Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Disseratacao Francinez Linhares Ferreira.pdf: 858941 bytes, checksum: 47da4fea68bdacd89f05293ec32428c4 (MD5) Previous issue date: 2001-08-23 / RESUMO CAPÍTULO I The araticum (Annona crassiflora Mart.) is a typical brazilian plant found in cerrados of Brazil. This plant contains acetogenins that presents cytotoxic, antitumorigenic, antiparasitic and antimicrobial properties. Its leaves, barks, fruits and seeds are used by the population as therapeutic medicine to treat several diseases as diarrhoea, rheumatism and syphilis. In the present study we have evaluated the mutagenic activity of the crude ethanolic extract of leaves of araticum though quantification of micronuclei induced in mice bone marrow. Doses of 10 mg/kg (5% of LD50), 20 mg/kg (10% of LD50), 50 mg/kg (25% of LD50), 100 mg/kg (50% of LD50) and 160 mg/kg (80% of LD50) were applied i.p. in mice Mus musculus, in groups of 5 (five) animals for each dose. The cytological preparations were made according to Heddle`s methodology. For all the applied doses, frequency of micronucleated polychromatic erythrocytes (MNPCE) was evaluated after 24, 48 and 72 h of treatment. The cytotoxicity was evaluated by ratio the between numbers of polychromatic and normochromatic erythrocytes (PCE/NCE). Ours results indicated an absence of significantly increased of micronuclei for all the doses tested (p>0,01). Thus, we concluded that the phytoterapic araticum did not present mutagenic activity under our experimental conditions. However, the toxic activity was observed upon analysis of LD50 and PCE/NCE ratio. RESUMO CAPÍTULO II Annona crassiflora Mart. (araticum) is a typical brazilian plant found in cerrados of Brazil. This plant contains acetogenins that presents cytotoxic, antitumorigenic, antiparasitc and antimicrobial properties. Its leaves, barks, fruits and seeds are used by the population as therapeutic medicine to treat several diseases as diarrhoea, rheumatism and syphilis. In the present study we have evaluated the antimutagenic activity of the crude ethanolic extract of leaves of araticum through quantification of micronuclei induced in mice bone marrow. Doses of the extract (10mg/kg, 20mg/kg, 50mg/kg, 100mg/kg and 160 mg/kg) and MMC (4mg/kg) were co-applied i.p in mice Mus musculus in groups of 5 (five) animals for each dose. The cytological preparations were made in according to Heddle s methodology. For all the applied doses, frequency of micronucleated polychomatic erythrocytes (MNPCE) was evaluated after 36 h of treatment. The obtained results indicated that the crude ethanol extract from leaves ay doses of 20 mg/kg, 50 mg/kg and 100 mg/kg inhibited significantly reduced frequencies of micronuclei (P<0.01). Thus, we concluded that the phytoterapic araticum exerted an antimutagenic effect. / RESUMO CAPÍTULO I O araticum (Annona crassiflora Mart.) é uma planta tipicamente brasileira encontrada nos cerrados do Brasil. Esta planta contém acetogeninas que apresentam propriedades citotóxica, antitumoral, antiparasitária e antimicrobiana. Suas folhas, cascas, frutos e sementes são utilizadas pela população para tratar várias doenças como diarréia, reumatismo e sífilis. No presente estudo, foi avaliada a atividade mutagênica do extrato bruto etanólico de folhas de araticum pelo teste do micronúcleo na medula óssea de camundongos. Doses de 10 mg/kg (5% da DL50), 20 mg/kg (10% da DL50), 50 mg/kg (25% da DL50), 100 mg/kg (50% da DL50) e 160 mg/kg (80% da DL50) foram aplicadas, intraperitonealmente, em camundongos Mus musculus, em grupos de 5 animais para cada dose. As preparações citológicas foram realizadas em conformidade com a metodologia de Heddle. Para todas as doses aplicadas, a freqüência de eritrócitos policromáticos micronucleados (EPCMN) foi avaliada nos tempos de 24, 48 e 72 h. A citotoxicidade foi avaliada pela relação entre a freqüência de eritrócitos policromáticos e normocromáticos (EPC/ENC). Os resultados obtidos mostraram que o extrato bruto etanólico de folhas, para todas as doses