A presente pesquisa teve a finalidade de padronizar a técnica de cardiotocografia a ser utilizada para avaliar a existência de hipóxia/sofrimento fetal durante a vida intrauterina, procurando estabelecer a partir do 7º mês da gestação os padrões de normalidade da frequência cardíaca fetal para fetos sadios e oriundos de inseminação artificial, bem como avaliar a influência da clonagem nos parâmetros obtidos no exame de cardiotocografia. Foram acompanhadas as gestações de 14 vacas, sendo os animais divididos em três grupos experimentais: Grupo de Clones Mortos composto de 5 vacas gestantes nas quais acompanhou-se a carditocografia de fetos gerados pela técnica de clonagem e nos quais a morte do bezerro ocorreu nas primeiras 36 horas de vida ; Grupo de Clones Vivos composto de 4 vacas gestantes nas quais acompanhou-se a carditocografia de fetos gerados pela técnica de clonagem e que permaneceram vivos após o nascimento; Grupo Controle - composto de 5 vacas gestantes nas quais acompanhou-se a carditocografia de fetos gerados por inseminação artificial e que deram origem a bezerros sadios. Os animais foram acompanhados por exames periódicos de cardiotocografia realizados nos seguintes momentos: 90, 60, 30, 15, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 dia antes do parto e no dia do parto. Para a realização dos exames foi utilizado o aparelho de cardiotocografia da marca Philips modelo Avalon FM30,no local onde as vacas se encontravam. Os exames tiveram uma duração de 20 a 40 minutos de traçado, sendo que o transdutor de ultra-som era acomodado de forma a obter o melhor sinal cardíaco fetal. Imediatamente após o nascimento, realizou-se a avaliação da viabilidade de bezerros recém-nascidos pelo método APGAR e a observação de bezerros tingidos de amarelo em decorrência da presença de mecônio nas secreções uterinas.Através dos traçados obtidos com a cardiotocografia foram analisados os parâmetros da cardiotocografia: linha de base, acelerações transitórias, acelerações prolongadas, variabilidade, taquicardia, bradicardia e desacelerações, sendo ao final calculado o índice cardiotocométrico. Nos animais classificados como hipoativo ou inativo aplicava-se estimulação por palpação retal com beliscamento do espaço interdigital do feto com o objetivo de modificar o comportamento fetal e evitar resultados falso positivos.O exame de cardiotocografia mostrou ser eficaz na avaliação da vitalidade fetal na espécie bovina. Os valores médios e o desvio padrão da frequência cardíaca fetal basal (linha de base) em fetos hígidos foi igual a 116,4 ± 9,07 bpm. Considerou-se taquicardia uma frequência cardíaca fetal igual ou maior do que 145 bpm e bradicardia uma frequência cardíaca igual ou menor do que 90 bpm. Considerou-se normal para bovinos uma variabilidade com valores situados entre 5 e 15 bpm. Verificou-se que a presença de acelerações transitórias são indicativas de bem estar fetal, sendo que o número de acelerações transitórios consideradas como fisiológicas varia entre 1 e 5. Desacelerações são indicativos da existência de sofrimento fetal, não sendo observadas em animais hígidos. No grupo de clones mortos, existem modificações da carditocografia compatíveis com a ocorrência de sofrimento fetal/ hipóxia intrauterina. Os fetos do grupo de clones mortos apresentaram com maior frequência momentos de hipoatividade fetal do que os fetos do grupo de clones vivos e fetos do grupo controle e os fetos do grupo de clone mortos foram classificados com maior frequência como não reativos ao estímulo de beliscamento das extremidades do que os fetos do grupo controle. Os fetos do grupo de clones mortos apresentaram com mais frequência bradicardia (11,8%) do que a observada no grupo controle (0,00 %). Observou-se que no grupo de clones mortos (1,4 ± 1,6) o número de acelerações transitórias foi significativamente menor do que o observado no grupo de clones vivos (3,50 ± 2,70) e no grupo controle (2,70 ± 1,80). / This research had the purpose to standardize the technique of cardiotocography to be used to assess the presence of hypoxia / fetal distress during intrauterine life, trying to establish from the 7th month of pregnancy the normal range of fetal heart rate in healthy fetuses and from artificial insemination and cloning to evaluate the influence of the parameters obtained in the examination of cardiotocography. Were followed the pregnancies of 14 cows and animals are divided into three experimental groups: Dead Clones Group - composed of 5 pregnant cows which was accompanied the cardiotocography of fetuses generated by the technique of cloning, in which the death occurred in the calf first 36 hours of life; Living Clones Group - composed of 4 pregnant cows which is accompanied cardiotocography of fetuses generated by the technique of cloning and remained alive after the birth, control group - composed of 5 pregnant cows in which follow - the cardiotocography of fetuses generated by artificial insemination and gave rise to healthy calves. The animals were monitored by periodic assessment of cardiotocography performed in the following periods: 90, 60, 30, 15, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 day before parturition and day of birth. For the examinations we used the apparatus of cardiotocography Brand Philips Avalon FM30 model, where the cows were. The tests had a duration of 20 to 40 minutes of track, and the ultrasound transducer was adjusted to obtain the best fetal cardiac signal. Immediately after birth, was held to assess the viability of newborn calves by the method APGAR and the observation of colored yellow calves due to the presence of meconium in the uterine secretions. Through cardiotocography tracings were analyzed with the parameters of cardiotocography : the baseline, acceleration transient, prolonged accelerations, variability, tachycardia, bradycardia, and deceleration modes, and the final calculated the index cardiotocométrico. In the animals classified as inactive or hypoactive stimulation was applied by rectal palpation of the interdigital space with pinch of the fetus with order to modify the behavior and prevent fetal false positives. An examination of cardiotocography has proven effective in evaluation of fetal vitality in the bovine species. The mean values and standard deviation of the baseline fetal heart rate (from baseline) in healthy fetuses was equal to 116.4 ± 9.07 bpm. Tachycardia was considered a fetal heart rate equal to or greater than 145 bpm bradycardia and a heart rate less than or equal to 90 bpm. It was considered normal for cattle variability with values between 5 and 15 bpm. It was found that the presence of transient accelerations are indicative of fetal well-being, and the number of transient accelerations considered physiological ranges between 1 and 5. Deceleration is indicative of the existence of fetal distress and is not observed in healthy animals. In the group of clones dead, there are changes in cardiotocography consistent with the occurrence of fetal distress / intrauterine hypoxia. The fetuses of the group of clones had killed more often moments of fetal hypoactivity than the fetuses of the group of clones live fetuses and the control group and the group of fetuses dead clone were classified more frequently as non-reactive to stimulation of the pinch ends of the fetuses in the control group. The fetuses of the group of dead clones showed bradycardia more often (11.8%) than that observed in the control group (0.00%). It was observed that the group of dead clones (1.4 ± 1.6) the number of transient acceleration was significantly lower than that observed in the group of live clones (3.50 ± 2.70) and the control group (2 , 70 ± 1.80).

