A técnica de transferência nuclear é uma ferramenta que possibilita a produção de embriões clones que podem ser utilizados tanto na clonagem reprodutiva, proporcionando o nascimento de produtos, como modelo para o estudo de diversos mecanismos fisiológicos durante o desenvolvimento embrionário. Este trabalho teve como objetivos a otimização da técnica de clonagem no Laboratório de Embriologia e Biotécnicas de Reprodução (FAVET, UFRGS), avaliar a taxa de sucesso da clonagem interespécie, e testar e eficiência da utilização de oócitos vitrificados como citoplasmas receptores para a reconstrução dos embriões clones, sendo realizado em três etapas. A primeira teve por objetivo o estabelecimento da técnica de clonagem, bem como sua otimização nas nossas condições, dando condições para que os experimentos subseqüentes pudessem ser realizados. Para isto foram realizados experimentos in vitro comparando diferentes meios de manipulação, sistemas de ativação química, meios de cultivo e fontes protéicas no cultivo dos embriões, e células oriundas de diferentes origens e animais como doadores de núcleo. Os resultados obtidos in vitro alcançaram taxas de 64,7% de clivagem e de 19,5% de blastocistos. Um grupo de embriões foi transferido para receptoras (n=24), e foram observadas 54,2% de prenhezes aos 35 dias, 8,3% de prenhezes aos 260 dias e 4,2% de nascimentos. Os resultados obtidos in vitro alcançaram taxas de 64,7% de clivagem e de 19,5% de blastocistos. Um grupo de embriões foi transferido para receptoras (n=24), e foram observadas 54,2% de prenhezes aos 35 dias, 8,3% de prenhezes aos 260 dias e 4,2% de nascimentos.A segunda parte dos experimentos teve por objetivo a produção de clones interespécies utilizando o citoplasma bovino como receptor para células ovinas, caprinas e suínas. As taxas de clivagem nos grupos NTSCi ovino (60,3%), caprino (68,4%) e suína (57,1%) não diferiram dos grupos controles NTSC bovino. A taxa de blastocisto observada nos embriões NTSCi ovinos (10,3%) foram semelhantes às taxas observadas no grupo NTSC bovino (12,7%). No grupo NTSCi caprino, 5,3% dos embriões chegaram ao estádio de blastocisto, enquanto que no grupo NTSCi suíno não houve desenvolvimento até o estádio de blastocisto. Na terceira parte do trabalho, experimentos visando a utilização de oócitos vitrificados imaturos com citoplasma receptor foram realizados. Foram submetidos a maturação 764 complexos cumuli-oócitos vitrificados, e 73,0% destes foram recuperados após o desnudamento e 46,8% apresentavam corpúsculo polar, taxas significativamente inferiores às observadas nos oócitos não vitrificados (91,4% e 65,8%, respectivamente). As taxas de sobrevivência após a micromanipulação (77,8%), taxa de fusão (82,1%) e de sobrevivência após a ativação (79,9%) do grupo vitrificado não apresentaram diferença significativa com o grupo controle não vitrificado. As taxas de blastocistos também não apresentaram diferença entre os grupos vitrificado e não vitrificado (16,7% e 23,4%) respectivamente. Em resumo, os resultados deste trabalho demonstraram que oócitos bovinos frescos ou vitrificados, nas nossas condições estabelecidas, foram capazes de suportar o desenvolvimento de embriões clones bovinos até o estádio de blastocisto ou a termo, e proporcionam citoplasmas compatíveis para o desenvolvimento de embriões clones interespécie até o estádio de blastócito. / Somatic cell nuclear transfer (NTCS) procedures is a valuable tool for the production of clone embryos for use in reproductive cloning, by providing the birth of live animals, and for use as a research model, allowing the study of physiologic mechanisms during the embryonic development. This work aimed to optimize cloning procedures at the Embryology and Reproductive Technology Laboratory (FAVET, UFRGS), to evaluate the success rate of interspecies cloning, and to test the effectiveness of vitrified oocytes as recipient cytoplasm for embryo reconstruction, being carried out in three stages. The first stage was focused on the establishment of the cloning technique and the optimization of procedures and conditions in the lab so that the subsequent experiments could be accomplished. Thus, in vitro experiments were performed to compare different manipulation media, chemical activation systems, manipulating media, source of protein supplementation to the embryo culture media, and distinct cell types and genotypes. The mean cleavage and blastocyst rates obtained after conditions were optimized were 64.7% and 9.5%, respectively. Pregnancy rates on Days 35 and 260 of gestation and calving rate at term following the transfer of a group of embryos to synchronous recipient cows (n=24) were 54.2%, 8.3% and 4.2%, respectively. The second stage of the study evaluated the success rate of the production of interspecies clones (NTSCi) using the bovine oocyte as recipient cytoplasm for transferred nuclei from ovine, caprine or porcine cells. Cleavage rates using ovine (60.3%), caprine (68.4%) and porcine (57.1%) nuclei did not differ from controls (bovine nuclei). Blastocyst rates observed for NTSCi embryos using ovine nuclei (10.3%) were similar to those observed in the bovine NTSC group (12.7%). The NTSCi-caprine group reached a 5.3% blastocyst rate, whereas no development to the blastocyst stage was observed when using porcine cells as nucleus donor. In the third stage of this work, experiments evaluated the efficiency of vitrified bovine oocytes as recipient cytoplasms for cloning by TNCS. Following vitrification and warming, 764 cumulus-oocyte complexes were in vitro-matured. A total of 73.0% was recovered after cumulus removal, with 46.8% presenting visible polar bodies, which were significantly lower than rates observed in non-vitrified oocytes (91.4% and 65.8%, respectively). However, survival rates following micromanipulation (77.8%), fusion rates (82.1%) and survival after activation (79.9%) of oocytes were not different from the control group (non-vitrified oocytes). In addition, blastocyst rates did not differ between vitrified and non-vitrified groups (16.7% and 23.4%, respectively). In summary, results from this study demonstrated that fresh or vitrified bovine oocytes, under our optimized conditions, were able to support development of bovine clone embryos to the blastocyst stage or to term, and provided a compatible cytoplasm for the development of interspecies clone embryos to the blastocyst stage.

