Bielefeld, Univ., Diss., 2001. / Computerdatei im Fernzugriff.

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Bielefeld, Universiẗat, Diss., 2001.

S179D prolactina (hPRL) é uma mímica molecular da prolactina humana fosforilada. Demonstrou-se que a S179D-hPRL era anti angiogênica nos ensaios de angiogênese baseados na membrana corialantóica de galinha e na córnea de camundongos. Investigações posteriores realizadas empregando modelos in vitro demonstraram que o tratamento com S179D-hPRL diminuiu o número de células viáveis, reduziu a formação de túbulos em Matrigel e interferiu com a migração e invasão da matriz extracelular. A análise dos fatores de crescimento de células endoteliais humanas tratadas com S179D-hPRL revelou: uma diminuição na expressão ou liberação da PRL endógena, da heme-oxigenase-1, do fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF) e um aumento na expressão de dois inibidores teciduais de metaloproteases. A S179D-hPRL também bloqueou a sinalização provocada por bFGF nessas células. Nós concluímos que essa mímica molecular do hormônio pituitário fosforilado é uma potente proteína anti-angiogênica, em parte devido á sua habilidade de reduzir o estímulo autócrino de fatores de crescimento de células endoteliais de cordão umbilical humano (HUVEC), por sua capacidade de bloquear a sinalização promovida pelo bFGF e por sua habilidade de interferir na migração endotelial. Também foi estudada a influência da S179D-hPRL na apoptose em células endoteliais humanas, empregando caspase-8 como um marcador da via extrínseca, e a liberação de citocromo C como um marcador da via intrínseca. As duas cascatas convergem na ativação da caspase-3, que cliva a fator de fragmentação de DNA (DFF45). Uma incubação de três dias com 50 ng/mL de S179D-hPRL quadruplicou o número de células apoptóticas; esse efeito duplicou-se com uma concentração de 100 ng/mL e atingiu um ápice com 500 ng/mL. A clivagem de DFF45 e da pro-caspase-8 foi detectado com 100 ng/mL. Citocromo C, porém, só foi observado com concentrações de 500 ng/mL. O regulador de ciclo celular p21 (um marcador pró-apoptótico) elevou-se com 100 ng/mL, enquanto que um incremento do supressor tumoral p53 necessitou três vezes o tempo de incubação e 500 ng/mL. A atividade do promotor de p21 foi máxima com 50 ng/mL do análogo de hPRL, enquanto que 500 ng/mL foram necessários para se visualizar uma alteração significativa na atividade do promotor de Bax (um indicador da atividade de p53). Como previamente demonstrado na literatura, S179D-hPRL bloqueou a fosforilação da quinase regulada extracelularmente (ERK) em resposta ao bFGF, mas também causou uma ativação tardia e prolongada da ERK. PD 98059 [inibidor específico da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPkinase)] inibiu essa ativação tardia e sustentada assim como outros efeitos da S179D-hPRL, exceto aquele sobre a indução de p53 e ativação do promotor de Bax. Podemos concluir que baixas doses de S179D-hPRL bloqueiam a sinalização de ERK induzida por bFGF e concomitantemente ativam a ERK em um tempo diferente, resultando na elevação de p21 e ativando a via extrínseca de apoptose. Maiores tempos de incubação e concentração, entretanto, ativam a via intrínseca empregando uma cascata intracelular diferente. Esses achados sugerem que níveis circulantes de PRL fosforilada podem inibir a progressão do câncer e, portanto, S179D-hPRL poderia ser um agente anti-angiogênico útil na terapêutica. / S179D-prolactin (hPRL) is an experimentally useful mimic of naturally phosphorylated human prolactin. S179D-hPRL, but not unmodified PRL, was found to be anti-angiogenic in both the chorioallantoic membrane and corneal assays. Further investigation using human endothelial in vitro models showed reduced cell number, reduced tubule formation in Matrigel, and reduced migration and invasion, as a function of treatment with S179D-hPRL. Analysis of growth factors in human endothelial cells in response to S179D-hPRL showed a decreased expression or release of endogenous PRL, heme-oxygenase-1, basic fibroblast growth factor (bFGF), angiogenin, epidermal growth factor and vascular endothelial growth factor and an increased