoestruturas auto-agregadas formadas por copolímeros, devido a valores superestimados com o emprego da centrifugação. Ainda que estudos complementares se façam necessários para liberação da enzima encapsulada ou penetração da L-asparagina nas vesículas, nossos resultados demonstram o potencial de polimerossomos para veiculação de ASNase, bem como de outras proteínas terapêuticas. / L-Asparaginase (ASNase) is an important chemotherapeutic agent used for the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) for more than 40 years. However, due to the biological origin of ASNase (produced by Escherichia coli) some drawbacks such as immunogenicity and low plasma half life are present. In order to minimize the disadvantages, several ASNases proteoforms and formulations of E. coli ASNase were investigated. However, none of this formulations completely solved the main drawbacks of ASNase. In this sense, considering the recents advances in polymers science with the possibility to develop polymeric vesicles using copolymers, this work aimed at the development of poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone) (PEG-PCL) vesicles to encapsulate ASNase. Different experimental conditions were investigated and, the final polymersomes formulation was prepared by film hydratation using centrifugation as a post-film technique to remove the bulky coplymer. Polymeric vesicles of 120 to 200nm with PDI of approximately, 0.250 were obtained. The encapsulation efficiency of ASNase was determined indirectly by centrifugation and directly by size exclusion chromatography, resulting in encapsulation rates of 20-25% and 1 to 7%, respectively. These results indicate the importance of determining the efficiency of encapsulation by size exclusion chromatography or direct method in the case of self-aggregated nanostructures formed by copolymers, due to values overestimated with the use of centrifugation. Our results point to the potential of polymersomes for ASNase delivery, as well as other therapeutic proteins. Nonetheless, complimentary studies are still necessary for ASNase release or L-asparagine penetration into the vesicles.
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Desenvolvimento e caracterização de polimerossomos para veiculação de L-asparaginase / Development and characterization of polymersomes for the release of L-asparaginaseApolinário, Alexsandra Conceição 03 October 2018 (has links)
A enzima L-Asparaginase (ASNase) é um biofámaco utilizado no tratamento da leucemia linfoblástica aguda, no entanto, a evolução da produção da ASNase como um medicamento desde o final da década de 1970 resultou em apenas quatro alternativas disponíveis no mercado farmacêutico, com relatos de graves reações imunogênicas e toxicidade. Desse modo, a nanotecnologia é uma plataforma que pode ser explorada para administração dessa enzima diminuindo a exposição da mesma a proteases e aumentando a sua meia-vida aparente. Os polimerossomos (PL) são opções que pela nanoestrutura vesicular poderiam encapsular a ASNase em seu core aquoso e pela presença de uma membrana polimérica, são mais robustos que os lipossomos. Assim, neste trabalho objetivou-se desenvolver PL para encapsulação da ASNase como uma alternativa às formulações deste biofármaco existentes. Foram desenvolvidos PL de PEG-PLA, PMPC-PDPA, PEG-PDPA e Pluronic® L-21. Foram estudados fatores relacionados à composição dos copolímeros (fração hidrofílica, responsividade a fatores externos tais como pH e temperatura) e métodos de elaboração (hidratação do filme polimérico, troca de pH e temperatura) bem como foi feita a caracterização dos PL obtidos (tamanho, índice de polidispersão, espessura de membrana, formação de excessivo bulk polimérico, obtenção de micelas). Também foi feito um planejamento racional para encapsulação da ASNase (hidratação direta do filme polimérico e encapsulação por eletroporação, autoagregação com encapsulação por troca de pH ou de temperatura). Para os PL preparados com PEG-PLA, a extrusão resultou em distribuição de tamanhos mais estreitos correspondentes aos valores de PDI de 0,345, 0,144 e 0,081 para PEG45-PLA69, PEG114-PLA153 e PEG114-PLA180, respectivamente. Foi demonstrado que copolímeros com menor fração hidrofóbica resultam em maior eficiência de encapsulação para proteínas, já que possuem volumes aquosos maiores. Com o PMPC25-PDPA72 foi possível encapsular em média três unidades de ASNase por vesículas através da eletroporação ou troca de pH, sendo que no primeiro