A técnica de transferência nuclear é uma ferramenta que possibilita a produção de embriões clones que podem ser utilizados tanto na clonagem reprodutiva, proporcionando o nascimento de produtos, como modelo para o estudo de diversos mecanismos fisiológicos durante o desenvolvimento embrionário. Este trabalho teve como objetivos a otimização da técnica de clonagem no Laboratório de Embriologia e Biotécnicas de Reprodução (FAVET, UFRGS), avaliar a taxa de sucesso da clonagem interespécie, e testar e eficiência da utilização de oócitos vitrificados como citoplasmas receptores para a reconstrução dos embriões clones, sendo realizado em três etapas. A primeira teve por objetivo o estabelecimento da técnica de clonagem, bem como sua otimização nas nossas condições, dando condições para que os experimentos subseqüentes pudessem ser realizados. Para isto foram realizados experimentos in vitro comparando diferentes meios de manipulação, sistemas de ativação química, meios de cultivo e fontes protéicas no cultivo dos embriões, e células oriundas de diferentes origens e animais como doadores de núcleo. Os resultados obtidos in vitro alcançaram taxas de 64,7% de clivagem e de 19,5% de blastocistos. Um grupo de embriões foi transferido para receptoras (n=24), e foram observadas 54,2% de prenhezes aos 35 dias, 8,3% de prenhezes aos 260 dias e 4,2% de nascimentos. Os resultados obtidos in vitro alcançaram taxas de 64,7% de clivagem e de 19,5% de blastocistos. Um grupo de embriões foi transferido para receptoras (n=24), e foram observadas 54,2% de prenhezes aos 35 dias, 8,3% de prenhezes aos 260 dias e 4,2% de nascimentos.A segunda parte dos experimentos teve por objetivo a produção de clones interespécies utilizando o citoplasma bovino como receptor para células ovinas, caprinas e suínas. As taxas de clivagem nos grupos NTSCi ovino (60,3%), caprino (68,4%) e suína (57,1%) não diferiram dos grupos controles NTSC bovino. A taxa de blastocisto observada nos embriões NTSCi ovinos (10,3%) foram semelhantes às taxas observadas no grupo NTSC bovino (12,7%). No grupo NTSCi caprino, 5,3% dos embriões chegaram ao estádio de blastocisto, enquanto que no grupo NTSCi suíno não houve desenvolvimento até o estádio de blastocisto. Na terceira parte do trabalho, experimentos visando a utilização de oócitos vitrificados imaturos com citoplasma receptor foram realizados. Foram submetidos a maturação 764 complexos cumuli-oócitos vitrificados, e 73,0% destes foram recuperados após o desnudamento e 46,8% apresentavam corpúsculo polar, taxas significativamente inferiores às observadas nos oócitos não vitrificados (91,4% e 65,8%, respectivamente). As taxas de sobrevivência após a micromanipulação (77,8%), taxa de fusão (82,1%) e de sobrevivência após a ativação (79,9%) do grupo vitrificado não apresentaram diferença significativa com o grupo controle não vitrificado. As taxas de blastocistos também não apresentaram diferença entre os grupos vitrificado e não vitrificado (16,7% e 23,4%) respectivamente. Em resumo, os resultados deste trabalho demonstraram que oócitos bovinos frescos ou vitrificados, nas nossas condições estabelecidas, foram capazes de suportar o desenvolvimento de embriões clones bovinos até o estádio de blastocisto ou a termo, e proporcionam citoplasmas compatíveis para o desenvolvimento de embriões clones interespécie até o estádio de blastócito. / Somatic cell nuclear transfer (NTCS) procedures is a valuable tool for the production of clone embryos for use in reproductive cloning, by providing the birth of live animals, and for use as a research model, allowing the study of physiologic mechanisms during the embryonic development. This work aimed to optimize cloning procedures at the Embryology and Reproductive Technology Laboratory (FAVET, UFRGS), to evaluate the success rate of interspecies cloning, and to test the effectiveness of vitrified oocytes as recipient cytoplasm for embryo reconstruction, being carried out in three stages. The first stage was focused on the establishment of the cloning technique and the optimization of procedures and conditions in the lab so that the subsequent experiments could be accomplished. Thus, in vitro experiments were performed to compare different manipulation media, chemical activation systems, manipulating media, source of protein supplementation to the embryo culture media, and distinct cell types and genotypes. The mean cleavage and blastocyst rates obtained after conditions were optimized were 64.7% and 9.5%, respectively. Pregnancy rates on Days 35 and 260 of gestation and calving rate at term following the transfer of a group of embryos to synchronous recipient cows (n=24) were 54.2%, 8.3% and 4.2%, respectively. The second stage of the study evaluated the success rate of the production of interspecies clones (NTSCi) using the bovine oocyte as recipient cytoplasm for transferred nuclei from ovine, caprine or porcine cells. Cleavage rates using ovine (60.3%), caprine (68.4%) and porcine (57.1%) nuclei did not differ from controls (bovine nuclei). Blastocyst rates observed for NTSCi embryos using ovine nuclei (10.3%) were similar to those observed in the bovine NTSC group (12.7%). The NTSCi-caprine group reached a 5.3% blastocyst rate, whereas no development to the blastocyst stage was observed when using porcine cells as nucleus donor. In the third stage of this work, experiments evaluated the efficiency of vitrified bovine oocytes as recipient cytoplasms for cloning by TNCS. Following vitrification and warming, 764 cumulus-oocyte complexes were in vitro-matured. A total of 73.0% was recovered after cumulus removal, with 46.8% presenting visible polar bodies, which were significantly lower than rates observed in non-vitrified oocytes (91.4% and 65.8%, respectively). However, survival rates following micromanipulation (77.8%), fusion rates (82.1%) and survival after activation (79.9%) of oocytes were not different from the control group (non-vitrified oocytes). In addition, blastocyst rates did not differ between vitrified and non-vitrified groups (16.7% and 23.4%, respectively). In summary, results from this study demonstrated that fresh or vitrified bovine oocytes, under our optimized conditions, were able to support development of bovine clone embryos to the blastocyst stage or to term, and provided a compatible cytoplasm for the development of interspecies clone embryos to the blastocyst stage.