O perfil metabólico é usado na clínica médica com a finalidade de ajudar o diagnóstico e permite o diagnóstico precoce de alterações metabólicas e também a funcionalidade dos principais órgãos. A transferência nuclear de células somáticas (TNCS - clonagem), apesar de apresentar resultados positivos, ainda possui baixa eficiência, com alta mortalidade embrionária, fetal e pós-natal. Observa-se na primeira semana de vida principalmente nas primeiras 24-48 horas um grande número de bezerros que morrem, devido a distúrbios de adaptação neonatal. Essas alterações placentárias e más formações determinam alterações bioquímicas que são as causas de muitos óbitos verificados nos clones. Este trabalho teve como objetivo estudar o perfil bioquímico de bezerros Nelore clonados durante os 30 primeiros dias de vida, procurando verificar as possíveis modificações no metabolismo de animais obtidos por transferência nuclear de células somáticas (TNCS - clonagem). Foram utilizados 20 bezerros Nelores e realizou-se de cada animal 13 coletas de sangue nos seguintes momentos: ao nascimento, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 240, 360, 480 e 720 horas de vida. Determinou-se de cada amostra os valores séricos para função renal, função hepática, proteinograma, lipidograma e minerais. As amostras foram analisadas em analisador bioquímico automático, da marca Randox, modelo RX Daytona. Observou-se, ureia 22,78 ± 0,84 mg/dL e 29,03 ± 0,92 mg/dL, creatinina 1,61 ± 0,05 mg/dL e 1,39 ± 0,03 mg/dL, relação ureia/creatinina 16,07 ± 0,76 e 21,16 ± 0,75 mg/dL; aspartato alanina quinase (AST), 57,84 ± 3,06 U/L e 22,91 ± 0,99 U/L; gama-glutamil transferase (GGT) 1294,05 ± 152,37 U/L e 287,26 ± 28,05 U/L; fosfatase alcalina (FA) 2311,63 ± 146,22 e 836,05 ± 41,07 U/L e creatina quinase (CK) 223,47 ± 30,73 mg/dL e 64,82 ± 9,18 mg/dL; proteína total 6,43 ± 0,09 g/dL e 5,68 ± 0,05 g/dL; albumina 2,82 ± 0,02 g/dL e 2,63 ± 0,01 g/dL; globulina 3,61 ± 0,09 g/dL e 3,06 ± 0,05 g/dL e relação albumina/globulina 0,90 ± 0,04 e 0,90 ± 0,02; colesterol 74,00 ± 3,63 mg/dL e 56,31 ± 2,84 mg/dL; triglicérides 35,18 ± 1,98 mg/dL e 38,71 ± 2,79 mg/dL; glicose 126,72 ± 3,30 mg/dL e 106,70 ± 2,88 mg/dL e lactato 26,27 ± 0,98 mg/dL e 30,71 ± 1,61 mg/dL ; cálcio 10,74 ± 0,07 mg/dL e 10,63 ± 0,08 mg/dL; fósforo 8,96 ± 0,13 mg/dL e 9,87 ± 0,20 mg/dL, para o grupo de bezerros de parto normal e bezerros clonados, respectivamente. Apesar de bezerros clonados da raça Nelore apresentaram perfil bioquímico dentro dos valores fisiológicos descritos na literatura observou-se importantes e significativas diferenças no seu metabolismo, principalmente, na primeira semana de vida. / The metabolic profile is used in clinical medicine with the purpose of assisting in the study of metabolic diseases origin, allowing early diagnosis of metabolic abnormalities and also aids the evaluation of major organs functionality. The somatic cell nuclear transfer (SCNT - cloning), despite showing positive results, still has low efficiency and it is associated with high embryonic, fetal and postnatal mortality. It has been observed in the first week of life, especially in the first 24-48 hours, that a large number of calves die due to neonatal adaptation disorders. Among these, placental disorders and malformations have been related to biochemical changes, possibly being the major cause of deaths in clones. This study aimed to evaluate the influence of age on the concentrations of serum biochemical parameters of Nellore calves born through normal delivery, compared with cloned ones, from birth to 30 days of life. Twenty Nellore calves were used in this study and 13 blood samples of each animal were collected at the following periods: at birth, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 240, 360, 480 and 720 hours of life. Serum values for kidney and liver function, proteins, lipid and minerals were determined. The samples were analyzed with a biochemical automatic analyzer, Randox brand, model RX Daytona. It was observed: urea 22.78 ± 0.84 mg/dL and 29.03 ± 0.92 mg/dL, creatinine 1.61 ± 0.05 mg/dL and 1.39 ± 0.03 mg/dL urea / creatinine 16.07 ± 0.76 and 21.16 ± 0.75 mg/dL; alanine aspartate kinase (AST) 57.84 ± 3.06 U/L and 22.91 ± 0.99 U/L; gamma-glutamyl transferase (GGT) 1294.05 ± 152.37 U/L and 287.26 ± 28.05 U/L; alkaline phosphatase (ALP) 2311.63 ± 146.22 and 836.05 ± 41.07 U/L and creatine kinase (CK) 223.47 ± 30.73 mg/dL and 64.82 ± 9.18 mg/dL ; total protein 6.43 ± 0.09 g/dL and 5.68 ± 0.05 g/dL; albumin 2.82 ± 0.02 g/dL and 2.63 ± 0.01 g/dL; globulin 3.61 ± 0.09 g/dL and 3.06 ± 0.05 g/dL and the albumin/globulin 0.90 ± 0.04 and 0.90 ± 0.02; cholesterol 74.00 ± 3.63 mg/dL and 56.31 ± 2.84 mg/dL; triglycerides 35.18 ± 1.98 mg/dL and 38.71 ± 2.79 mg/dL; glucose 126.72 ± 3.30 mg/dL and 106.70 ± 2.88 mg/dL; lactate 26.27 ± 0.98 mg/dL and 30.71 ± 1.61 mg/dL; Calcium 10.74 ± 0.07 mg/dL and 10.63 ± 0.08 mg/dL; phosphorus 8.96 ± 0.13 mg/dL and 9.87 ± 0.20 mg/dL for the group of normal delivery and cloned calves, respectively. Although cloned calves Nellore showed biochemical profile within the physiological range described in the literature and observed important differences in their metabolism, especially in the first week of life.