método houve formação de túbulos e no último método as micelas não foram completamente removidas. Para PEG100-PDPA80, grandes agregados permaneceram após a purificação levando a um PDI alto, mas não foi observada a formação de túbulos, já a troca de pH para este copolímero resultou em maior perda de copolímeros como bulk polimérico precipitado. Para o copolimero tribloco Pluronic® L-121, foi observado que as vesículas eram estáveis durante uma semana à temperatura ambiente, contrariando o que era descrito na literatura. Nesses sistemas, quando preparados por hidratação do filme, a encapsulação da ASNase foi realizada por eletroporação mas a proteína não foi detectada dentro das vesículas. Atribuímos a não-encapsulação à organização da bicamada Pluronic® L-121 sem conformação definida das cadeias poliméricas, dificultando a reorganização do bloco hidrofílico na porção interna do poro durante eletroporação. Por troca de temperatura, cerca de 5 % de ASNase foi encapsulada e o método resultou em total recuperação da atividade da enzima. Desse modo foram obtidos diferentes PL com diferentes características nanoestruturais de acordo com os copolímeros utilizados para carreamento da ASNase. / The enzyme L-Asparaginase (ASNase) is a biopharmaceutical used in the treatment of acute lymphoblastic leukemia, still the industrial production of ASNase as a marketable drug since the late 1970s has resulted in only four alternatives available in the pharmaceutical market, with reports of severe immunogenic reactions and toxicity. In this sense, nanotechnology is a platform that can be exploited to administer this enzyme by decreasing its exposure to proteases and increasing its apparent half-life. Polymerosomes (PL) are interesting routes which by its intrinsically vesicular nanostructure could encapsulate the ASNase in its aqueous core and by the presence of a polymeric membrane, being more robust than the liposomes. Thus, in this work it was intended to develop PL for ASNase encapsulation as an alternative to existing formulations of this biopharmaceutical. PL of PEG-PLA, PMPC-PDPA, PEG-PDPA and Pluronic® L-21 were developed. It was studied the copolymers composition (i.e. hydrophilic fraction, responsiveness to external factors such as pH and temperature), PL design (i.e. polymer film hydration, pH change and temperature) and PL characterization (i.e. size, polydispersity index - PDI, membrane thickness, formation of excessive polymer bulk, micelles production). A suitable experimental planning for ASNase encapsulation (i.e. direct hydration of the polymeric film and encapsulation by electroporation, self-aggregation with encapsulation by pH or temperature change) was also performed. For the PL prepared with PEG-PLA, the extrusion resulted in narrower size distribution corresponding to the PDI values of 0.345, 0.144 and 0.081 for PEG45-PLA69, PEG114-PLA153 and PEG114-PLA180, respectively. It has been shown that copolymers with lower hydrophobic fraction result in higher encapsulation efficiency for proteins, since they have larger aqueous volumes. With PMPC25-PDPA72 PL, it was possible to encapsulate three units of ASNase per vesicles through electroporation or pH change. In the first method, tubules were formed and in the latter one the micelles were not completely removed. For PEO100-PDPA80 PL, large aggregates remained after purification leading to a high PDI value, nevertheless no tubule formation was observed, since the pH change for this copolymer resulted in greater loss of copolymers as a precipitated polymer bulk. For the Pluronic® L-121 triblock copolymer PL, it was observed that the vesicles were stable for one week at room temperature, contrary to what was described in the literature. These PLs were prepared by film hydration method and ASNase encapsulation was performed by electroporation, nonetheless the protein was not detected within the vesicles. It is attributed the non-encapsulation to the organization of the Pluronic® L-121 bilayer without defined conformation of the polymer chains, making it difficult to reorganize the hydrophilic block in the internal portion of the pore during electroporation. By temperature change, about 5% of ASNase was encapsulated and the method resulted in complete recovery of enzyme activity. In conclusion, several PLs with a vast range of differential nanostructural characteristics were obtained according to the copolymers used for ASNase loading.
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