testadas, não aumentou significativamente (p>0,01) a freqüência de eritrócitos policromáticos micronucleados. Dessa maneira, pôde-se concluir que o fitorápico araticum não exibiu atividade mutagênica. Entretanto, a atividade tóxica foi verificada pela DL50 e pela relação EPC/ENC. RESUMO CAPÍTULO II Annona crassiflora Mart. (araticum) é uma planta tipicamente brasileira encontrada nos cerrados do Brasil. Esta planta contém acetogeninas que apresentam propriedades citotóxica, antitumoral, antiparasitária e antimicrobiana. Suas folhas, frutos e sementes são utilizadas pela população como remédio para tratar diversas doenças como diarréia, reumatismo e sífilis. No presente estudo, foi avaliada a atividade antimutagênica do extrato bruto etanólico de folhas de araticum, na medula óssea de camundongos pelo teste do micronúcleo. Doses do extrato de folhas (10 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg e 160 mg/kg) e MMC (4,0 mg/kg) foram co-administradas, via intraperitoneal, em camundongos Mus musculus, em grupos de 5 (cinco) animais para cada dose. As preparações citológicas foram realizadas conforme metodologia de Heddle. Para todas as doses aplicadas, a freqüência de eritrócitos policromáticos micronucleados (EPCMN) foi analisada 36 horas após tratamento. Os resultados obtidos mostraram que o extrato de folhas nas doses de 20 mg/kg, 50 mg/kg e 100 mg/kg inibiram significantemente (P<0,01) a freqüência de micronúcleos (MN) induzidos pela MMC. Dessa forma, concluiu-se que o fitoterápico araticum exerceu efeito antimutagênico.

Made available in DSpace on 2014-07-29T16:21:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Felipe Oliveira Gouveia.pdf: 1496399 bytes, checksum: 82b6a1f0233784168bcbca4f78d3660e (MD5) Previous issue date: 2011-06-21 / The spatial genetic structure is the non-random distribution of genotypes within a population as the outcome of gene flow, genetic drift and selection. Annona crassiflora (Annonaceae) is a hermaphroditic tree. Pollination is entomophilous, being carried by beetles of the genus Cyclocephala (Scarabeidae). Seed dispersal is zoochorous mainly done by Tapirus terrestris. This study aimed to compare the genetic diversity and spatial genetic structure in two populations of Annona crassiflora, one in a conserved area and other in a disturbed area. We analyzed 97 plants from a population at the Ecological Station of Águas Emendadas (ESECAE) in the Federal District (conserved area) and 87 plants in Padre Bernardo (PBE), Goiás (disturbed area), based on eight microsatellite loci developed for the species. PCR products were electrophoresed in ABI3100 automatic DNA sequencer to obtain the genotypes. For a total of eight loci, the number of alleles ranged from 6 to 23 with an average of 15,75 alleles per locus.The allelic richness per population was larger in ESECAE population than PBE population. Expected and observed heterozygosity values were 0,614±0,145 and 0,499±0,181, significant f values were found for PBE, showing nonrandom mating. In ESECAE population expected and observed heterozygosity values were 0,746±0,134 and 0,723±0,173 and f value were not significant, suggesting random mating, the allele frequencies are following the expected ratios for the Hardy-Weinberg equilibrium (p<0,003). Analysis of spatial genetic structure in ESECAE population, showed little absence of autocorrelation (b=-0,00478; p<0,05 R2 = 0,001, p = 0,0257). In PBE population, autocorrelation analysis showed that kinship is slightly related to the logarithm of distance, showing a gene flow pattern like isolation by distance (b=-0,01958; p<0,05 R² = 0.001, p <0,0001). The significant value of θ (0,239) showed that populations are highly differentiated. Also, under the bottleneck test, a population does not showed up in mutation-drift equilibrium, reveling events of recent bottleneck effects. The study suggests that the species may be highly affected by fragmentation and disturbance of their natural habitats augmenting inbreeding, and leading to high genetic differentiation among