As cepas vacinais rotavírus reassortants G1, G2, G3, G4 e G9 foram obtidas de um rearranjo genético entre cepas humanas de rotavírus do grupo A do sorotipo G (D, DS-1, P, ST-3 e AU32) e a cepa bovina UK-Bovine. Neste estudo, a cepa reassortant de rotavírus IB-BRV-4-G4 foi formulada, em duas condições, sem adjuvante (Esquema 1) e com adjuvante (Esquema 2) para imunização de camundongos Balb/c. Três AcMos da classe IgM foram obtidos da fusão utilizando animais do Esquema 1 e com o esquema 2 foram obtidos 3 AcMos, dois da classe IgA e um da subclasse IgG1. Destes últimos, dois AcMo (IgA) reconheceram somente epitopos conformacionais em teste de Dot-blot. Entretanto, o AcMo 3 (IgG1) foi reativo a proteínas virais também por Western Blotting, em uma região de perfil eletroforético coincidente com a glicoproteína VP7 de rotavírus. Os resultados mostram que o esquema II de imunização resultou em AcMo específicos para o sorotipo G4, sendo o AcMo IgG1 um forte candidato a ser utilizado nos testes de potência da vacina pentavalente de rotavírus do Instituto Butantan. / The rotavirus strain (G1, G2, G3, G4 and G9) were obtained of reassortants between human rotavirus of the group A and G serotypes (D, DS-1, P, ST-3 and AU32) and a strain from bovine (UK-Bovine).In this study, IB-BRV-4-G4 reassortant rotavirus strain was used to immunize Balb/c mice. Two schedules of immunization were used in the animals, one with IB-BRV-4-G4 (E1) and other with rotavirus antigen and adjuvant (E2). Three monoclonal antibodies of IgM class were obtained of cells from mice immunized only with rotavirus antigen (E1) and with (E2) was obtained three monoclonal antibodies, two producers the IgA class and one the IgG1 subclass. The IgA clones were reactive to G4 serotype rotavirus antigen only in the Dot-blot test. The mAb IgG1 was also reactive to viral proteins in a region of electrophoresis profile in the Western blotting test that coincided with the glycoprotein VP7 of rotavirus. The results indicate that the IgG1 obtained is specific to G4 serotype of rotavirus. It is candidate to be for use in the potency test of pentavalent vaccine.

O Papilomavírus Bovino do tipo 1 (BPV-1) causa fibropapilomas em bovinos e sarcóide em equinos, associados à expressão de oncoproteínas virais, principalmente E6 e E7. A purificação de oncoproteínas a partir de sistema recombinante possibilita seu estudo. Os objetivos foram expressar o gene E6 do BPV-1, purificar e analisar in silico a proteína recombinante obtida. O amplificado foi clonado em E. coli e os plasmídeos foram sequenciados, confirmando a matriz correta de leitura. Após indução da expressão, a proteína recombinante foi identificada e purificada. A microscopia eletrônica mostrou a formação de corpúsculos de inclusão. As análises in silico apontaram as mutações das sequências gênica e proteica de E6-1 em relação às depositadas. Foi realizada a predição tridimensional da estrutura da proteína recombinante e identificadas as regiões conservadas, antigênicas e capazes de realizar ligações cátion-<font face=\"Symbol\">p. Logo, a proteína recombinante E6 do BPV-1 foi obtida e purificada com sucesso, possibilitando o início de novos experimentos e estudos mais detalhados. / Bovine Papillomavirus type 1 (BPV-1) causes fibropapillomas in cattle and sarcoid in equines, associated with the expression of viral oncoproteins, E6 and E7 particularly. Purification of oncoproteins from recombinant system allows their study. The aim of this study was cloning and expressing BPV-1 E6 gene, purify and analyze in silico recombinant protein. Amplicon was cloned into E. coli and the plasmids were sequenced to confirm the correct reading frame. After induction of expression, the recombinant protein was identified and purified. Electron microscopy showed the inclusion bodies formation. In silico analysis showed mutations in E6-1 gene and protein sequences when there were compared to sequences available in current database. Three-dimensional structure prediction of the recombinant protein was performed and conserved, antigenic and cation-<font face=\"Symbol\">p interaction regions were identified. Therefore, BPV-1 E6 recombinant protein was obtained and successfully purified enabling new experiments and more detailed studies.

