Orientador: Paulo Eduardo Martins Ribolla / Banca: Henrique M. C. da Silveira / Banca: Alexandre A. Peixoto / Resumo: Estudos recentes vêm elucidando a importância de uma diversidade de proteínas do intestino médio de insetos vetores, tanto nos processos de digestão como em respostas imunológicas e interações parasita-hospedeiro. Este trabalho teve como objetivo analisar a expressão de genes do intestino médio de Anopheles aquasalis, um importante vetor de malária no Brasil, a partir de clones sequenciados de bibliotecas de cDNA de machos e fêmeas alimentados apenas com sacarose. Nas fêmeas, pôde-se notar a grande predominância de serino proteases, proteínas ligantes de quitina e fatores relacionados à imunidade. Os machos também apresentaram diversos peptídeos de defesa imune, porém apenas uma protease digestiva e uma glicosidase. Alguns genes foram selecionados das bibliotecas para estudo de suas expressões durante a vida de An. aquasalis. Tripsina 1, peritrofina 1 e quinurenina 3-monooxigense tiveram seus níveis de expressão aumentados 6h após a ingestão de sangue, analisados através de qRT-PCR. No entanto, o silenciamento desses genes não resultou em alterações na longevidade de fêmeas adulta. O gene da serpina foi expresso em todas as fases do desenvolvimento do mosquito, exceto em ovos; e o gene da cecropina foi expresso em trato digestivo e carcaça de machos e fêmeas, principalmente após alimentação de açúcar ou sangue. Considerando que a ingestão de alimentos é a principal porta de entrada a microorganismos durante a vida adulta destes mosquitos, a presença de diversos produtos antimicrobianos, bem como a precoce expressão de peritrofina, outra proteína relacionada com a proteção do trato digestivo, mostrou que An. aquasalis está bem preparado imunologicamente contra esses microorganismos. Esta proteção está envolvida com o hábito alimentar desta espécie e pode também estar associada à sua baixa capacidade vetorial com relação aos plasmódios. / Abstract: The importance of midgut proteins of Anopheles aquasalis has been elucidated both in digestion process as in immune responses and parasite-host interactions. This project targeted to analyze the midgut genes expression from An. aquasalis, an important malaria vector in Brazil, selecting clones from midgut cDNA library of female and male mosquitoes fed only on sugar. Serine proteases were predominant in females besides chitin binding proteins and immunity factors. Male mosquitoes also showed immune defense peptides, however only one digestive protease and one glucosidase. Some genes were selected from these libraries to expression study during mosquito development stages. Trypsin 1, peritrophin 1 and kynurenine 3-monoxygenase expression were up regulated at the midgut 6h after blood feeding, analyzed by real time PCR. Nevertheless, the gene silencing did not change the survivorship of adult females. Serpin gene was expressed in all mosquito development stages but eggs; cecropin gene was expressed in midgut and carcass from male and female, mainly after sugar or blood feeding. Considering the alimentation is the main entrance way of pathogens, the presence of antimicrobial peptides as the early peritrophin expression showed that An. aquasalis is immunologically adapted against these microorganisms. This protection is involved in feeding behavior of this specie and can be also related to its low Plasmodium vector capacity. / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-09-30Bitstream added on 2014-06-13T18:29:21Z : No. of bitstreams: 1 carlos_bc_me_botib.pdf: 1447163 bytes, checksum: bbee87d6f015501c72b499b26af6cd4a (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Estudos recentes vêm elucidando a importância de uma diversidade de proteínas do intestino médio de insetos vetores, tanto nos processos de digestão como em respostas imunológicas e interações parasita-hospedeiro. Este trabalho teve como objetivo analisar a expressão de genes do intestino médio de Anopheles aquasalis, um importante vetor de malária no Brasil, a partir de clones sequenciados de bibliotecas de cDNA de machos e fêmeas alimentados apenas com sacarose. Nas fêmeas, pôde-se notar a grande predominância de serino proteases, proteínas ligantes de quitina e fatores relacionados à imunidade. Os machos também apresentaram diversos peptídeos de defesa imune, porém apenas uma protease digestiva e uma glicosidase. Alguns genes foram selecionados das bibliotecas para estudo de suas expressões durante a vida de An. aquasalis. Tripsina 