A técnica de transferência nuclear é uma ferramenta que possibilita a produção de embriões clones que podem ser utilizados tanto na clonagem reprodutiva, proporcionando o nascimento de produtos, como modelo para o estudo de diversos mecanismos fisiológicos durante o desenvolvimento embrionário. Este trabalho teve como objetivos a otimização da técnica de clonagem no Laboratório de Embriologia e Biotécnicas de Reprodução (FAVET, UFRGS), avaliar a taxa de sucesso da clonagem interespécie, e testar e eficiência da utilização de oócitos vitrificados como citoplasmas receptores para a reconstrução dos embriões clones, sendo realizado em três etapas. A primeira teve por objetivo o estabelecimento da técnica de clonagem, bem como sua otimização nas nossas condições, dando condições para que os experimentos subseqüentes pudessem ser realizados. Para isto foram realizados experimentos in vitro comparando diferentes meios de manipulação, sistemas de ativação química, meios de cultivo e fontes protéicas no cultivo dos embriões, e células oriundas de diferentes origens e animais como doadores de núcleo. Os resultados obtidos in vitro alcançaram taxas de 64,7% de clivagem e de 19,5% de blastocistos. Um grupo de embriões foi transferido para receptoras (n=24), e foram observadas 54,2% de prenhezes aos 35 dias, 8,3% de prenhezes aos 260 dias e 4,2% de nascimentos. Os resultados obtidos in vitro alcançaram taxas de 64,7% de clivagem e de 19,5% de blastocistos. Um grupo de embriões foi transferido para receptoras (n=24), e foram observadas 54,2% de prenhezes aos 35 dias, 8,3% de prenhezes aos 260 dias e 4,2% de nascimentos.A segunda parte dos experimentos teve por objetivo a produção de clones interespécies utilizando o citoplasma bovino como receptor para células ovinas, caprinas e suínas. As taxas de clivagem nos grupos NTSCi ovino (60,3%), caprino (68,4%) e suína (57,1%) não diferiram dos grupos controles NTSC bovino. A taxa de blastocisto observada nos embriões NTSCi ovinos (10,3%) foram semelhantes às taxas observadas no grupo NTSC bovino (12,7%). No grupo NTSCi caprino, 5,3% dos embriões chegaram ao estádio de blastocisto, enquanto que no grupo NTSCi suíno não houve desenvolvimento até o estádio de blastocisto. Na terceira parte do trabalho, experimentos visando a utilização de oócitos vitrificados imaturos com citoplasma receptor foram realizados. Foram submetidos a maturação 764 complexos cumuli-oócitos vitrificados, e 73,0% destes foram recuperados após o desnudamento e 46,8% apresentavam corpúsculo polar, taxas significativamente inferiores às observadas nos oócitos não vitrificados (91,4% e 65,8%, respectivamente). As taxas de sobrevivência após a micromanipulação (77,8%), taxa de fusão (82,1%) e de sobrevivência após a ativação (79,9%) do grupo vitrificado não apresentaram diferença significativa com o grupo controle não vitrificado. As taxas de blastocistos também não apresentaram diferença entre os grupos vitrificado e não vitrificado (16,7% e 23,4%) respectivamente. Em resumo, os resultados deste trabalho demonstraram que oócitos bovinos frescos ou vitrificados, nas nossas condições estabelecidas, foram capazes de suportar o desenvolvimento de embriões clones bovinos até o estádio de blastocisto ou a termo, e proporcionam citoplasmas compatíveis para o desenvolvimento de embriões clones interespécie até o estádio de blastócito. / Somatic cell nuclear transfer (NTCS) procedures is a valuable tool for the production of clone embryos for use in reproductive cloning, by providing the birth of live animals, and for use as a research model, allowing the study of physiologic mechanisms during the embryonic development. This work aimed to optimize cloning procedures at the Embryology and Reproductive Technology Laboratory (FAVET, UFRGS), to evaluate the success rate of interspecies cloning, and to test the effectiveness of vitrified oocytes as recipient cytoplasm for embryo reconstruction, being carried out in three stages. The first stage was focused on the establishment of the cloning technique and the optimization of procedures and conditions in the lab so that the subsequent experiments could be accomplished. Thus, in vitro experiments were performed to compare different manipulation media, chemical activation systems, manipulating media, source of protein supplementation to the embryo culture media, and distinct cell types and genotypes. The mean cleavage and blastocyst rates obtained after conditions were optimized were 64.7% and 9.5%, respectively. Pregnancy rates on Days 35 and 260 of gestation and calving rate at term following the transfer of a group of embryos to synchronous recipient cows (n=24) were 54.2%, 8.3% and 4.2%, respectively. The second stage of the study evaluated the success rate of the production of interspecies clones (NTSCi) using the bovine oocyte as recipient cytoplasm for transferred nuclei from ovine, caprine or porcine cells. Cleavage rates using ovine (60.3%), caprine (68.4%) and porcine (57.1%) nuclei did not differ from controls (bovine nuclei). Blastocyst rates observed for NTSCi embryos using ovine nuclei (10.3%) were similar to those observed in the bovine NTSC group (12.7%). The NTSCi-caprine group reached a 5.3% blastocyst rate, whereas no development to the blastocyst stage was observed when using porcine cells as nucleus donor. In the third stage of this work, experiments evaluated the efficiency of vitrified bovine oocytes as recipient cytoplasms for cloning by TNCS. Following vitrification and warming, 764 cumulus-oocyte complexes were in vitro-matured. A total of 73.0% was recovered after cumulus removal, with 46.8% presenting visible polar bodies, which were significantly lower than rates observed in non-vitrified oocytes (91.4% and 65.8%, respectively). However, survival rates following micromanipulation (77.8%), fusion rates (82.1%) and survival after activation (79.9%) of oocytes were not different from the control group (non-vitrified oocytes). In addition, blastocyst rates did not differ between vitrified and non-vitrified groups (16.7% and 23.4%, respectively). In summary, results from this study demonstrated that fresh or vitrified bovine oocytes, under our optimized conditions, were able to support development of bovine clone embryos to the blastocyst stage or to term, and provided a compatible cytoplasm for the development of interspecies clone embryos to the blastocyst stage.