As cepas vacinais rotavírus reassortants G1, G2, G3, G4 e G9 foram obtidas de um rearranjo genético entre cepas humanas de rotavírus do grupo A do sorotipo G (D, DS-1, P, ST-3 e AU32) e a cepa bovina UK-Bovine. Neste estudo, a cepa reassortant de rotavírus IB-BRV-4-G4 foi formulada, em duas condições, sem adjuvante (Esquema 1) e com adjuvante (Esquema 2) para imunização de camundongos Balb/c. Três AcMos da classe IgM foram obtidos da fusão utilizando animais do Esquema 1 e com o esquema 2 foram obtidos 3 AcMos, dois da classe IgA e um da subclasse IgG1. Destes últimos, dois AcMo (IgA) reconheceram somente epitopos conformacionais em teste de Dot-blot. Entretanto, o AcMo 3 (IgG1) foi reativo a proteínas virais também por Western Blotting, em uma região de perfil eletroforético coincidente com a glicoproteína VP7 de rotavírus. Os resultados mostram que o esquema II de imunização resultou em AcMo específicos para o sorotipo G4, sendo o AcMo IgG1 um forte candidato a ser utilizado nos testes de potência da vacina pentavalente de rotavírus do Instituto Butantan. / The rotavirus strain (G1, G2, G3, G4 and G9) were obtained of reassortants between human rotavirus of the group A and G serotypes (D, DS-1, P, ST-3 and AU32) and a strain from bovine (UK-Bovine).In this study, IB-BRV-4-G4 reassortant rotavirus strain was used to immunize Balb/c mice. Two schedules of immunization were used in the animals, one with IB-BRV-4-G4 (E1) and other with rotavirus antigen and adjuvant (E2). Three monoclonal antibodies of IgM class were obtained of cells from mice immunized only with rotavirus antigen (E1) and with (E2) was obtained three monoclonal antibodies, two producers the IgA class and one the IgG1 subclass. The IgA clones were reactive to G4 serotype rotavirus antigen only in the Dot-blot test. The mAb IgG1 was also reactive to viral proteins in a region of electrophoresis profile in the Western blotting test that coincided with the glycoprotein VP7 of rotavirus. The results indicate that the IgG1 obtained is specific to G4 serotype of rotavirus. It is candidate to be for use in the potency test of pentavalent vaccine.

O perfil metabólico é usado na clínica médica com a finalidade de ajudar o diagnóstico e permite o diagnóstico precoce de alterações metabólicas e também a funcionalidade dos principais órgãos. A transferência nuclear de células somáticas (TNCS - clonagem), apesar de apresentar resultados positivos, ainda possui baixa eficiência, com alta mortalidade embrionária, fetal e pós-natal. Observa-se na primeira semana de vida principalmente nas primeiras 24-48 horas um grande número de bezerros que morrem, devido a distúrbios de adaptação neonatal. Essas alterações placentárias e más formações determinam alterações bioquímicas que são as causas de muitos óbitos verificados nos clones. Este trabalho teve como objetivo estudar o perfil bioquímico de bezerros Nelore clonados durante os 30 primeiros dias de vida, procurando verificar as possíveis modificações no metabolismo de animais obtidos por transferência nuclear de células somáticas (TNCS - clonagem). Foram utilizados 20 bezerros Nelores e realizou-se de cada animal 13 coletas de sangue nos seguintes momentos: ao nascimento, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 240, 360, 480 e 720 horas de vida. Determinou-se de cada amostra os valores séricos para função renal, função hepática, proteinograma, lipidograma e minerais. As amostras foram analisadas em analisador bioquímico automático, da marca Randox, modelo RX Daytona. Observou-se, ureia 22,78 ± 0,84 mg/dL e 29,03 ± 0,92 mg/dL, creatinina 1,61 ± 0,05 mg/dL e 1,39 ± 0,03 mg/dL, relação ureia/creatinina 16,07 ± 0,76 e 21,16 ± 0,75 mg/dL; aspartato alanina quinase (AST), 57,84 ± 3,06 U/L e 22,91 ± 0,99 U/L; gama-glutamil transferase (GGT) 1294,05 ± 152,37 U/L e 287,26 ± 28,05 U/L; fosfatase alcalina (FA) 2311,63 ± 146,22 e 836,05 ± 41,07 U/L e creatina quinase (CK) 223,47 ± 30,73 mg/dL e 64,82 ± 9,18 mg/dL; proteína total 6,43 ± 0,09 g/dL e 5,68 ± 0,05 g/dL; albumina 2,82 ± 0,02 g/dL e 2,63 ± 0,01 g/dL; globulina 3,61 ± 0,09 g/dL e 3,06 ± 0,05 g/dL e relação albumina/globulina 0,90 ± 0,04 e 0,90 ± 0,02; colesterol 74,00 ± 3,63 mg/dL e 56,31 ± 2,84 mg/dL; triglicérides 35,18 ± 1,98 mg/dL e 38,71 ± 2,79 mg/dL; glicose 126,72 ± 3,30 mg/dL e 106,70 ± 2,88 mg/dL e lactato 26,27 ± 0,98 mg/dL e 30,71 ± 1,61 mg/dL ; cálcio 10,74 ± 0,07 mg/dL e 10,63 ± 0,08 mg/dL; fósforo 8,96 ± 0,13 mg/dL e 9,87 ± 0,20 mg/dL, para o grupo de bezerros de parto normal e bezerros clonados, respectivamente. Apesar de bezerros clonados da raça Nelore apresentaram perfil bioquímico dentro dos valores fisiológicos descritos na literatura observou-se importantes e significativas diferenças no seu metabolismo, principalmente, na primeira semana de vida. / The metabolic profile is used in clinical medicine with the purpose of assisting in the study of metabolic diseases origin, allowing early diagnosis of metabolic abnormalities and also aids the evaluation of major organs functionality. The somatic cell nuclear transfer (SCNT - cloning), despite showing positive results, still has low efficiency and it is associated with high embryonic, fetal and postnatal mortality. It has been observed in the first week of life, especially in the first 24-48 hours, that a large number of calves die due to neonatal adaptation disorders. Among these, placental disorders and malformations have been related to biochemical changes, possibly being the major cause of deaths in clones. This study aimed to evaluate the influence of age on the concentrations of serum biochemical parameters of Nellore calves born through normal delivery, compared with cloned ones, from birth to 30 days of life. Twenty Nellore