expression of inhibitors of matrix metalloproteases. S179D-hPRL also blocked signaling from bFGF in these cells. We conclude that this molecular mimic of a pituitary hormone is a potent anti-angiogenic protein, partly as a result of its ability to reduce utilization of several well-established endothelial autocrine growth loops, partly by its ability to block signaling from bFGF and partly because of its ability to decrease endothelial migration. We also examined the influence of S179D-hPRL on apoptosis in human endothelial cells, using procaspase-8 as a marker of the extrinsic pathway, and cytochrome C release as a marker of the intrinsic pathway. Both pathways converge at caspase-3, which cleaves DNA fragmentation factor (DFF45). A 3-day incubation with 50 ng/ml S179D-hPRL quadrupled the early apoptotic cells; this effect was doubled at 100 ng/ml and maximal at 500 ng/ml. DFF45 and pro-caspase 8 cleavage were detectable at 100 ng/ml. Cytochrome C, however, was unaffected until 500 ng/ml. p21 increased at 100 ng/ml, whereas a change in p53 activity required both triple the time and 500 ng/ml. p21 promoter activity was maximal at 50 ng/ml, whereas 500 ng/ml were required to see a significant change in the Bax promoter (a measure of p53 activity). As previously shown, S179D-hPRL blocked extracelular regulated kinase (ERK) phosphorylation in response to bFGF, but, in addition, continued co-incubation showed a delayed and prolonged activation of ERK. PD98059 [a specific mitogen-activated protein kinase (MAPkinase) inhibitor] inhibited this delayed activation of ERK and the effects of S179D-hPRL on all parameters except p53, or activity of the Bax promoter. We conclude that low doses of S179D-hPRL block bFGF-induced ERK signaling and yet activates ERK in a different time frame to elevate p21, and activate the extrinsic pathway. Longer incubations and higher concentrations, however, additionally activate the intrinsic pathway using an alternate intracellular signal. These findings suggest that circulating levels of phosphorylated hPRL may reduce the progression of cancer and, furthermore, that S179D-hPRL may be a useful anti-angiogenic therapeutic.

S179D prolactina (hPRL) é uma mímica molecular da prolactina humana fosforilada. Demonstrou-se que a S179D-hPRL era anti angiogênica nos ensaios de angiogênese baseados na membrana corialantóica de galinha e na córnea de camundongos. Investigações posteriores realizadas empregando modelos in vitro demonstraram que o tratamento com S179D-hPRL diminuiu o número de células viáveis, reduziu a formação de túbulos em Matrigel e interferiu com a migração e invasão da matriz extracelular. A análise dos fatores de crescimento de células endoteliais humanas tratadas com S179D-hPRL revelou: uma diminuição na expressão ou liberação da PRL endógena, da heme-oxigenase-1, do fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF) e um aumento na expressão de dois inibidores teciduais de metaloproteases. A S179D-hPRL também bloqueou a sinalização provocada por bFGF nessas células. Nós concluímos que essa mímica molecular do hormônio pituitário fosforilado é uma potente proteína anti-angiogênica, em parte devido á sua habilidade de reduzir o estímulo autócrino de fatores de crescimento de células endoteliais de cordão umbilical humano (HUVEC), por sua capacidade de bloquear a sinalização promovida pelo bFGF e por sua habilidade de interferir na migração endotelial. Também foi estudada a influência da S179D-hPRL na apoptose em células endoteliais humanas, empregando caspase-8 como um marcador da via extrínseca, e a liberação de citocromo C como um marcador da via intrínseca. As duas cascatas convergem na ativação da caspase-3, que cliva a fator de fragmentação de DNA (DFF45). Uma incubação de três dias com 50 ng/mL de S179D-hPRL quadruplicou o número de células apoptóticas; esse efeito duplicou-se com uma concentração de 100 ng/mL e atingiu um ápice com 500 ng/mL. A clivagem de DFF45 e da pro-caspase-8 foi detectado com 100 ng/mL. Citocromo C, porém, só foi observado com concentrações de 500 ng/mL. O regulador de ciclo celular p21 (um marcador pró-apoptótico) elevou-se com 100 ng/mL, enquanto que um incremento