populations and significant spatial structure, that may be the outcome of restriction to gene flow. / A estrutura genética espacial é a distribuição não aleatória de genótipos dentro de uma população como o resultado de fluxo gênico, deriva genética e seleção. Annona crassiflora (Annonaceae) é uma árvore hermafrodita e alógama. A sua polinização é do tipo entomófila, sendo realizada por besouros do gênero Cyclocephala (Scarabeidae). A dispersão de sementes é do tipo zoocórica, realizada principalmente por Tapirus terrestris. O objetivo desse estudo foi estudar e comparar a diversidade e a estrutura genética espacial em duas populações de Annona crassiflora, uma em área de conservação e outra em área antropizada. Foram analisadas 97 plantas provenientes de uma população da Estação Ecológica Águas Emendadas (ESECAE) no Distrito Federal e 87 plantas em Padre Bernardo (PBE) em Goiás, com base em oito locos microssatélites desenvolvidos para a espécie. Os produtos de PCR foram submetidos à análise de fragmentos no seqüenciador ABI3100, para obtenção dos genótipos. Para os oito locos analisados, o número total de alelos foi igual a 126, variando entre 6 e 23 com uma média de 15,75 alelos por loco. A riqueza alélica, por população foi maior na população de ESECAE do que na população de PBE. Foram encontrados valores de f significativos para PBE, o que sugere que existe endogamia, ou seja, há cruzamento de indivíduos aparentados dentro dessa população. Na população de ESECAE foi observado valor de f não significativo indicando ausência de endogamia nesta população, ou seja, as freqüências alélicas estão seguindo as proporções esperadas para o equilíbrio de Hardy-Weinberg. A análise de estrutura genética espacial na população de ESECAE revelou uma tendência de pequena magnitude à estruturação genética espacial (b=-0,00478; R2=0,001; p=0,0257).Na população de PBE, a análise de estrutura genética espacial revelou que o coeficiente de parentesco está relacionado com o logaritmo da distância, apresentando um modelo de fluxo gênico de isolamento por distância (b=-0,01958; R² = 0,001; p < 0,0001).O valor global de F foi significativo e igual a 0,309 e o valor de θ apresentou-se alto e significativo (0,239).Foi encontrada uma pequena diferença entre as estimativas de θ e Rst (p=0,064). Sob o teste de bottleneck as populações não se mostraram em equilíbrio Mutação-Deriva. O estudo revela que a fragmentação pode estar influenciando negativamente a dinâmica evolutiva da espécie. A forte endogamia na área fragmentada, alta diferenciação genética entre as populações e estruturação espacial dos indivíduos permite inferir que a conservação da espécie é de extrema importância, pois além do intenso extrativismo, a espécie possui baixas taxas de frutificação e problemas de germinação. Eventos que favorecem ainda mais probabilidade de extinção.

Considerando o grave quadro das doenças negligenciadas, no Brasil e no mundo, e as limitações do tratamento empregado, na atualidade, torna-se urgente a pesquisa de novos fármacos, que sejam mais ativos e seguros. Para tanto, a busca de moléculas-protótipo, a partir de espécies vegetais, tem sido importante estratégia. Neste contexto, foi realizado o estudo de Annona crassiflora Mart. (Annonaceae), cujos alcalóides totais (AT) demonstraram promissora atividade antiprotozoária in vitro, em estudo anterior. Em paralelo, outras espécies de Annona mostraram atividade antimicobacteriana in vitro, igualmente, tendo motivado o presente estudo. Cinco das vinte frações alcaloídicas obtidas, por cromatografia em coluna, a partir dos AT das folhas, apresentaram atividade anti-Leishmania in vitro, tendo causado 100% de morte das formas promastigotas de Leishmania (L.) infantum chagasi. Além disto, três delas foram ativas frente ao Mycobacterium tuberculosis. O isolamento de dois alcalóides noraporfínicos foi realizado, por fracionamento biomonitorado em coluna cromatográfica, seguido de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) semipreparativa. As estruturas dos compostos isolados