calves were used in this study and 13 blood samples of each animal were collected at the following periods: at birth, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 240, 360, 480 and 720 hours of life. Serum values for kidney and liver function, proteins, lipid and minerals were determined. The samples were analyzed with a biochemical automatic analyzer, Randox brand, model RX Daytona. It was observed: urea 22.78 ± 0.84 mg/dL and 29.03 ± 0.92 mg/dL, creatinine 1.61 ± 0.05 mg/dL and 1.39 ± 0.03 mg/dL urea / creatinine 16.07 ± 0.76 and 21.16 ± 0.75 mg/dL; alanine aspartate kinase (AST) 57.84 ± 3.06 U/L and 22.91 ± 0.99 U/L; gamma-glutamyl transferase (GGT) 1294.05 ± 152.37 U/L and 287.26 ± 28.05 U/L; alkaline phosphatase (ALP) 2311.63 ± 146.22 and 836.05 ± 41.07 U/L and creatine kinase (CK) 223.47 ± 30.73 mg/dL and 64.82 ± 9.18 mg/dL ; total protein 6.43 ± 0.09 g/dL and 5.68 ± 0.05 g/dL; albumin 2.82 ± 0.02 g/dL and 2.63 ± 0.01 g/dL; globulin 3.61 ± 0.09 g/dL and 3.06 ± 0.05 g/dL and the albumin/globulin 0.90 ± 0.04 and 0.90 ± 0.02; cholesterol 74.00 ± 3.63 mg/dL and 56.31 ± 2.84 mg/dL; triglycerides 35.18 ± 1.98 mg/dL and 38.71 ± 2.79 mg/dL; glucose 126.72 ± 3.30 mg/dL and 106.70 ± 2.88 mg/dL; lactate 26.27 ± 0.98 mg/dL and 30.71 ± 1.61 mg/dL; Calcium 10.74 ± 0.07 mg/dL and 10.63 ± 0.08 mg/dL; phosphorus 8.96 ± 0.13 mg/dL and 9.87 ± 0.20 mg/dL for the group of normal delivery and cloned calves, respectively. Although cloned calves Nellore showed biochemical profile within the physiological range described in the literature and observed important differences in their metabolism, especially in the first week of life.

A presente pesquisa teve a finalidade de padronizar a técnica de cardiotocografia a ser utilizada para avaliar a existência de hipóxia/sofrimento fetal durante a vida intrauterina, procurando estabelecer a partir do 7º mês da gestação os padrões de normalidade da frequência cardíaca fetal para fetos sadios e oriundos de inseminação artificial, bem como avaliar a influência da clonagem nos parâmetros obtidos no exame de cardiotocografia. Foram acompanhadas as gestações de 14 vacas, sendo os animais divididos em três grupos experimentais: Grupo de Clones Mortos composto de 5 vacas gestantes nas quais acompanhou-se a carditocografia de fetos gerados pela técnica de clonagem e nos quais a morte do bezerro ocorreu nas primeiras 36 horas de vida ; Grupo de Clones Vivos composto de 4 vacas gestantes nas quais acompanhou-se a carditocografia de fetos gerados pela técnica de clonagem e que permaneceram vivos após o nascimento; Grupo Controle - composto de 5 vacas gestantes nas quais acompanhou-se a carditocografia de fetos gerados por inseminação artificial e que deram origem a bezerros sadios. Os animais foram acompanhados por exames periódicos de cardiotocografia realizados nos seguintes momentos: 90, 60, 30, 15, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 dia antes do parto e no dia do parto. Para a realização dos exames foi utilizado o aparelho de cardiotocografia da marca Philips modelo Avalon FM30,no local onde as vacas se encontravam. Os exames tiveram uma duração de 20 a 40 minutos de traçado, sendo que o transdutor de ultra-som era acomodado de forma a obter o melhor sinal cardíaco fetal. Imediatamente após o nascimento, realizou-se a avaliação da viabilidade de bezerros recém-nascidos pelo método APGAR e a observação de bezerros tingidos de amarelo em decorrência da presença de mecônio nas secreções uterinas.Através dos traçados obtidos com a cardiotocografia foram analisados os parâmetros da cardiotocografia: linha de base, acelerações transitórias, acelerações prolongadas, variabilidade, taquicardia, bradicardia e desacelerações, sendo ao final calculado o índice cardiotocométrico. Nos animais classificados como hipoativo ou inativo aplicava-se estimulação por palpação retal com beliscamento do espaço interdigital do feto com o objetivo de modificar o comportamento fetal e evitar resultados falso positivos.O exame de cardiotocografia mostrou ser eficaz na avaliação da vitalidade fetal na espécie bovina. Os valores médios e o desvio padrão da frequência cardíaca fetal basal (linha de base) em fetos hígidos foi igual a 116,4 ± 9,07 bpm. Considerou-se taquicardia uma frequência cardíaca fetal igual ou maior do que 145 bpm e bradicardia uma frequência cardíaca igual ou menor do que 90 bpm. Considerou-se normal para bovinos uma variabilidade com valores situados entre 5 e 15 bpm. Verificou-se que a presença de acelerações transitórias são indicativas de bem estar fetal, sendo que o número de acelerações transitórios consideradas como fisiológicas varia entre 1 e 5. Desacelerações são indicativos da existência de sofrimento fetal, não sendo observadas em animais hígidos. No grupo de clones mortos, existem modificações da carditocografia compatíveis com a ocorrência de sofrimento fetal/ hipóxia intrauterina. Os fetos do grupo de clones mortos apresentaram com maior frequência momentos de hipoatividade fetal do que os fetos do grupo de clones vivos e fetos do grupo controle e os fetos do grupo de clone mortos foram classificados com maior frequência como não reativos ao estímulo de beliscamento das extremidades do que os fetos do grupo controle. Os fetos do grupo de clones mortos apresentaram com mais frequência bradicardia (11,8%) do que a observada no grupo controle (0,00 %). Observou-se que no grupo de clones mortos (1,4 ± 1,6) o número de acelerações transitórias foi significativamente menor do que o observado no grupo de clones vivos (3,50 ± 2,70) e no grupo controle (2,70 ± 1,80). / This research had the purpose to standardize the technique of cardiotocography to be used to assess the presence of hypoxia / fetal distress during