do supressor tumoral p53 necessitou três vezes o tempo de incubação e 500 ng/mL. A atividade do promotor de p21 foi máxima com 50 ng/mL do análogo de hPRL, enquanto que 500 ng/mL foram necessários para se visualizar uma alteração significativa na atividade do promotor de Bax (um indicador da atividade de p53). Como previamente demonstrado na literatura, S179D-hPRL bloqueou a fosforilação da quinase regulada extracelularmente (ERK) em resposta ao bFGF, mas também causou uma ativação tardia e prolongada da ERK. PD 98059 [inibidor específico da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPkinase)] inibiu essa ativação tardia e sustentada assim como outros efeitos da S179D-hPRL, exceto aquele sobre a indução de p53 e ativação do promotor de Bax. Podemos concluir que baixas doses de S179D-hPRL bloqueiam a sinalização de ERK induzida por bFGF e concomitantemente ativam a ERK em um tempo diferente, resultando na elevação de p21 e ativando a via extrínseca de apoptose. Maiores tempos de incubação e concentração, entretanto, ativam a via intrínseca empregando uma cascata intracelular diferente. Esses achados sugerem que níveis circulantes de PRL fosforilada podem inibir a progressão do câncer e, portanto, S179D-hPRL poderia ser um agente anti-angiogênico útil na terapêutica. / S179D-prolactin (hPRL) is an experimentally useful mimic of naturally phosphorylated human prolactin. S179D-hPRL, but not unmodified PRL, was found to be anti-angiogenic in both the chorioallantoic membrane and corneal assays. Further investigation using human endothelial in vitro models showed reduced cell number, reduced tubule formation in Matrigel, and reduced migration and invasion, as a function of treatment with S179D-hPRL. Analysis of growth factors in human endothelial cells in response to S179D-hPRL showed a decreased expression or release of endogenous PRL, heme-oxygenase-1, basic fibroblast growth factor (bFGF), angiogenin, epidermal growth factor and vascular endothelial growth factor and an increased expression of inhibitors of matrix metalloproteases. S179D-hPRL also blocked signaling from bFGF in these cells. We conclude that this molecular mimic of a pituitary hormone is a potent anti-angiogenic protein, partly as a result of its ability to reduce utilization of several well-established endothelial autocrine growth loops, partly by its ability to block signaling from bFGF and partly because of its ability to decrease endothelial migration. We also examined the influence of S179D-hPRL on apoptosis in human endothelial cells, using procaspase-8 as a marker of the extrinsic pathway, and cytochrome C release as a marker of the intrinsic pathway. Both pathways converge at caspase-3, which cleaves DNA fragmentation factor (DFF45). A 3-day incubation with 50 ng/ml S179D-hPRL quadrupled the early apoptotic cells; this effect was doubled at 100 ng/ml and maximal at 500 ng/ml. DFF45 and pro-caspase 8 cleavage were detectable at 100 ng/ml. Cytochrome C, however, was unaffected until 500 ng/ml. p21 increased at 100 ng/ml, whereas a change in p53 activity required both triple the time and 500 ng/ml. p21 promoter activity was maximal at 50 ng/ml, whereas 500 ng/ml were required to see a significant change in the Bax promoter (a measure of p53 activity). As previously shown, S179D-hPRL blocked extracelular regulated kinase (ERK) phosphorylation in response to bFGF, but, in addition, continued co-incubation showed a delayed and prolonged activation of ERK. PD98059 [a specific mitogen-activated protein kinase (MAPkinase) inhibitor] inhibited this delayed activation of ERK and the effects of S179D-hPRL on all parameters except p53, or activity of the Bax promoter. We conclude that low doses of S179D-hPRL block bFGF-induced ERK signaling and yet activates ERK in a different time frame to elevate p21, and activate the extrinsic pathway. Longer incubations and higher concentrations, however, additionally activate the intrinsic pathway using an alternate intracellular signal. These findings suggest that circulating levels of phosphorylated hPRL may reduce the progression of cancer and, furthermore, that S179D-hPRL may be a useful anti-angiogenic therapeutic.