O objetivo deste estudo foi avaliar a viabilidade in vitro e in vivo de embriões bovinos reconstruídos com oócitos enucleados em Metáfase II e núcleos de células somáticas (fibroblastos) fetais e adultas. Para tanto, oócitos de ovários colhidos em matadouro foram maturados in vitro por 17 horas e enucleados pela remoção do primeiro corpúsculo polar (CP) e da região do oolema contendo a placa metafásica. Como núcleo doador, foram utilizados fibroblastos de orelha de vaca da raça Nelore e de feto colhido em abatedouro. Para a reconstrução dos embriões, cada célula doadora de núcleo, após indução à G0, foi inserida sob a zona pelúcida de cada oócito enucleado e o complexo citoplasma receptor - núcleo doador (CCN) fundido e ativado por eletrofusão (2 pulsos de 4 KV/cm durante 20µs). Após ativação elétrica, cada CCN foi incubado em solução de ciclohexemide (10µg/ml) e citocalasina D (2,5µg/ml) por 1 hora e, em seguida, em solução de ciclohexemide (10µg/ml) por mais 4 horas. Os embriões reconstruídos e ativados, assim como os fecundados in vitro (controle), foram co-cultivados em monocamada de células da granulosa e TCM 199 acrescido de 10% de SFB por 7-9 dias. Após o co-cultivo por 7-9 dias, parte dos embriões (controle e reconstruídos) foi fixada e corada para determinação do número de células e parte transferida para receptoras. Um total de 668 embriões foram reconstruídos com célula fetal e 569 com fibroblasto adulto. Após eletrofusão, 212 embriões reconstruídos com célula fetal e 181 com célula adulta fundiram e 32 (15,1%) e 30 (16,6%) atingiram o estádio de blastocisto, respectivamente. O número médio de células dos blastocistos foi 129,3, 101,3 e 114,3, respectivamente, para célula fetal, adulta e embriões FIV (controle), não havendo diferença estatística significante entre os grupos (P<0,05). Após a transferência de 18 blastocistos de célula fetal e 21 de célula adulta, as taxas de prenhez aos 90 dias foram 16,7% (3) e 19% (4), respectivamente, não havendo diferença estatística significante entre os grupos (P<0,05). A primeira prenhez com célula fetal deu origem a um bezerro saudável, aos 290 dias, pesando 34kg. Uma das receptoras morreu aos 229 dias de gestação em conseqüência de hidroalantóide e outra abortou aos 252 dias. As prenhezes de embriões reconstruídos com célula adulta ainda estão em andamento. Estes resultados indicam que fibroblastos fetal e adulto podem ser usados como doadores de núcleo com semelhantes taxas de desenvolvimento in vitro e in vivo. / The aim of this study was to evaluate the in vitro and in vivo viability of bovine nuclear transferred embryos from metaphase II oocytes and fetal and adult fibroblasts. Oocytes from ovaries collected at slaughterhouse were matured in vitro for 17 hours and enucleated after aspiration of first polar body (PB) and small volume of cytoplasm containing metaphase plate. Fibroblasts from Nelore cow and foetus collected at slaughterhouse were used as nuclei donor. In Nuclear Transfer, each nuclei donor cell, after serum starvation, was inserted under the zona pellucida of the each enucleated oocyte and the enucleated oocyte- nuclei donor cell complexes were electrofused and activated (2 pulses of 4KV/cm for 20µs). After electrical activation, the couplets were incubated in TCM199 plus 10% FCS supplemented with cycloheximide (10µg/ml) and cytochalasin D (2.5µgml) for 1 hour and cycloheximide alone for further 4 hours. The activated reconstructed embryos, as well as IVF embryos (control group), were co-cultured with granulosa cells in TCM 199 + 10% FCS for 7–9 days. After co-cultured, part of embryos (control and reconstructed) was fixed and the number of cells counted and part was transferred into recipients. A total of 668 couplets were reconstructed from fetal and 569 from adult fibroblasts. After electrofusion, 212 (fetal cells) and 181 (adult cells) embryos got fused and 32 (15.1%) and 30 (16.6%) reached blastocyst stage, respectively. The blastocyst cell number means were 129.3, 101.3 and 114.3, respectively, for fetal, adult and IVF (control) embryos. There was no significant difference (P<0.05) in the number of cells of blastocysts among the groups. After transferring 18 (fetal cells) and 21 (adult cells) blastocysts, pregnancy rates at day 90 were 16.7% (3) and 19% (4), respectively. There was no significant difference (P<0.05) between pregnancy rates. The first pregnancy from fetal cells delivered a healthy male calf at day 290, weighting 34kg. One of the remaining recipients died with hydrallantois at day 229 and the other aborted at day 252. The pregnancies of adult cells reconstructed embryos are still in course. These results indicated that fetal and adult fibroblasts could be used as nuclei donor, with similar rates of in vitro and in vivo developments.

A presente pesquisa teve a finalidade de padronizar a técnica de cardiotocografia a ser utilizada para avaliar a existência de hipóxia/sofrimento fetal durante a vida intrauterina, procurando estabelecer a partir do 7º mês da gestação os padrões de normalidade da frequência cardíaca fetal para fetos sadios e oriundos de inseminação artificial, bem como avaliar a influência da clonagem nos parâmetros obtidos no exame de cardiotocografia. Foram acompanhadas as gestações de 14 vacas, sendo os animais divididos em três grupos experimentais: Grupo de Clones Mortos composto de 5 vacas gestantes nas quais acompanhou-se a carditocografia de fetos gerados pela técnica de clonagem e nos quais a morte do bezerro ocorreu nas primeiras 36 horas de vida ; Grupo de Clones Vivos composto de 4 vacas gestantes nas quais acompanhou-se a carditocografia de fetos gerados pela técnica de clonagem e que permaneceram vivos após o nascimento; Grupo Controle - composto de 5 vacas gestantes nas quais acompanhou-se a carditocografia de fetos gerados por inseminação artificial e que deram origem a bezerros sadios. Os animais foram acompanhados por exames periódicos de cardiotocografia realizados nos seguintes momentos: 90, 60, 30, 15, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 dia antes do parto e no dia do parto. Para a realização dos exames foi utilizado o aparelho de cardiotocografia da marca Philips modelo Avalon FM30,no local onde as vacas se