foram elucidadas empregando-se as análises espectroscópicas de ressonância magnética nuclear, mono e bidimensionais, e por CLAE acoplada à espectrometria de massas (CLAEIES-EM2). Um dos alcalóides foi identificado pela primeira vez, nesta espécie, sendo que o outro apresentou estrutura inédita. Ambos demonstraram significativa atividade anti-Leishmania in vitro (CE50&#8804; 10 &#181; g/ mL) frente às formas promastigotas de L. (L.) infantum chagasi [MHOM/BR/1972/LD]. O primeiro teve maior índice de seletividade (IS: 7,4), em relação à citotoxicidade em células do tecido conjuntivo NCTC Clone 929 de camundongos. Frente ao Mycobacterium tuberculosis (ATCC 27294) e ao M. smegmatis (ATCC 35798), os alcalóides isolados foram inativos (CIM &#8805; 128 &#181;g/ mL). O óleo volátil das folhas foi analisado por cromatografia gasosa acoplada à espectroscopia de massas (CG-EM), tendo sido identificados 41 constituintes, prevalecendo os sesquiterpenos (81,7%) em relação aos monoterpenos (0,8%). Entre os compostos majoritários encontrados no óleo, citam-se os sesquiterpenos &#945;-amorfeno (43,6%), E-cariofileno (17,7%) e o germacreno (5,3%). Nos testes de atividade anti-Leishmania in vitro frente às formas promastigotas de quatro espécies do parasita, o óleo foi mais ativo em L. (L.) infantum chagasi (CE50: 25,97 &#181;g/ mL). Nas formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi mostrou atividade 8,5 vezes superior àquela do fármaco-padrão benznidazol (CE50: 5,31 &#181;g/ mL). Os resultados obtidos ratificaram a importância da prospecção da flora, em particular de A. crassiflora, como fonte potencial de compostos bioativos, que venham a constituir novos fármacos, como alternativa à restrita terapêutica existente para o tratamento das doenças negligenciadas. / Neglected diseases are a serious health problem in Brazil and worldwide. The available drugs are limited in effectiveness with a high toxicity. There is an urgent need of more safe and bioactive compounds. The search of new molecules from plant species is a well known and important strategy to achieve this goal. In a previous work, Annona crassiflora Mart. (Annonaceae) showed a promising antiprotozoal activity. Beside this, other Annona species presented an interesting antimicobacterial action. In this bio-guided study, after the column fractionation of the leaves total alkaloids, in vitro tests were performed and five from twenty fractions were highly active (100% deaths) against promastigotes of Leishmania (L.) infantum chagasi, and only three were active against Mycobacterium tuberculosis. After purification of the bioactive fractions, two noraporphine alkaloids were isolated by HPLC and identified by the usual mono and bidimensional spectroscopic techniques. One of them was isolated from the first time from this species. The other one is a novel chemical entity. Both compounds presented anti- Leishmania activity (CE50 &#8804; 10 &#181;g/ mL) against L. (L.) infantum chagasi [MHOM/BR/1972/LD]. The first one showed a higher selectivity index (SI: 7.4) considering its mice connective tissue cells toxicity [NCTC Clone 929]. However, both were inactive against Mycobacterium tuberculosis (ATCC 27294) and M. smegmatis (ATCC 35798) (CIM &#8805; 128 &#181;g/ mL). In the leaves volatile oil 41 compounds were identified. The sesquiterpenes were in majority (81.7%), followed by monoterpenes (0.8%). The sesquiterpenes &#945;-amorphene (43.6%), E-caryophyllene (17.7%) and germacrene (5.3%) were the main constituents. The oil was little effective against the four tested Leishmania species and slightly more active against L. (L.) infantum chagasi (CE50: 25.97 &#181;g/ mL). However, it was highly active against the trypomastigotes of Trypanosoma cruzi (CE50: 5.31 &#181;g/ mL) showing to be 8.5 times more active than benznidazol. These results stimulate a deeper investigation of those alkaloids as antiprotozoal agents, confirming the importance of the plant species metabolites as a source of new bioactive molecules and their potential as future drugs.