1, peritrofina 1 e quinurenina 3-monooxigense tiveram seus níveis de expressão aumentados 6h após a ingestão de sangue, analisados através de qRT-PCR. No entanto, o silenciamento desses genes não resultou em alterações na longevidade de fêmeas adulta. O gene da serpina foi expresso em todas as fases do desenvolvimento do mosquito, exceto em ovos; e o gene da cecropina foi expresso em trato digestivo e carcaça de machos e fêmeas, principalmente após alimentação de açúcar ou sangue. Considerando que a ingestão de alimentos é a principal porta de entrada a microorganismos durante a vida adulta destes mosquitos, a presença de diversos produtos antimicrobianos, bem como a precoce expressão de peritrofina, outra proteína relacionada com a proteção do trato digestivo, mostrou que An. aquasalis está bem preparado imunologicamente contra esses microorganismos. Esta proteção está envolvida com o hábito alimentar desta espécie e pode também estar associada à sua baixa capacidade vetorial com relação aos plasmódios. / The importance of midgut proteins of Anopheles aquasalis has been elucidated both in digestion process as in immune responses and parasite-host interactions. This project targeted to analyze the midgut genes expression from An. aquasalis, an important malaria vector in Brazil, selecting clones from midgut cDNA library of female and male mosquitoes fed only on sugar. Serine proteases were predominant in females besides chitin binding proteins and immunity factors. Male mosquitoes also showed immune defense peptides, however only one digestive protease and one glucosidase. Some genes were selected from these libraries to expression study during mosquito development stages. Trypsin 1, peritrophin 1 and kynurenine 3-monoxygenase expression were up regulated at the midgut 6h after blood feeding, analyzed by real time PCR. Nevertheless, the gene silencing did not change the survivorship of adult females. Serpin gene was expressed in all mosquito development stages but eggs; cecropin gene was expressed in midgut and carcass from male and female, mainly after sugar or blood feeding. Considering the alimentation is the main entrance way of pathogens, the presence of antimicrobial peptides as the early peritrophin expression showed that An. aquasalis is immunologically adapted against these microorganisms. This protection is involved in feeding behavior of this specie and can be also related to its low Plasmodium vector capacity.

Submitted by Cibele Nogueira (cibelenogueira@ufgd.edu.br) on 2016-04-26T17:32:13Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) TERESACOSSA.pdf: 1899784 bytes, checksum: 186ef513138e7780ef8c162d163aeb00 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-26T17:32:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) TERESACOSSA.pdf: 1899784 bytes, checksum: 186ef513138e7780ef8c162d163aeb00 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / The increasing search for renewable and biodegradable chemical intermediates makes cardanol one of the most important and promissing component on cashew industry. The cardanol was extracted, distilled, hydrogenated and carried out in brief the following intermediates, hydrogenated and folowing intermediats were synthesized: saturated chain chlorohydrin (CCS) (6a), unsaturated chain chlorohydrin (CCI) (6a-d), unsaturated chain epoxide (ECS) (7a), unsaturated chain epoxide (ECI) (7a-d), saturated chain diol (DCS ) (9a), unsaturated chain diol (DCI) (9a-d), derived from saturated chain 4-amino antipyrine (DAACS) (10a), derived from unsaturated chain amino antipyrine DACI (10a-d), saturated chain morpholine derivative (DMCS) (11a), methoxylated diol saturated chain DMTS (12a), methoxylated unsaturated chain diol DMTCI (12a-d), the complex of Cu(II) saturated chain diol, (Cu(II)-DCS) (13a), complex of Cu(II) unsaturated chain diol (Cu(II)-DCI) (13a-d), Cu(II) complex with amino antipyrine saturated chain derivative (Cu(II)-DAACS) (14a) and Cu(II) complex with amino antipyrine unsaturated chain derivative (Cu(II)-DAACI) (14a-d). The synthesized compounds were characterized by proton nuclear magnetic resonance (NMR), infrared vibrational spectroscopy (IR), scanning electron ultraviolet-visible spectroscopy (UV-Vis), thermogravimetry (TG) and mass spectroscopy (ME). The compounds (9a) DCS, DCI (9a-d), DAACS (10a), DAACI (10a-d), Cu(II)-DCS (13a), Cu(II)-DCI (13a-d), Cu(II)-DAACS (14a) and Cu(II)-DAACI (14a-d) were subjected to bioassay toxicity with Aedes aegypti (strain Rockefeller). The bioassay analysis