intrauterine life, trying to establish from the 7th month of pregnancy the normal range of fetal heart rate in healthy fetuses and from artificial insemination and cloning to evaluate the influence of the parameters obtained in the examination of cardiotocography. Were followed the pregnancies of 14 cows and animals are divided into three experimental groups: Dead Clones Group - composed of 5 pregnant cows which was accompanied the cardiotocography of fetuses generated by the technique of cloning, in which the death occurred in the calf first 36 hours of life; Living Clones Group - composed of 4 pregnant cows which is accompanied cardiotocography of fetuses generated by the technique of cloning and remained alive after the birth, control group - composed of 5 pregnant cows in which follow - the cardiotocography of fetuses generated by artificial insemination and gave rise to healthy calves. The animals were monitored by periodic assessment of cardiotocography performed in the following periods: 90, 60, 30, 15, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 day before parturition and day of birth. For the examinations we used the apparatus of cardiotocography Brand Philips Avalon FM30 model, where the cows were. The tests had a duration of 20 to 40 minutes of track, and the ultrasound transducer was adjusted to obtain the best fetal cardiac signal. Immediately after birth, was held to assess the viability of newborn calves by the method APGAR and the observation of colored yellow calves due to the presence of meconium in the uterine secretions. Through cardiotocography tracings were analyzed with the parameters of cardiotocography : the baseline, acceleration transient, prolonged accelerations, variability, tachycardia, bradycardia, and deceleration modes, and the final calculated the index cardiotocométrico. In the animals classified as inactive or hypoactive stimulation was applied by rectal palpation of the interdigital space with pinch of the fetus with order to modify the behavior and prevent fetal false positives. An examination of cardiotocography has proven effective in evaluation of fetal vitality in the bovine species. The mean values and standard deviation of the baseline fetal heart rate (from baseline) in healthy fetuses was equal to 116.4 ± 9.07 bpm. Tachycardia was considered a fetal heart rate equal to or greater than 145 bpm bradycardia and a heart rate less than or equal to 90 bpm. It was considered normal for cattle variability with values between 5 and 15 bpm. It was found that the presence of transient accelerations are indicative of fetal well-being, and the number of transient accelerations considered physiological ranges between 1 and 5. Deceleration is indicative of the existence of fetal distress and is not observed in healthy animals. In the group of clones dead, there are changes in cardiotocography consistent with the occurrence of fetal distress / intrauterine hypoxia. The fetuses of the group of clones had killed more often moments of fetal hypoactivity than the fetuses of the group of clones live fetuses and the control group and the group of fetuses dead clone were classified more frequently as non-reactive to stimulation of the pinch ends of the fetuses in the control group. The fetuses of the group of dead clones showed bradycardia more often (11.8%) than that observed in the control group (0.00%). It was observed that the group of dead clones (1.4 ± 1.6) the number of transient acceleration was significantly lower than that observed in the group of live clones (3.50 ± 2.70) and the control group (2 , 70 ± 1.80).

O Papilomavírus Bovino do tipo 1 (BPV-1) causa fibropapilomas em bovinos e sarcóide em equinos, associados à expressão de oncoproteínas virais, principalmente E6 e E7. A purificação de oncoproteínas a partir de sistema recombinante possibilita seu estudo. Os objetivos foram expressar o gene E6 do BPV-1, purificar e analisar in silico a proteína recombinante obtida. O amplificado foi clonado em E. coli e os plasmídeos foram sequenciados, confirmando a matriz correta de leitura. Após indução da expressão, a proteína recombinante foi identificada e purificada. A microscopia eletrônica mostrou a formação de corpúsculos de inclusão. As análises in silico apontaram as mutações das sequências gênica e proteica de E6-1 em relação às depositadas. Foi realizada a predição tridimensional da estrutura da proteína recombinante e identificadas as regiões conservadas, antigênicas e capazes de realizar ligações cátion-<font face=\"Symbol\">p. Logo, a proteína recombinante E6 do BPV-1 foi obtida e purificada com sucesso, possibilitando o início de novos experimentos e estudos mais detalhados. / Bovine Papillomavirus type 1 (BPV-1) causes fibropapillomas in cattle and sarcoid in equines, associated with the expression of viral oncoproteins, E6 and E7 particularly. Purification of oncoproteins from recombinant system allows their study. The aim of this study was cloning and expressing BPV-1 E6 gene, purify and analyze in silico recombinant protein. Amplicon was cloned into E. coli and the plasmids were sequenced to confirm the correct reading frame. After induction of expression, the recombinant protein was identified and purified. Electron microscopy showed the inclusion bodies formation. In silico analysis showed mutations in E6-1 gene and protein sequences when there were compared to sequences available in current database. Three-dimensional structure prediction of the recombinant protein was performed and conserved, antigenic and cation-<font face=\"Symbol\">p interaction regions were identified. Therefore, BPV-1 E6 recombinant protein was obtained and successfully purified enabling new experiments and more detailed studies.