encontravam. Os exames tiveram uma duração de 20 a 40 minutos de traçado, sendo que o transdutor de ultra-som era acomodado de forma a obter o melhor sinal cardíaco fetal. Imediatamente após o nascimento, realizou-se a avaliação da viabilidade de bezerros recém-nascidos pelo método APGAR e a observação de bezerros tingidos de amarelo em decorrência da presença de mecônio nas secreções uterinas.Através dos traçados obtidos com a cardiotocografia foram analisados os parâmetros da cardiotocografia: linha de base, acelerações transitórias, acelerações prolongadas, variabilidade, taquicardia, bradicardia e desacelerações, sendo ao final calculado o índice cardiotocométrico. Nos animais classificados como hipoativo ou inativo aplicava-se estimulação por palpação retal com beliscamento do espaço interdigital do feto com o objetivo de modificar o comportamento fetal e evitar resultados falso positivos.O exame de cardiotocografia mostrou ser eficaz na avaliação da vitalidade fetal na espécie bovina. Os valores médios e o desvio padrão da frequência cardíaca fetal basal (linha de base) em fetos hígidos foi igual a 116,4 ± 9,07 bpm. Considerou-se taquicardia uma frequência cardíaca fetal igual ou maior do que 145 bpm e bradicardia uma frequência cardíaca igual ou menor do que 90 bpm. Considerou-se normal para bovinos uma variabilidade com valores situados entre 5 e 15 bpm. Verificou-se que a presença de acelerações transitórias são indicativas de bem estar fetal, sendo que o número de acelerações transitórios consideradas como fisiológicas varia entre 1 e 5. Desacelerações são indicativos da existência de sofrimento fetal, não sendo observadas em animais hígidos. No grupo de clones mortos, existem modificações da carditocografia compatíveis com a ocorrência de sofrimento fetal/ hipóxia intrauterina. Os fetos do grupo de clones mortos apresentaram com maior frequência momentos de hipoatividade fetal do que os fetos do grupo de clones vivos e fetos do grupo controle e os fetos do grupo de clone mortos foram classificados com maior frequência como não reativos ao estímulo de beliscamento das extremidades do que os fetos do grupo controle. Os fetos do grupo de clones mortos apresentaram com mais frequência bradicardia (11,8%) do que a observada no grupo controle (0,00 %). Observou-se que no grupo de clones mortos (1,4 ± 1,6) o número de acelerações transitórias foi significativamente menor do que o observado no grupo de clones vivos (3,50 ± 2,70) e no grupo controle (2,70 ± 1,80). / This research had the purpose to standardize the technique of cardiotocography to be used to assess the presence of hypoxia / fetal distress during intrauterine life, trying to establish from the 7th month of pregnancy the normal range of fetal heart rate in healthy fetuses and from artificial insemination and cloning to evaluate the influence of the parameters obtained in the examination of cardiotocography. Were followed the pregnancies of 14 cows and animals are divided into three experimental groups: Dead Clones Group - composed of 5 pregnant cows which was accompanied the cardiotocography of fetuses generated by the technique of cloning, in which the death occurred in the calf first 36 hours of life; Living Clones Group - composed of 4 pregnant cows which is accompanied cardiotocography of fetuses generated by the technique of cloning and remained alive after the birth, control group - composed of 5 pregnant cows in which follow - the cardiotocography of fetuses generated by artificial insemination and gave rise to healthy calves. The animals were monitored by periodic assessment of cardiotocography performed in the following periods: 90, 60, 30, 15, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 day before parturition and day of birth. For the examinations we used the apparatus of cardiotocography Brand Philips Avalon FM30 model, where the cows were. The tests had a duration of 20 to 40 minutes of track, and the ultrasound transducer was adjusted to obtain the best fetal cardiac signal. Immediately after birth, was held to assess the viability of newborn calves by the method APGAR and the observation of colored yellow calves due to the presence of meconium in the uterine secretions. Through cardiotocography tracings were analyzed with the parameters of cardiotocography : the baseline, acceleration transient, prolonged accelerations, variability, tachycardia, bradycardia, and deceleration modes, and the final calculated the index cardiotocométrico. In the animals classified as inactive or hypoactive stimulation was applied by rectal palpation of the interdigital space with pinch of the fetus with order to modify the behavior and prevent fetal false positives. An examination of cardiotocography has proven effective in evaluation of fetal vitality in the bovine species. The mean values and standard deviation of the baseline fetal heart rate (from baseline) in healthy fetuses was equal to 116.4 ± 9.07 bpm. Tachycardia was considered a fetal heart rate equal to or greater than 145 bpm bradycardia and a heart rate less than or equal to 90 bpm. It was considered normal for cattle variability with values between 5 and 15 bpm. It was found that the presence of transient accelerations are indicative of fetal well-being, and the number of transient accelerations considered physiological ranges between 1 and 5. Deceleration is indicative of the existence of fetal distress and is not observed in healthy animals. In the group of clones dead, there are changes in cardiotocography consistent with the occurrence of fetal distress / intrauterine hypoxia. The fetuses of the group of clones had killed more often moments of fetal hypoactivity than the fetuses of the group of clones live fetuses and the control group and the group of fetuses dead clone were classified more frequently as non-reactive to stimulation of the pinch ends of the fetuses in the control group. The fetuses of the group of dead clones showed bradycardia more often (11.8%) than that observed in the control group (0.00%). It was observed that the group of dead clones (1.4 ± 1.6) the number of transient acceleration was significantly lower than that observed in the group of live clones (3.50 ± 2.70) and the control group (2 , 70 ± 1.80).