Considerando o grave quadro das doenças negligenciadas, no Brasil e no mundo, e as limitações do tratamento empregado, na atualidade, torna-se urgente a pesquisa de novos fármacos, que sejam mais ativos e seguros. Para tanto, a busca de moléculas-protótipo, a partir de espécies vegetais, tem sido importante estratégia. Neste contexto, foi realizado o estudo de Annona crassiflora Mart. (Annonaceae), cujos alcalóides totais (AT) demonstraram promissora atividade antiprotozoária in vitro, em estudo anterior. Em paralelo, outras espécies de Annona mostraram atividade antimicobacteriana in vitro, igualmente, tendo motivado o presente estudo. Cinco das vinte frações alcaloídicas obtidas, por cromatografia em coluna, a partir dos AT das folhas, apresentaram atividade anti-Leishmania in vitro, tendo causado 100% de morte das formas promastigotas de Leishmania (L.) infantum chagasi. Além disto, três delas foram ativas frente ao Mycobacterium tuberculosis. O isolamento de dois alcalóides noraporfínicos foi realizado, por fracionamento biomonitorado em coluna cromatográfica, seguido de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) semipreparativa. As estruturas dos compostos isolados foram elucidadas empregando-se as análises espectroscópicas de ressonância magnética nuclear, mono e bidimensionais, e por CLAE acoplada à espectrometria de massas (CLAEIES-EM2). Um dos alcalóides foi identificado pela primeira vez, nesta espécie, sendo que o outro apresentou estrutura inédita. Ambos demonstraram significativa atividade anti-Leishmania in vitro (CE50&#8804; 10 &#181; g/ mL) frente às formas promastigotas de L. (L.) infantum chagasi [MHOM/BR/1972/LD]. O primeiro teve maior índice de seletividade (IS: 7,4), em relação à citotoxicidade em células do tecido conjuntivo NCTC Clone 929 de camundongos. Frente ao Mycobacterium tuberculosis (ATCC 27294) e ao M. smegmatis (ATCC 35798), os alcalóides isolados foram inativos (CIM &#8805; 128 &#181;g/ mL). O óleo volátil das folhas foi analisado por cromatografia gasosa acoplada à espectroscopia de massas (CG-EM), tendo sido identificados 41 constituintes, prevalecendo os sesquiterpenos (81,7%) em relação aos monoterpenos (0,8%). Entre os compostos majoritários encontrados no óleo, citam-se os sesquiterpenos &#945;-amorfeno (43,6%), E-cariofileno (17,7%) e o germacreno (5,3%). Nos testes de atividade anti-Leishmania in vitro frente às formas promastigotas de quatro espécies do parasita, o óleo foi mais ativo em L. (L.) infantum chagasi (CE50: 25,97 &#181;g/ mL). Nas formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi mostrou atividade 8,5 vezes superior àquela do fármaco-padrão benznidazol (CE50: 5,31 &#181;g/ mL). Os resultados obtidos ratificaram a importância da prospecção da flora, em particular de A. crassiflora, como fonte potencial de compostos bioativos, que venham a constituir novos fármacos, como alternativa à restrita terapêutica existente para o tratamento das doenças negligenciadas. / Neglected diseases are a serious health problem in Brazil and worldwide. The available drugs are limited in effectiveness with a high toxicity. There is an urgent need of more safe and bioactive compounds. The search of new molecules from plant species is a well known and important strategy to achieve this goal. In a previous work, Annona crassiflora Mart. (Annonaceae) showed a promising antiprotozoal activity. Beside this, other Annona species presented an interesting antimicobacterial action. In this bio-guided study, after the column fractionation of the leaves total alkaloids, in vitro tests were performed and five from twenty fractions were highly active (100% deaths) against promastigotes of Leishmania (L.) infantum chagasi, and only three were active against Mycobacterium tuberculosis. After purification of the bioactive fractions, two noraporphine alkaloids were isolated by HPLC and identified by the usual mono and bidimensional spectroscopic techniques. One of them was isolated from the first time from this species. The other one is a novel chemical entity. Both compounds presented anti- Leishmania activity (CE50 &#8804; 10 &#181;g/ mL) against L. (L.) infantum chagasi [MHOM/BR/1972/LD]. The first one showed a higher selectivity index (SI: 7.4) considering its mice connective tissue cells toxicity [NCTC Clone 929]. However, both were inactive against Mycobacterium tuberculosis (ATCC 27294) and M. smegmatis (ATCC 35798) (CIM &#8805; 128 &#181;g/ mL). In the leaves volatile oil 41 compounds were identified. The sesquiterpenes were in majority (81.7%), followed by monoterpenes (0.8%). The sesquiterpenes &#945;-amorphene (43.6%), E-caryophyllene (17.7%) and germacrene (5.3%) were the main constituents. The oil was little effective against the four tested Leishmania species and slightly more active against L. (L.) infantum chagasi (CE50: 25.97 &#181;g/ mL). However, it was highly active against the trypomastigotes of Trypanosoma cruzi (CE50: 5.31 &#181;g/ mL) showing to be 8.5 times more active than benznidazol. These results stimulate a deeper investigation of those alkaloids as antiprotozoal agents, confirming the importance of the plant species metabolites as a source of new bioactive molecules and their potential as future drugs.