showed insecticidal activity/larvicide promising for compounds DS (9a), Cu(II)-DCS (13a) and Cu(II)-DAACS (14a) with the LC50 40.19 mg L-1 (ppm), 38.84 mg L-1 (ppm) and 59.41 mg L-1 (ppm), respectively in 24 hours exposure. The compounds (9a), (9a-d) and (10a) also showed promising activity against the larvae of the 3rd and 4th stage of Anopheles aquasalis, and had the following LC50: 9.65 mg L-1; 23.36 mg L-1 and 52, 55 mg L-1 respectively. / A busca crescente por fontes de intermediários químicos que sejam renováveis e biodegradáveis faz do cardanol alquil fenol um dos constituintes mais importantes e promissores da indústria de castanha de caju e da sua cadeia produtiva. O cardanol foi extraído, destilado, hidrogenado e realizadas as sínteses dos seguintes intermediários: cloridrina de cadeia saturada (CCS) (6a), cloridrina de cadeia insaturada (CCI) (6a-d), epóxido de cadeia saturada (ECS) (7a), epóxido de cadeia insaturada (ECI) (7a-d), diol de cadeia saturada (DCS) (9a), diol de cadeia insaturada (DCI) (9a-d), derivado de 4-amino antipirina de cadeia saturada (DAACS) (10a), derivados de 4-amino antipirina de cadeia insaturada (DAACI) (10a-d), derivado de morfolina de cadeia saturada (DMCS) (11a), diol metoxilado de cadeia saturada (DMTCS) (12a), diol metoxilado de cadeia insaturada (DMTCI) (12a-d), complexo de Cu(II)-diol de cadeia saturada (Cu(II)-DCS) (13a), complexo de Cu(II)-diol cadeia insaturada (Cu(II)-DCI) (13a-d), complexo de Cu(II) com derivados de amino antipirina de cadeia saturada (Cu(II)-DAACS) (14a) e complexo de Cu(II) com derivados de 4-amino antipirina de cadeia insaturada (Cu(II)-DAACI) (14a-d). Os compostos sintetizados foram caracterizados por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), espectroscopia vibracional do infravermelho (IV), espectroscopia eletrônica de ultravioleta-visível (UV-Vis), termogravimetria (TG) e espectroscopia de massas (EM). Os compostos DCS (9a), DCI (9a-d), DAACS (10a), DAACI (10a-d), Cu(II)-DCS (13a), Cu(II)-DCI (13a-d), Cu(II)-DAACS (14a) e Cu(II)-DAACI (14a-d) foram utilizados para realização dos bioensaios de toxicidade com larvas de Aedes aegypti de 3o e 4o estádios (Rockefeller). A análise de toxicidade mostrou atividade inseticida/larvicida promissora para os compostos DCS (9a), Cu(II)-DCS (13a) e Cu(II)-DAACS (14a) com as CL50 40,19 mg L-1 (ppm), 38,84 mg L-1 (ppm) e 59,41 mg L-1 (ppm), respectivamente por 24 horas de exposição para Aedes aegypti. Os compostos (9a), (9a-d) e (10a) também mostraram atividade promissora contra as larvas do 3o e 4o estádio de Anopheles aquasalis tendo apresentado as seguintes CL50: 9,65 mgL-1; 23,36 mgL-1 e 52,55 mgL-1 respetivamente.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-17T17:59:45Z No. of bitstreams: 1 ana_c_b_nascimento_ioc_bcm_0022_2010.pdf: 7179459 bytes, checksum: 2ef62247bd903a56caf55419a431306c (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-17T17:59:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ana_c_b_nascimento_ioc_bcm_0022_2010.pdf: 7179459 bytes, checksum: 2ef62247bd903a56caf55419a431306c (MD5) Previous issue date: 2010 / Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Ciencias Medicas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Anualmente, a malária afeta cerca de 300 milhões de pessoas no mundo (causando cerca de um milhão de mortes). No Brasil 450.000 casos são notificados anualmente. Recentemente, muitos trabalhos têm procurado identificar moléculas mediadoras da interação mosquito/plasmódio. Anopheles aquasalis é o vetor de malária mais importante nas regiões litorâneas do Brasil e Plasmodium vivax o agente etiológico causador da maior parte dos casos da doença. Este estudo visa examinar moléculas que participam da interação entre estes dois organismos. Para tal, duas estratégias foram utilizadas: subtração de cDNAs e PCR com iniciadores degenerados. As bibliotecas subtrativas foram produzidas a partir de amostras de A. aquasalis 2 e 24 horas após alimentação sanguínea ou infecção por P. vivax. Após a análise dos cDNAs obtidos foram observadas diferenças na expressão de genes entre A. aquasalis alimentados com sangue e com sangue infectado em ambos os intervalos de tempo investigados. Os resultados das subtrações de cDNA para os genes serino protease, fibrinogênio, proteína responsiva a bactéria e carboxipeptidase foram corroborados utilizando PCR em tempo real. Por exemplo, uma cecropina teve a sua expressão diminuída após a infecção com P. vivax e uma serpina apresentou um resultado oposto. Análise de um