O perfil metabólico é usado na clínica médica com a finalidade de ajudar o diagnóstico e permite o diagnóstico precoce de alterações metabólicas e também a funcionalidade dos principais órgãos. A transferência nuclear de células somáticas (TNCS - clonagem), apesar de apresentar resultados positivos, ainda possui baixa eficiência, com alta mortalidade embrionária, fetal e pós-natal. Observa-se na primeira semana de vida principalmente nas primeiras 24-48 horas um grande número de bezerros que morrem, devido a distúrbios de adaptação neonatal. Essas alterações placentárias e más formações determinam alterações bioquímicas que são as causas de muitos óbitos verificados nos clones. Este trabalho teve como objetivo estudar o perfil bioquímico de bezerros Nelore clonados durante os 30 primeiros dias de vida, procurando verificar as possíveis modificações no metabolismo de animais obtidos por transferência nuclear de células somáticas (TNCS - clonagem). Foram utilizados 20 bezerros Nelores e realizou-se de cada animal 13 coletas de sangue nos seguintes momentos: ao nascimento, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 240, 360, 480 e 720 horas de vida. Determinou-se de cada amostra os valores séricos para função renal, função hepática, proteinograma, lipidograma e minerais. As amostras foram analisadas em analisador bioquímico automático, da marca Randox, modelo RX Daytona. Observou-se, ureia 22,78 ± 0,84 mg/dL e 29,03 ± 0,92 mg/dL, creatinina 1,61 ± 0,05 mg/dL e 1,39 ± 0,03 mg/dL, relação ureia/creatinina 16,07 ± 0,76 e 21,16 ± 0,75 mg/dL; aspartato alanina quinase (AST), 57,84 ± 3,06 U/L e 22,91 ± 0,99 U/L; gama-glutamil transferase (GGT) 1294,05 ± 152,37 U/L e 287,26 ± 28,05 U/L; fosfatase alcalina (FA) 2311,63 ± 146,22 e 836,05 ± 41,07 U/L e creatina quinase (CK) 223,47 ± 30,73 mg/dL e 64,82 ± 9,18 mg/dL; proteína total 6,43 ± 0,09 g/dL e 5,68 ± 0,05 g/dL; albumina 2,82 ± 0,02 g/dL e 2,63 ± 0,01 g/dL; globulina 3,61 ± 0,09 g/dL e 3,06 ± 0,05 g/dL e relação albumina/globulina 0,90 ± 0,04 e 0,90 ± 0,02; colesterol 74,00 ± 3,63 mg/dL e 56,31 ± 2,84 mg/dL; triglicérides 35,18 ± 1,98 mg/dL e 38,71 ± 2,79 mg/dL; glicose 126,72 ± 3,30 mg/dL e 106,70 ± 2,88 mg/dL e lactato 26,27 ± 0,98 mg/dL e 30,71 ± 1,61 mg/dL ; cálcio 10,74 ± 0,07 mg/dL e 10,63 ± 0,08 mg/dL; fósforo 8,96 ± 0,13 mg/dL e 9,87 ± 0,20 mg/dL, para o grupo de bezerros de parto normal e bezerros clonados, respectivamente. Apesar de bezerros clonados da raça Nelore apresentaram perfil bioquímico dentro dos valores fisiológicos descritos na literatura observou-se importantes e significativas diferenças no seu metabolismo, principalmente, na primeira semana de vida. / The metabolic profile is used in clinical medicine with the purpose of assisting in the study of metabolic diseases origin, allowing early diagnosis of metabolic abnormalities and also aids the evaluation of major organs functionality. The somatic cell nuclear transfer (SCNT - cloning), despite showing positive results, still has low efficiency and it is associated with high embryonic, fetal and postnatal mortality. It has been observed in the first week of life, especially in the first 24-48 hours, that a large number of calves die due to neonatal adaptation disorders. Among these, placental disorders and malformations have been related to biochemical changes, possibly being the major cause of deaths in clones. This study aimed to evaluate the influence of age on the concentrations of serum biochemical parameters of Nellore calves born through normal delivery, compared with cloned ones, from birth to 30 days of life. Twenty Nellore calves were used in this study and 13 blood samples of each animal were collected at the following periods: at birth, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 240, 360, 480 and 720 hours of life. Serum values for kidney and liver function, proteins, lipid and minerals were determined. The samples were analyzed with a biochemical automatic analyzer, Randox brand, model RX Daytona. It was observed: urea 22.78 ± 0.84 mg/dL and 29.03 ± 0.92 mg/dL, creatinine 1.61 ± 0.05 mg/dL and 1.39 ± 0.03 mg/dL urea / creatinine 16.07 ± 0.76 and 21.16 ± 0.75 mg/dL; alanine aspartate kinase (AST) 57.84 ± 3.06 U/L and 22.91 ± 0.99 U/L; gamma-glutamyl transferase (GGT) 1294.05 ± 152.37 U/L and 287.26 ± 28.05 U/L; alkaline phosphatase (ALP) 2311.63 ± 146.22 and 836.05 ± 41.07 U/L and creatine kinase (CK) 223.47 ± 30.73 mg/dL and 64.82 ± 9.18 mg/dL ; total protein 6.43 ± 0.09 g/dL and 5.68 ± 0.05 g/dL; albumin 2.82 ± 0.02 g/dL and 2.63 ± 0.01 g/dL; globulin 3.61 ± 0.09 g/dL and 3.06 ± 0.05 g/dL and the albumin/globulin 0.90 ± 0.04 and 0.90 ± 0.02; cholesterol 74.00 ± 3.63 mg/dL and 56.31 ± 2.84 mg/dL; triglycerides 35.18 ± 1.98 mg/dL and 38.71 ± 2.79 mg/dL; glucose 126.72 ± 3.30 mg/dL and 106.70 ± 2.88 mg/dL; lactate 26.27 ± 0.98 mg/dL and 30.71 ± 1.61 mg/dL; Calcium 10.74 ± 0.07 mg/dL and 10.63 ± 0.08 mg/dL; phosphorus 8.96 ± 0.13 mg/dL and 9.87 ± 0.20 mg/dL for the group of normal delivery and cloned calves, respectively. Although cloned calves Nellore showed biochemical profile within the physiological range described in the literature and observed important differences in their metabolism, especially in the first week of life.

As cepas vacinais rotavírus reassortants G1, G2, G3, G4 e G9 foram obtidas de um rearranjo genético entre cepas humanas de rotavírus do grupo A do sorotipo G (D, DS-1, P, ST-3 e AU32) e a cepa bovina UK-Bovine. Neste estudo, a cepa reassortant de rotavírus IB-BRV-4-G4 foi formulada, em duas condições, sem adjuvante (Esquema 1) e com adjuvante (Esquema 2) para imunização de camundongos Balb/c. Três AcMos da classe IgM foram obtidos da fusão utilizando animais do Esquema 1 e com o esquema 2 foram obtidos 3 AcMos, dois da classe IgA e um da subclasse IgG1. Destes últimos, dois AcMo (IgA) reconheceram somente epitopos conformacionais em teste de Dot-blot. Entretanto, o AcMo 3 (IgG1) foi reativo a proteínas virais também por Western Blotting, em uma região de perfil eletroforético coincidente com a glicoproteína VP7 de rotavírus. Os resultados mostram que o esquema II de imunização resultou em AcMo específicos para o sorotipo G4, sendo o AcMo IgG1 um forte candidato a ser utilizado nos testes de potência da vacina pentavalente de rotavírus do Instituto Butantan. / The rotavirus strain (G1, G2, G3, G4 and G9) were obtained of reassortants between human rotavirus of the group A and G serotypes (D, DS-1, P, ST-3 and AU32) and a strain from bovine (UK-Bovine).In this study, IB-BRV-4-G4 reassortant rotavirus strain was used to immunize Balb/c mice. Two schedules of immunization were used in the animals, one with IB-BRV-4-G4 (E1) and other with rotavirus antigen and adjuvant (E2). Three monoclonal antibodies of IgM class were obtained of cells from mice immunized only with rotavirus antigen (E1) and with (E2) was obtained three monoclonal antibodies, two producers the IgA class and one the IgG1 subclass. The IgA clones were reactive to G4 serotype rotavirus antigen only in the Dot-blot test. The mAb IgG1 was also reactive to viral proteins in a region of electrophoresis profile in the Western blotting test that coincided with the glycoprotein VP7 of rotavirus. The results indicate that the IgG1 obtained is specific to G4 serotype of rotavirus. It is candidate to be for use in the potency test of pentavalent vaccine.