Animais hematófagos possuem em sua saliva substâncias que permitem a fluidez do sangue, para o sucesso de sua alimentação. Com isso, têm sido descritos diversos componentes com atividades nos diferentes processos hemostáticos (coagulação, fibrinólise e agregação plaquetária). O complexo salivar da sanguessuga Haementeria depressa vem sendo estudado através de bioquímica clássica e análises transcriptômica e proteômica deste tecido determinaram o perfil dos transcritos e das proteínas produzidas. Dentre os transcritos mais abundantes foram encontrados três clones (H06A09, H06A02 e L02F02) que apresentaram 45%, 87% e 94% de similaridade ao LAPP, um inibidor de agregação plaquetária da sanguessuga Haementeria officinallis, a produção destes componentes pelo tecido foi confirmada pela análise proteômica. O LAPP é um inibidor que age pela via do colágeno e possui cerca de 14 kDa e pI de 4,0 e inibe a ligação da plaqueta ao colágeno tanto pelo epítopo do FvW quanto pelo domínio <font face=\"Symbol\">a2<font face=\"Symbol\">b1. Assim, o objetivo do presente trabalho foi clonar, expressar e caracterizar a proteína recombinante ativa, a partir do clone H06A09 para estudos de atividade desta molécula. Para obter a proteína recombinante de interesse inicialmente a clonagem do transcrito foi realizada com sucesso em vetor pAE, porém, a expressão em sistema procarioto apresentou alguns obstáculos já que a molécula não tinha atividade. Uma nova estratégia foi proposta, sendo realizada clonagem em vetor pPIC9K e expressão em sistema eucariótico (leveduras Pichia pastoris - GS115). Após a utilização de diferentes metodologias para estabelecimento das melhores condições para expressão neste sistema, foi eleito o protocolo onde a proteína recombinante era expressa a 28 °C, sob agitação de 260 rpm, e indução por 0,5% de Metanol a cada 24h, durante 72h de expressão. A molécula recombinante expressa e secretada foi submetida a diferentes metodologias para purificação, assim, determinou-se que a estratégia utilizada que melhor isolou a proteína foi a submissão do sobrenadante da expressão à diálise e concentração em sistema de ultrafiltração (Amicon 5 kDa Millipore) seguida de uma cromatografia de gel filtração em Superdex 75 (GE), sistema FPLC, com coleta fracionada. Ensaios de agregação plaquetária confirmaram a atividade inibitória da proteína recombinante tanto em sangue total como em PRP (plasma rico em plaqueta) e plaqueta lavada, especificamente quando o agonista era o colágeno, apresentando IC50 para PRP e plaqueta lavada de 20 e 712 ng, respectivamente. Ensaios por citometria de fluxo indicaram que a proteína recombinante, diferente do LAPP, age na inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno, pela ligação à subunidade Ib<font face=\"Symbol\">a do complexo GPIb-IX-V, complexo este que usa o FvW como ponte entre a plaqueta e o colágeno, firmando assim a interação da plaqueta ao subendotélio e posterior agregação. Desta forma, o presente trabalho caracteriza o primeiro inibidor recombinante de agregação plaquetária pela via do colágeno proveniente de sanguessugas Haementeria depressa, e comprova que apesar de apresentar 45% de similaridade estrutural ao LAPP é um inibidor com características funcionais diferentes, e com grande potencial a ser estudado. / Hematophagous animals have in their saliva substances that maintain the blood fluidity to the success of their feeding. Therefore, components have been described by their activities in the hemostatic processes (coagulation, fibrinolysis and platelet aggregation).The salivary complex of Haementaria depressa leech has been studied by classical biochemical and transcriptomic and proteomic analysis of this tissue determined the profile of transcripts and proteins produced by it. Among the most abundant transcripts were found three clones (H06A09, H06A02 e L02F02) that showed 45%, 87% e 94% of similarity to LAPP, an inhibitor of platelet aggregation from Haementeria officinallis, the components production was confirmed by proteomic analysis. LAPP is a inhibitor that acts by collagen pathway and has around 14 kDa and pI of 4.0, and inhibits the binding of platelet to collagen by both the epitope domain of vWF as the <font face=\"Symbol\">a2<font face=\"Symbol\">b1. Thereby, the aim of this study was to clone, express and characterize the active recombinant protein from the clone H06A09 for studies of activity of this molecule. To obtain the recombinant protein initially cloning of transcript was successfully performed in pAE vector, however, the protein expressed in prokaryotic system presented some obstacles not presenting activity. A new strategy was proposed, being held in pPIC9K vector and expression in eukaryotic system - yeast Pichia pastoris (GS115). After using different methodologies to establish the best conditions for expression in this system, was elected the protocol where the recombinant protein was expressed in 28 °C, under agitation of 260 rpm, and 0.5% methanol induction every 24 hours during 72 hours of expression. The recombinant molecule was expressed in soluble portion and was subjected to differents methods for purification, so it was determined that the best strategy to isolation of the protein was the concentration and dialysis of the expression supernatant by ultrafiltration system (Amicon 5 kDa Millipore) followed by gel filtration chromatography on Superdex 75 (GE), FPLC system. Tests confirmed the platelet aggregation inhibitory activity of the recombinant protein in whole blood, PRP (platelet rich plasma) and in washed platelets, specifically when the agonist was collagen, with IC50 to PRP and washed platelet of 20 and 712 ng, respectively. Assays by flow cytometry indicated that the recombinant protein, different from LAPP, acts to inhibit platelet aggregation induced by collagen, by the binding to the Ib<font face=\"Symbol\">a subunit of the GPIb-IX-V complex, this complex uses the vWF as a bridge between the platelet and collagen, thus firming the interaction of the subendothelium and subsequent platelet aggregation. Thus, this study characterized the first recombinant inhibitor of platelet aggregation through collagen pathway from Haementeria depressa leeches, and proves that despite having 45% structural similarity to the LAPP is an inhibitor with different functional characteristics, and with great potential to be studied.