fator de transcrição GATA revelou um aumento de RNAm 36 horas após infecção com P. vivax assim como um aumento da infecção após silenciamento deste gene, demonstrando a importância deste fator de transcrição para a resposta imune do inseto contra P. vivax. Em paralelo, cDNAs de A. aquasalis específicos para genes relacionados com a via JAK-STAT [fator de transcrição STAT, proteína inibitória de STAT ativado (PIAS) e óxido nítrico sintase (NOS)] e com o sistema de detoxificação celular (catalase e duas superóxido dismutases) foram amplificados utilizando iniciadores degenerados. Resultados de expressão destes genes revelaram que STAT, PIAS e NOS são induzidos pela infecção com P. vivax e experimentos de genética reversa comprovaram que a via de sinalização JAK/STAT é importante na resposta imune do A. aquasalis contra este parasito. Com relação às enzimas de detoxificação, foi observado um aumento da expressão 36 horas após infecção e uma diminuição da atividade das enzimas SOD e catalase 24 horas após infecção. Este aumento de RNAm 36 horas após infecção pode estar relacionado à tentativa das células de diminuírem a quantidade intracelular de espécies reativas de oxigênio mantida pela diminuição da atividade destas enzimas 24 horas pós infecção. Surpreendentemente, o silenciamento da catalase exacerbou a infecção do P. vivax. Este resultado pode ser correlacionado com a produção de uma rede de ditirosina que protegeria os parasitos da resposta imune do inseto. Nossos resultados apontam mecanismos imunes adotados pelo A. aquasalis para combater o P. vivax, fornecendo informações importantes sobre moléculas envolvidas no processo de interação e imunidade deste vetor de malária no Brasil com seu parasito. / Each year, malaria affects 300 million people worldwide, causing 1 million deaths. In Brazil, 450,000 cases are reported annually. Recently, many studies have attempted to identify molecules that mediate the interaction mosquito-parasite. Anopheles aquasalis is the most important vector of malaria in the coastal regions of Brazil and the etiological agent Plasmodium vivax causes most cases of the disease. This study aims examining molecules that participate in the interaction between these two organisms. For this, two strategies were used: cDNA subtraction and PCR using degenerate primers. The subtractive libraries were produced from samples of A. aquasalis 2 and 24 hours after blood feeding or infection by P. vivax. After analyzes of cDNAs, differences were observed in gene expression between A. aquasalis fed with blood or infected blood at both times investigated. The expression of some candidates obtained through subtraction cDNA (serine protease, fibrinogen, carboxypeptidase and bacteria responsive protein genes) were confirmed using real time PCR. For example, the expression of a cecropin decreased after P. vivax infection while a serpin presented increased expression. Analysis of a transcription factor, GATA, revealed an increase in the mRNA levels 36 hours after infection. Silencing of this gene produced increased infection, demonstrating the importance of this transcription factor for the insect's immune response against P. vivax. In parallel, A. aquasalis cDNA sequences for the JAK-STAT pathway [transcription factor STAT, protein inhibitor of activated STAT (PIAS) and nitric oxide synthase (NOS)] and for genes related to cellular detoxification (catalase and two superoxide dismutases) were obtained using degenerate primers. Results of expression of these genes revealed that STAT, PIAS and NOS are induced by infection with P. vivax and reverse genetics experiments have shown that this pathway is important in the immune response of A. aquasalis against P. vivax. Regarding the detoxification enzymes, an increase in mRNA expression was observed 36 hours after infection and a decrease in activity 24 hours after infection. This increase in mRNA 36 hours after infection may be related to the attempt of cells to decrease the amount of intracellular ROS due to the diminished activity of these enzymes 24 hours after infection. Surprisingly, the silencing of catalase exacerbated the infection of P. vivax. This result may be correlated with the production of a dytirosine network that protects the parasites from the insect's immune response. Our results indicate immune mechanisms adopted by A. aquasalis to combat P. vivax, providing important information about molecules involved in the process of interaction and immunity of this vector with its Brazilian malaria parasite.