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Diagnóstico de la infección por Mycobacterium tuberculosis mediante estimulación de las células t sensibilizadas con antígenos específicosLatorre Rueda, Irene 15 April 2011 (has links)
diagnosticar precozmente y tratar a los individuos enfermos de forma apropiada. Por
otro lado, el estudio de las personas infectadas permite aplicar, medidas de prevención
y evitar que estas personas desarrollen la enfermedad.
La prueba de la tuberculina (PT) ha sido utilizada durante los últimos 100 años como
herramienta para el diagnóstico de la infección tuberculosa. Su principal inconveniente
radica en que la mayoría de proteínas presentes en el PPD no son específicas de
Mycobacterium tuberculosis. Esto provoca una disminución en la especificidad de la
prueba, ya que individuos sensibilizados por exposición previa a micobacterias no
tuberculosas (MNT) o vacunados con la BCG también responden inmunológicamente
al PPD. Además, la PT presenta una baja sensibilidad en pacientes con alteraciones
en la inmunidad celular.
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La citoquina efectora clave en el control de la infección micobacteriana para la
activación de los macrófagos y el desarrollo de la inmunidad protectora contra M.
tuberculosis es el IFN-g. Por lo tanto, un método de inmunodiagnóstico basado en la
cuantificación in vitro de la respuesta inmune celular puede ser una alternativa a la PT.
En los últimos años, se han descrito dos antígenos específicos de M. tuberculosis:
Early Secretory Antigen Target-6 (ESAT-6) y Culture Filtrate Protein 10 (CFP-10).
Estos antígenos están ausentes en la cepa vacunal de la BCG y en la mayoría de
MNT. También se ha estudiado un tercer antígeno llamado TB7.7. En este sentido han
sido desarrollados diferentes métodos de cuantificación de la respuesta inmune celular
utilizando estos antígenos específicos micobacterianos para la estimulación de las
células T sensibilizadas y para la detección in vitro de IFN-g.
En base a esta tecnología se han estandarizado dos técnicas comerciales: Quantiferon
Gold In tube (QFN-G-IT) y T-SPOT.TB. QFN-G-IT estimula los linfocitos presentes en
muestras de sangre total con los antígenos ESAT-6, CFP-10 y TB7.7 en un mismo
tubo, y determina la producción de IFN-g mediante técnica de ELISA. Por otro lado, TSPOT.
TB requiere una separación de células mononucleares para estimularlas con los
antígenos ESAT-6 y CFP-10 por separado, y el IFN-g se detecta mediante ELISPOT.
De esta forma, la Tesis se ha centrado en la estandarización y evaluación clínica de
estas técnicas inmunológicas para el diagnóstico de la infección tuberculosa y TB
activa, así como su aplicabilidad en la práctica clínica en pacientes adultos y
pediátricos (inmunocompetentes e inmunodeprimidos), y el estudio del efecto de las
MNT sobre la positividad de la PT. Finalmente, la Tesis se completa con la evaluación
de nuevos marcadores y antígenos alternativos en el diagnóstico in vitro de la TB.
En resumen, las técnicas basadas in vitro son más específicas que la PT, ya que están
menos influenciadas por la vacuna de la BCG y la sensibilización a MNT. Por lo tanto,
el uso de estas técnicas puede ayudar a reducir el número de quimioprofilaxis
innecesarias en población adulta y pediátrica. La detección de IFN-g liberado por las
células T sensibilizadas tras estimular con antígenos específicos de M. tuberculosis es
una herramienta diagnóstica alternativa en el diagnóstico de la infección tuberculosa
en población inmunocompetente e inmunodeprimida. Además, estas técnicas in vitro
pueden ayudar en el inmunodiagnóstico de la TB activa. Por otro lado, el estudio de
nuevos antígenos específicos y biomarcadores es una herramienta potencial para el
estudio de la respuesta del huésped contra M. tuberculosis durante el tratamiento y la
búsqueda de nuevos marcadores para el diagnóstico de la infección tuberculosa y TB
activa. / The bases of tuberculosis (TB) control programs consist of a diagnosis and correct
treatment of patients with active TB. An essential factor for controlling the spread of this
disease is the ability to diagnose infected individuals in their early stages before they
become infectious to others through the progression to active TB.
The tuberculin skin test (TST) has been until now the only tool available for the
diagnosis of latent tuberculosis infection (LTBI). Unfortunately, this test has some
disadvantages because of its poor specificity that lead to false positive results by the
BCG vaccine strain and nontuberculous mycobacteria (NTM) cross-reaction. Moreover,
TST has a low sensibility in groups with impaired cellular immunity giving false negative
results.