Animais hematófagos possuem em sua saliva substâncias que permitem a fluidez do sangue, para o sucesso de sua alimentação. Com isso, têm sido descritos diversos componentes com atividades nos diferentes processos hemostáticos (coagulação, fibrinólise e agregação plaquetária). O complexo salivar da sanguessuga Haementeria depressa vem sendo estudado através de bioquímica clássica e análises transcriptômica e proteômica deste tecido determinaram o perfil dos transcritos e das proteínas produzidas. Dentre os transcritos mais abundantes foram encontrados três clones (H06A09, H06A02 e L02F02) que apresentaram 45%, 87% e 94% de similaridade ao LAPP, um inibidor de agregação plaquetária da sanguessuga Haementeria officinallis, a produção destes componentes pelo tecido foi confirmada pela análise proteômica. O LAPP é um inibidor que age pela via do colágeno e possui cerca de 14 kDa e pI de 4,0 e inibe a ligação da plaqueta ao colágeno tanto pelo epítopo do FvW quanto pelo domínio <font face=\"Symbol\">a2<font face=\"Symbol\">b1. Assim, o objetivo do presente trabalho foi clonar, expressar e caracterizar a proteína recombinante ativa, a partir do clone H06A09 para estudos de atividade desta molécula. Para obter a proteína recombinante de interesse inicialmente a clonagem do transcrito foi realizada com sucesso em vetor pAE, porém, a expressão em sistema procarioto apresentou alguns obstáculos já que a molécula não tinha atividade. Uma nova estratégia foi proposta, sendo realizada clonagem em vetor pPIC9K e expressão em sistema eucariótico (leveduras Pichia pastoris - GS115). Após a utilização de diferentes metodologias para estabelecimento das melhores condições para expressão neste sistema, foi eleito o protocolo onde a proteína recombinante era expressa a 28 °C, sob agitação de 260 rpm, e indução por 0,5% de Metanol a cada 24h, durante 72h de expressão. A molécula recombinante expressa e secretada foi submetida a diferentes metodologias para purificação, assim, determinou-se que a estratégia utilizada que melhor isolou a proteína foi a submissão do sobrenadante da expressão à diálise e concentração em sistema de ultrafiltração (Amicon 5 kDa Millipore) seguida de uma cromatografia de gel filtração em Superdex 75 (GE), sistema FPLC, com coleta fracionada. Ensaios de agregação plaquetária confirmaram a atividade inibitória da proteína recombinante tanto em sangue total como em PRP (plasma rico em plaqueta) e plaqueta lavada, especificamente quando o agonista era o colágeno, apresentando IC50 para PRP e plaqueta lavada de 20 e 712 ng, respectivamente. Ensaios por citometria de fluxo indicaram que a proteína recombinante, diferente do LAPP, age na inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno, pela ligação à subunidade Ib<font face=\"Symbol\">a do complexo GPIb-IX-V, complexo este que usa o FvW como ponte entre a plaqueta e o colágeno, firmando assim a interação da plaqueta ao subendotélio e posterior agregação. Desta forma, o presente trabalho caracteriza o primeiro inibidor recombinante de agregação plaquetária pela via do colágeno proveniente de sanguessugas Haementeria depressa, e comprova que apesar de apresentar 45% de similaridade estrutural ao LAPP é um inibidor com características funcionais diferentes, e com grande potencial a ser estudado. / Hematophagous animals have in their saliva substances that maintain the blood fluidity to the success of their feeding. Therefore, components have been described by their activities in the hemostatic processes (coagulation, fibrinolysis and platelet aggregation).The salivary complex of Haementaria depressa leech has been studied by classical biochemical and transcriptomic and proteomic analysis of this tissue determined the profile of transcripts and proteins produced by it. Among the most abundant transcripts were found three clones (H06A09, H06A02 e L02F02) that showed 45%, 87% e 94% of similarity to LAPP, an inhibitor of platelet aggregation from Haementeria officinallis, the components production was confirmed by proteomic analysis. LAPP is a inhibitor that acts by collagen pathway and has around 14 kDa and pI of 4.0, and inhibits the binding of platelet to collagen by both the epitope domain of vWF as the <font face=\"Symbol\">a2<font face=\"Symbol\">b1. Thereby, the aim of this study was to clone, express and characterize the active recombinant protein from the clone H06A09 for studies of activity of this molecule. To obtain the recombinant protein initially cloning of transcript was successfully performed in pAE vector, however, the protein expressed in prokaryotic system presented some obstacles not presenting activity. A new strategy was proposed, being held in pPIC9K vector and expression in eukaryotic system - yeast Pichia pastoris (GS115). After using different methodologies to establish the best conditions for expression in this system, was elected the protocol where the recombinant protein was expressed in 28 °C, under agitation of 260 rpm, and 0.5% methanol induction every 24 hours during 72 hours of expression. The recombinant molecule was expressed in soluble portion and was subjected to differents methods for purification, so it was determined that the best strategy to isolation of the protein was the concentration and dialysis of the expression supernatant by ultrafiltration system (Amicon 5 kDa Millipore) followed by gel filtration chromatography on Superdex 75 (GE), FPLC system. Tests confirmed the platelet aggregation inhibitory activity of the recombinant protein in whole blood, PRP (platelet rich plasma) and in washed platelets, specifically when the agonist was collagen, with IC50 to PRP and washed platelet of 20 and 712 ng, respectively. Assays by flow cytometry indicated that the recombinant protein, different from LAPP, acts to inhibit platelet aggregation induced by collagen, by the binding to the Ib<font face=\"Symbol\">a subunit of the GPIb-IX-V complex, this complex uses the vWF as a bridge between the platelet and collagen, thus firming the interaction of the subendothelium and subsequent platelet aggregation. Thus, this study characterized the first recombinant inhibitor of platelet aggregation through collagen pathway from Haementeria depressa leeches, and proves that despite having 45% structural similarity to the LAPP is an inhibitor with different functional characteristics, and with great potential to be studied.