O Papilomavírus Bovino do tipo 1 (BPV-1) causa fibropapilomas em bovinos e sarcóide em equinos, associados à expressão de oncoproteínas virais, principalmente E6 e E7. A purificação de oncoproteínas a partir de sistema recombinante possibilita seu estudo. Os objetivos foram expressar o gene E6 do BPV-1, purificar e analisar in silico a proteína recombinante obtida. O amplificado foi clonado em E. coli e os plasmídeos foram sequenciados, confirmando a matriz correta de leitura. Após indução da expressão, a proteína recombinante foi identificada e purificada. A microscopia eletrônica mostrou a formação de corpúsculos de inclusão. As análises in silico apontaram as mutações das sequências gênica e proteica de E6-1 em relação às depositadas. Foi realizada a predição tridimensional da estrutura da proteína recombinante e identificadas as regiões conservadas, antigênicas e capazes de realizar ligações cátion-<font face=\"Symbol\">p. Logo, a proteína recombinante E6 do BPV-1 foi obtida e purificada com sucesso, possibilitando o início de novos experimentos e estudos mais detalhados. / Bovine Papillomavirus type 1 (BPV-1) causes fibropapillomas in cattle and sarcoid in equines, associated with the expression of viral oncoproteins, E6 and E7 particularly. Purification of oncoproteins from recombinant system allows their study. The aim of this study was cloning and expressing BPV-1 E6 gene, purify and analyze in silico recombinant protein. Amplicon was cloned into E. coli and the plasmids were sequenced to confirm the correct reading frame. After induction of expression, the recombinant protein was identified and purified. Electron microscopy showed the inclusion bodies formation. In silico analysis showed mutations in E6-1 gene and protein sequences when there were compared to sequences available in current database. Three-dimensional structure prediction of the recombinant protein was performed and conserved, antigenic and cation-<font face=\"Symbol\">p interaction regions were identified. Therefore, BPV-1 E6 recombinant protein was obtained and successfully purified enabling new experiments and more detailed studies.

A produção comercial de bovinos produzidos por transferência nuclear de célula somática permitiu o desenvolvimento de novo modelo no estudo da placenta. A necessidade da cesariana para o nascimento do bezerro favorece a coleta das membranas fetais. Alterações como número total de placentônios, tamanho, formato, árvores vilosas, cordão umbilical, assim como alterações no recém nascido já foram mostradas anteriormente. Gestações produzidas por transferência de núcleo freqüentemente apresentam retenção de placenta. Durante a palpação retal após dois dias da cesariana notou-se placentônios sem diminuição no tamanho e sem alteração na consistência. A observação da ausência de regressão levaram à formulação da hipótese de placentônios provenientes de gestações produzidas por transferência de núcleo apresentam menor freqüência de apoptose quando comparados com placentônios provenientes de gestações produzidas por monta natural. Para testar essa hipótese 15 placentônios provenientes de clones e 3 placentônios provenientes de monta natural foram coletados e congelados em nitrogênio líquido. A extração de RNA foi realizada mediante protocolo Trizol (Invitrogen, Brasil) e a reação de trascriptase reversa feita com Kit Impron II (Promega, Brasil), usando 1&micro;g de RNA total. A quantificação relativa foi desenvolvida no &quot;7500 Real Time PCR System&quot; (Applied Biosystems, EUA), em reação de 25&micro;L contendo 1X &quot;Power SYBR Green PCR Master Mix&quot; (Applied Biosystems, EUA), 1&micro;g de cDNA e 0,6&micro;M de cada primer (BAX, BCL2, e GAPDH). Para a quantificação dos genes ITM2B e PI3K, também se utilizou o gene GAPDH como gene endógeno e reação contendo 1x &quot;Taqman Universal Master Mix&quot; (Applied Biosystems, EUA), 40ng de cDNA, 0,72&micro;M de cada primers (ITM2B, PI3K e GAPDH) e 0,2&micro;M de cada sonda. O programa &quot;LinRegPCR&quot; (RAMAKERS et al., 2003) foi usado para o cálculo da eficiência individual de cada reação e para o cálculo estatístico usou-se o programa &quot;REST2005&quot; (PFAFFL et al., 2002). Os resultados mostraram que o gene BAX possui redução da expressão relativa no grupo transferência de núcleo (P=0,04), enquanto os genes BCL2, ITM2B e PI3K foram iguais entre grupo transferência de núcleo e monta natural. A relação BAX/BCL2 foi maior que 1 em 12 dos indivíduos analisados 12/15 (80%). Nenhuma diferença significativa foi encontrada quando comparadas variáveis como sexo, sobrevivência e peso ao nascimento para todos os genes estudados. A redução da expressão do BAX no grupo transferência de núcleo sugere que a apoptose é menor neste grupo e a relação BAX/BCL2 indica que a redução na taxa de morte celular programada pode ser responsável pela redução na taxa de regressão dos placentônios. / The study of placenta from somatic cell nuclear transfer pregnancy originated a new model of study after the commercial production of bovine nuclear transfer clones, this technique requires caesarean section, that allows collection of fetal membranes. Alterations as differences in the placentomes total number, size, villous trees, umbilical cord and new born alterations were already described in NT placenta. These nuclear transfer gestations frequently have placental retention and during rectal palpation two days after caesarean section, we observed placentomes with normal characteristics as before section, suggesting an absence of recending. This information about the receding absence lead us to hypothesize that placentomes produced from nuclear transfer pregnancies show lower frequency of apoptosis thus produced from natural. For testing this hypothesis we collected 15 fragments of placentomes from nuclear transfer fetus and 3 of natural mating. The RNA extraction was performed with Trizol (Invitrogen, Brazil) protocol and the reverse transcriptase by Impon II (Promega, Brazil), using 1µg of total RNA. We performed the real time relative quantification technique in the &quot;7500 SDS System&quot; (Applied Biosystems, USA) to investigate the mRNA expression of BAX, BCL2 as apoptosis genes and GAPDH as endogenous gene, with concentrations of 1X Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA), 1&micro;g of cDNA and 0.6&micro;M of each primer (BAX, BCL2, and GAPDH) in 25&micro;L of total reaction. The ITM2b and PI3K as apoptosis genes and GAPDH as endogenous gene with concentrations of 1x Taqman Universal Master Mix (Applied Biosystems, USA), 40ng of cDNA, 0.72&micro;M of primers (ITM2B, PI3K and GAPDH) and 0.2&micro;M of each probe. The &quot;LinRegPCR&quot; software (RAMAKERS et al., 2003) was used for individual efficiency calculation and the &quot;REST2005&quot; (PFAFFL et all, 2002) software for statistical analysis, using the standard efficiency. The results show that BAX gene is down regulated in the nuclear transfer group (P=0.04), while the BCL2, ITM2B and PI3K are equal in nuclear transfer and natural mating groups. The relation BAX/BCL2 was greater than 1 in 12 nuclear transfer samples 12/15 (80%). No significant difference was found when evaluated variables such as survival, calv sex, birth weight for all studied genes. The lower expression of BAX gene in nuclear transfer groups suggests that apoptosis is lower in this group and the relation BAX/BCL2 is indicative that a lower rate of apoptosis may be responsible for the lower rate of placentome receding.