CD4 T cells represent the major players in the protection against TB. Of greatest
relevance are the T helper (Th) 1 cells, that produce IFN-g. The IFN-g cytokine
activates macrophages for the development of a protective immunity against
Mycobacterium tuberculosis. Therefore, an immunodiagnostic assay based on the in
vitro quantification of this cellular immune response could be an alternative to the TST
for the diagnosis of LTBI.
In the last years, two specific M. tuberculosis antigens have been described. These
antigens are early secretory antigenic target 6 (ESAT-6) and culture filtrate protein 10
(CFP-10), absent in BCG strain and in the majority of NTM. A new third M. tuberculosis
antigen called TB7.7 has been also studied. In vitro assays for the diagnosis of LTBI,
based on the detection of IFN-g secreted by effector T cells stimulated with these
specific antigens, have been developed.
There are two commercially available IFN-g T-cell based assays: QuantiFERON-TB
Gold In-Tube (QFN-G-IT) and T-SPOT.TB, both approved by the U.S. Food and Drug
Administration. QFN-G-IT test stimulates whole-blood with ESAT-6, CFP- 10 and
TB7.7 in the same tube, and measures the concentration of IFN-g in supernatants with
an ELISA assay. On the other hand, T-SPOT.TB assay stimulates isolated peripheral
blood mononuclear cells with ESAT-6 and CFP-10 separately, and detects number of
IFN-g producing T cells by means of an ELISPOT.
In this sense, the main objectives of this Thesis are the standardization and clinical
evaluation of these new immunological assays for the diagnosis of LTBI and active TB,
their application in clinical practice in adult and pediatric immunocompetent and
immunosuppressed population, and the evaluation of NTM effect in the LTBI diagnosis.
Finally, we study and evaluate new antigens and potential biomarkers for the diagnosis
of active TB and LTBI.
In summary, IFN-g tests are more specific than TST because they are less affected by
BCG vaccination and NTM sensitization. So, the utilization of these assays can help to
reduce unnecessary LTBI treatment among adult and pediatric population. Therefore,
detection of IFN-g produced by T cells after M. tuberculosis specific antigen stimulation
is an alternative diagnostic tool for LTBI in immunocompetent and immunosuppressed
patients. In addition, IFN-g assays could help in the immunodiagnosis of active TB. On
the other hand, the study of new specific antigens and biomarkers is a potential tool for
studying host immune response during anti-TB therapy and finding novel diagnostic
markers for active TB and M. tuberculosis infection.
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Efeito da hipoxia intermitente em marcadores de progressão de melanoma em um modelo de apneia do sono em camundongosPerini, Silvana January 2013 (has links)
Objetivos do Estudo: O aumento do crescimento de melanoma foi avaliado em camundongos expostos a hipóxia intermitente. As proteínas que caracterizam a agressividade do tumor ainda não foram investigadas. O estudo teve como objetivo verificar se a hipóxia intermitente simulada pela apneia do sono afeta marcadores de melanoma na progressão tumoral. Desenho: Estudo prospectivo controlado em animais. Senário: Hospital Universitário. Participantes: Doze camundongos C57BL/6. Intervenções: Camundongos foram expostos a hipóxia intermitente ou simulada. Durante 8 horas por dia, o grupo hipóxia foi submetido a um total de 480 ciclos de 30 segundos de hipóxia progressiva SpO2 nadir de 8 ± 1%, seguidos por 30 segundos de normóxia. Um milhão de células de melanoma B16F10 foi injetado por via subcutânea. No dia 14, após a eutanásia, os tumores foram removidos, fixados e corados. Médias e resultados: coloração imunohistoquímica de Ki-67, PCNA, S100-B, HMB-45, Melan-A, TGF, Caspase-1 e HIF-1α foi quantificada por dois observadores que utilizaram captura digital e processamento em três lâminas de cada animal para cada marcador. O tamanho e o peso dos tumores foram semelhantes nas experiências de hipóxia e simulada. A percentagem da mediana [25-75 quartis] de área positiva corada para Ki-67 foi de 23% [15-28] no grupo hipóxia e 0,3% [0,2-1,1] no grupo controle (P = 0,02); para PCNA, as percentagens foram 31% [25-38] e 7% [5-18], respectivamente (P = 0,009). As diferenças entre os grupos para os marcadores restantes não foram significativas. Conclusões: Os marcadores da transcrição do RNA ribossomal e da síntese de DNA são mais expressos em tumores de camundongos expostos a hipóxia intermitente do que em controles, indicando que a apneia do sono pode levar a uma maior agressividade do tumor. / Study Objectives: Increased melanoma growth has been reported in mice exposed to intermittent hypoxia. Proteins that characterize tumor aggressiveness have not been investigated. The study aims to verify whether intermittent hypoxia mimicking sleep apnea affects markers of melanoma tumor progression. Design: Prospective controlled animal study. Settings: University hospital. Participants: Twelve C57bl/6 mice. Interventions: Mice were exposed to intermittent or sham hypoxia. During 8 hours per day, the hypoxia group was submitted to a total of 480 cycles of 30 seconds of progressive hypoxia to a nadir FIO2 of 8±1%, followed by 30 seconds of normoxia. One million B16F10 melanoma cells were injected subcutaneously. On the 14th day, after euthanasia, tumors were removed, fixed and stained. Measurements and Results: Immunohistochemistry staining for Ki-67, PCNA, S100-B, HMB-45, Melan-A, TGFβ, Caspase-1 and HIF-1α was quantified by two observers using digital capture and processing in three slides from each animal for each marker. The size and weight of the tumors were similar in hypoxia and simulated experiments. Median [25-75 quartiles] percentage of positive area stained for Ki-67 was 23% [15-28] in the hypoxia group and 0.3% [0.2-1.1] the control group (P=0.02); for PCNA, the percentages were 31% [25-38] e 7% [5-18], respectively (P=0.009). The differences between the groups for the remaining markers were not significant. Conclusions: Markers of ribosomal RNA transcription and of DNA synthesis are more expressed in tumors of mice exposed to intermittent hypoxia than of controls, indicating that sleep apnea can lead to greater tumor aggressiveness.
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Efeito da hipoxia intermitente em marcadores de progressão de melanoma em um modelo de apneia do sono em camundongosPerini, Silvana January 2013 (has links)
Objetivos do Estudo: O aumento do crescimento de melanoma foi avaliado em camundongos expostos a hipóxia intermitente. As proteínas que caracterizam a agressividade do tumor ainda não foram investigadas. O estudo teve como objetivo verificar se a hipóxia intermitente simulada pela apneia do sono afeta marcadores de melanoma na progressão tumoral. Desenho: Estudo prospectivo controlado em animais. Senário: Hospital Universitário. Participantes: Doze camundongos C57BL/6. Intervenções: Camundongos foram expostos a hipóxia intermitente ou simulada. Durante 8 horas por dia, o grupo hipóxia foi submetido a um total de 480 ciclos de 30 segundos de hipóxia progressiva SpO2 nadir de 8 ± 1%, seguidos por 30 segundos de normóxia. Um milhão de células de melanoma B16F10 foi injetado por via subcutânea. No dia 14, após a eutanásia, os tumores foram removidos, fixados e corados. Médias e resultados: coloração imunohistoquímica de Ki-67, PCNA, S100-B, HMB-45, Melan-A, TGF, Caspase-1 e HIF-1α foi quantificada por dois observadores que utilizaram captura digital e processamento em três lâminas de cada animal para cada marcador. O tamanho e o peso dos tumores foram semelhantes nas experiências de hipóxia e simulada. A percentagem da mediana [25-75 quartis] de área positiva corada para Ki-67 foi de 23% [15-28] no grupo hipóxia e 0,3% [0,2-1,1] no grupo controle (P = 0,02); para PCNA, as percentagens foram 31% [25-38] e 7% [5-18], respectivamente (P = 0,009). As diferenças entre os grupos para os marcadores restantes não foram significativas. Conclusões: Os marcadores da transcrição do RNA ribossomal e da síntese de DNA são mais expressos em tumores de camundongos expostos a hipóxia intermitente do que em controles, indicando que a apneia do sono pode levar a uma maior agressividade do tumor. / Study Objectives: Increased melanoma growth has been reported in mice exposed to intermittent hypoxia. Proteins that characterize tumor aggressiveness have not been investigated. The study aims to verify whether intermittent hypoxia mimicking sleep apnea affects markers of melanoma tumor progression. Design: Prospective controlled animal study. Settings: University hospital. Participants: Twelve C57bl/6 mice. Interventions: Mice were exposed to intermittent or sham hypoxia. During 8 hours per day, the hypoxia group was submitted to a total of 480 cycles of 30 seconds of progressive hypoxia to a nadir FIO2 of 8±1%, followed by 30 seconds of normoxia. One million B16F10 melanoma cells were injected subcutaneously. On the 14th day, after euthanasia, tumors were removed, fixed and stained. Measurements and Results: Immunohistochemistry staining for Ki-67, PCNA, S100-B, HMB-45, Melan-A, TGFβ, Caspase-1 and HIF-1α was quantified by two observers using digital capture and processing in three slides from each animal for each marker. The size and weight of the tumors were similar in hypoxia and simulated experiments. Median [25-75 quartiles] percentage of positive area stained for Ki-67 was 23% [15-28] in the hypoxia group and 0.3% [0.2-1.1] the control group (P=0.02); for PCNA, the percentages were 31% [25-38] e 7% [5-18], respectively (P=0.009). The differences between the groups for the remaining markers were not significant. Conclusions: Markers of ribosomal RNA transcription and of DNA synthesis are more expressed in tumors of mice exposed to intermittent hypoxia than of controls, indicating that sleep apnea can lead to greater tumor aggressiveness.