Computational structural biology Even with rapid advances in structure determination methods, there is a long gap to be bridged between the number of proteins that have been sequenced and the number whose three-dimensional structures have been experimentally elucidated. Experimentally protein structures are determined by X-ray crystallography or by nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR). X-ray crystal structures give a time averaged picture but little information on conformational dynamics. Though NMR gives dynamical information, the technique cannot be applied to systems whose molecular weight is large. Only small proteins fall within the ken of NMR experiments. In most cases the three dimensional structure of the protein alone cannot give a complete picture of its mechanism. It is also essential to know the interactions of proteins with other proteins, with their ligands and substrates in order to have a better understanding of their functioning. Computer modeling and simulations are now indispensable supplements to experimental structural biology. The last word in protein structure prediction method is far from being said but the ever-improving homology and ab-initio modeling methods give rise to optimism that sometime in the near future these methods will become almost as reliable as experimental techniques. Ligand docking onto protein molecules is as challenging a problem as protein structure predicting itself. Computer modeling methods to dock ligands have to search a wide region of conformational space besides taking into consideration issues of charge and shape complementarities.

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Le carcinome à cellules rénales (CCR) se caractérise par une résistance importante aux thérapies. Notre hypothèse était que des voies signalétiques prolifératives, anti-apoptotiques et/ou angiogéniques sont mises en jeu dans la résistance aux thérapies. Il s’agissait de mesurer la sensibilité de lignées cellulaires de CCR humain à différentes classes thérapeutiques in vitro et in vivo. Une étude pilote a été réalisée sur la base de xénogreffes de la lignée A498 chez la souris nude, puis exploitée pour des analyses sur biopuces à protéines afin d’identifier les voies de signalisation induites par le sunitinib. In vitro, les lignées cellulaires de CCR se sont révélées sensibles aux thérapies indépendamment du statut VHL. In vivo, la lignée A498 est apparue résistante au sunitinib. L’approche par biopuces a montré que plusieurs protéines de l’angiogenèse sont modulées sous l'effet du traitement, notamment l’angiogénine. Il n’y a pas de modification de l’expression des protéines de l’apoptose testées. Les formes phosphorylées d’Akt sont également augmentées dans les tumeurs traitées, de même que Lim1 alors que la forme phosphorylée de NFκB est diminuée. Ce travail a ainsi identifié de potentielles cibles impliquées dans les mécanismes de résistance et devraient permettre de définir de nouvelles options thérapeutiques dans le cancer du rein. / The renal cell carcinoma is characterized by a high resistance to therapies. Our working hypothesis was that proliferative signaling pathways, anti-apoptotic and / or angiogenic are involved in resistance to therapies. Thus, as part of this thesis, we measured the sensitivity to chemotherapy and targeted therapies in kidney cancer cell lines in vitro as well in vivo.A pilot study was conducted on the basis of the A498 cell line xenografts in nude mice, and then used for analysis on proteome arrays to identify the signaling pathways induced by sunitinib. In vitro, the cell lines of RCC were sensitive to therapy regardless of the VHL status. In vivo, the line A498 appeared resistant to sunitinib. The approach using the proteome array has shown that several angiogenesis proteins are modulated as a result of treatment, including angiogenin. There was no change in the expression of proteins of apoptosis. Phosphorylated forms of Akt were also increased in the treated tumors, as well as Lim1 whereas the phosphorylated form of NFkB was reduced. This work has identified potential targets involved in resistance mechanisms and should define new therapeutic options in renal cancer.