O objetivo deste estudo foi avaliar a viabilidade in vitro e in vivo de embriões bovinos reconstruídos com oócitos enucleados em Metáfase II e núcleos de células somáticas (fibroblastos) fetais e adultas. Para tanto, oócitos de ovários colhidos em matadouro foram maturados in vitro por 17 horas e enucleados pela remoção do primeiro corpúsculo polar (CP) e da região do oolema contendo a placa metafásica. Como núcleo doador, foram utilizados fibroblastos de orelha de vaca da raça Nelore e de feto colhido em abatedouro. Para a reconstrução dos embriões, cada célula doadora de núcleo, após indução à G0, foi inserida sob a zona pelúcida de cada oócito enucleado e o complexo citoplasma receptor - núcleo doador (CCN) fundido e ativado por eletrofusão (2 pulsos de 4 KV/cm durante 20µs). Após ativação elétrica, cada CCN foi incubado em solução de ciclohexemide (10µg/ml) e citocalasina D (2,5µg/ml) por 1 hora e, em seguida, em solução de ciclohexemide (10µg/ml) por mais 4 horas. Os embriões reconstruídos e ativados, assim como os fecundados in vitro (controle), foram co-cultivados em monocamada de células da granulosa e TCM 199 acrescido de 10% de SFB por 7-9 dias. Após o co-cultivo por 7-9 dias, parte dos embriões (controle e reconstruídos) foi fixada e corada para determinação do número de células e parte transferida para receptoras. Um total de 668 embriões foram reconstruídos com célula fetal e 569 com fibroblasto adulto. Após eletrofusão, 212 embriões reconstruídos com célula fetal e 181 com célula adulta fundiram e 32 (15,1%) e 30 (16,6%) atingiram o estádio de blastocisto, respectivamente. O número médio de células dos blastocistos foi 129,3, 101,3 e 114,3, respectivamente, para célula fetal, adulta e embriões FIV (controle), não havendo diferença estatística significante entre os grupos (P<0,05). Após a transferência de 18 blastocistos de célula fetal e 21 de célula adulta, as taxas de prenhez aos 90 dias foram 16,7% (3) e 19% (4), respectivamente, não havendo diferença estatística significante entre os grupos (P<0,05). A primeira prenhez com célula fetal deu origem a um bezerro saudável, aos 290 dias, pesando 34kg. Uma das receptoras morreu aos 229 dias de gestação em conseqüência de hidroalantóide e outra abortou aos 252 dias. As prenhezes de embriões reconstruídos com célula adulta ainda estão em andamento. Estes resultados indicam que fibroblastos fetal e adulto podem ser usados como doadores de núcleo com semelhantes taxas de desenvolvimento in vitro e in vivo. / The aim of this study was to evaluate the in vitro and in vivo viability of bovine nuclear transferred embryos from metaphase II oocytes and fetal and adult fibroblasts. Oocytes from ovaries collected at slaughterhouse were matured in vitro for 17 hours and enucleated after aspiration of first polar body (PB) and small volume of cytoplasm containing metaphase plate. Fibroblasts from Nelore cow and foetus collected at slaughterhouse were used as nuclei donor. In Nuclear Transfer, each nuclei donor cell, after serum starvation, was inserted under the zona pellucida of the each enucleated oocyte and the enucleated oocyte- nuclei donor cell complexes were electrofused and activated (2 pulses of 4KV/cm for 20µs). After electrical activation, the couplets were incubated in TCM199 plus 10% FCS supplemented with cycloheximide (10µg/ml) and cytochalasin D (2.5µgml) for 1 hour and cycloheximide alone for further 4 hours. The activated reconstructed embryos, as well as IVF embryos (control group), were co-cultured with granulosa cells in TCM 199 + 10% FCS for 7–9 days. After co-cultured, part of embryos (control and reconstructed) was fixed and the number of cells counted and part was transferred into recipients. A total of 668 couplets were reconstructed from fetal and 569 from adult fibroblasts. After electrofusion, 212 (fetal cells) and 181 (adult cells) embryos got fused and 32 (15.1%) and 30 (16.6%) reached blastocyst stage, respectively. The blastocyst cell number means were 129.3, 101.3 and 114.3, respectively, for fetal, adult and IVF (control) embryos. There was no significant difference (P<0.05) in the number of cells of blastocysts among the groups. After transferring 18 (fetal cells) and 21 (adult cells) blastocysts, pregnancy rates at day 90 were 16.7% (3) and 19% (4), respectively. There was no significant difference (P<0.05) between pregnancy rates. The first pregnancy from fetal cells delivered a healthy male calf at day 290, weighting 34kg. One of the remaining recipients died with hydrallantois at day 229 and the other aborted at day 252. The pregnancies of adult cells reconstructed embryos are still in course. These results indicated that fetal and adult fibroblasts could be used as nuclei donor, with similar rates of in vitro and in vivo developments.