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Efeito da hipoxia intermitente em marcadores de progressão de melanoma em um modelo de apneia do sono em camundongosPerini, Silvana January 2013 (has links)
Objetivos do Estudo: O aumento do crescimento de melanoma foi avaliado em camundongos expostos a hipóxia intermitente. As proteínas que caracterizam a agressividade do tumor ainda não foram investigadas. O estudo teve como objetivo verificar se a hipóxia intermitente simulada pela apneia do sono afeta marcadores de melanoma na progressão tumoral. Desenho: Estudo prospectivo controlado em animais. Senário: Hospital Universitário. Participantes: Doze camundongos C57BL/6. Intervenções: Camundongos foram expostos a hipóxia intermitente ou simulada. Durante 8 horas por dia, o grupo hipóxia foi submetido a um total de 480 ciclos de 30 segundos de hipóxia progressiva SpO2 nadir de 8 ± 1%, seguidos por 30 segundos de normóxia. Um milhão de células de melanoma B16F10 foi injetado por via subcutânea. No dia 14, após a eutanásia, os tumores foram removidos, fixados e corados. Médias e resultados: coloração imunohistoquímica de Ki-67, PCNA, S100-B, HMB-45, Melan-A, TGF, Caspase-1 e HIF-1α foi quantificada por dois observadores que utilizaram captura digital e processamento em três lâminas de cada animal para cada marcador. O tamanho e o peso dos tumores foram semelhantes nas experiências de hipóxia e simulada. A percentagem da mediana [25-75 quartis] de área positiva corada para Ki-67 foi de 23% [15-28] no grupo hipóxia e 0,3% [0,2-1,1] no grupo controle (P = 0,02); para PCNA, as percentagens foram 31% [25-38] e 7% [5-18], respectivamente (P = 0,009). As diferenças entre os grupos para os marcadores restantes não foram significativas. Conclusões: Os marcadores da transcrição do RNA ribossomal e da síntese de DNA são mais expressos em tumores de camundongos expostos a hipóxia intermitente do que em controles, indicando que a apneia do sono pode levar a uma maior agressividade do tumor. / Study Objectives: Increased melanoma growth has been reported in mice exposed to intermittent hypoxia. Proteins that characterize tumor aggressiveness have not been investigated. The study aims to verify whether intermittent hypoxia mimicking sleep apnea affects markers of melanoma tumor progression. Design: Prospective controlled animal study. Settings: University hospital. Participants: Twelve C57bl/6 mice. Interventions: Mice were exposed to intermittent or sham hypoxia. During 8 hours per day, the hypoxia group was submitted to a total of 480 cycles of 30 seconds of progressive hypoxia to a nadir FIO2 of 8±1%, followed by 30 seconds of normoxia. One million B16F10 melanoma cells were injected subcutaneously. On the 14th day, after euthanasia, tumors were removed, fixed and stained. Measurements and Results: Immunohistochemistry staining for Ki-67, PCNA, S100-B, HMB-45, Melan-A, TGFβ, Caspase-1 and HIF-1α was quantified by two observers using digital capture and processing in three slides from each animal for each marker. The size and weight of the tumors were similar in hypoxia and simulated experiments. Median [25-75 quartiles] percentage of positive area stained for Ki-67 was 23% [15-28] in the hypoxia group and 0.3% [0.2-1.1] the control group (P=0.02); for PCNA, the percentages were 31% [25-38] e 7% [5-18], respectively (P=0.009). The differences between the groups for the remaining markers were not significant. Conclusions: Markers of ribosomal RNA transcription and of DNA synthesis are more expressed in tumors of mice exposed to intermittent hypoxia than of controls, indicating that sleep apnea can lead to greater tumor aggressiveness.
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