Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Farmacología / En abril del año 2015, la organización mundial de la salud (OMS), presentó un informe que reveló la situación actual en torno a la resistencia a antimicrobianos de 114 países, lo que dejó en evidencia un preocupante escenario: el fenómeno de la resistencia se encuentra diseminado en todo el orbe y está presente en una gran variedad de patógenos responsables de infecciones comunes, tales como: las del tracto urinario, la gonorrea, la diarrea, la neumonía y la sepsis. Dentro de estos agentes se encuentran diversos bacilos Gram negativos, Staphylococcus aureus resistente a meticilina y Enterococcus spp. resistente a vancomicina, siendo estos últimos responsables de enfermedades con altos índices de mortalidad, como son la sepsis y la endocarditis. A este escenario se suma el escaso avance e inversión por parte de las grandes industrias farmacéutica en el desarrollo de nuevos antimicrobianos. Frente a esto, el año 2010, la Sociedad Americana de Enfermedades Infecciosas (IDSA) en conjunto a otras entidades, lanzaron el programa “The 10x‘20 Initiative: Pursuing a Global Commitment to Develop 10 New Antibacterial Drugs by 2020”, una iniciativa que busca hacer un llamado a los diferentes actores de la salud pública mundial, a incentivar el desarrollo de nuevas entidades moleculares (NEMs) con actividad antimicrobiana para el año 2020. El Laboratorio de Desarrollo de Fármacos de la Universidad de Chile ha trabajado en la desarrollo de compuestos arilmercaptoquinonicos diseñados racionalmente a partir de la estructura de la ubiquinona, buscando intervenir la cadena de transportadora de electrones bacteriana (CTeB). Resultados previos han demostrado que los compuestos obtenidos poseen una interesante actividad sobre bacterias Gram positivas tales como S. aureus resistente a meticilina, S. aureus sensible a meticilina y E. faecalis. De la serie de compuestos sintetizados destacaron; DFUCh-O5 y DFUCh-P4. En la presente investigación se buscó determinar el potencial de aplicación terapéutica de los derivados sintetizados y con ello discernir cuál es el mejor candidato para poder avanzar a fases preclínicas que consideren la utilización de modelos animales. En primer término, se estudió la toxicidad de los compuestos sobre células humanas y murinas a través del método 15 de MTT. Además, se determinaron los valores Concentración Inhibitoria Mínima90 (CIM90) y Concentración Bactericida Minima90 (CBM90) para los derivados en estudio de acuerdo a las normas de CLSI, sobre población de aislamientos clínicos de S. aureus y E. faecium multirresistentes, obtenidos desde distintos sitios estériles (sangre, huesos, etc.) y diferentes centros hospitalarias de todo Chile durante el año 2014, provistos por el Instituto de Salud Pública de Chile. Se caracterizó la actividad antibacteriana de los derivados, a través de la cuantificación del efecto post-antibiótico, el estudios de las curvas de muerte de los derivados, el potencial de inducción de mutaciones de los derivados sobre cultivos expuesto en forma aguda y crónica a estos. Por otra parte, se evaluó la actividad de los compuestos en asociación con linezolid, vancomicina y daptomicina, por determinación del índice de CFI (Concentración Fraccionaria Inhibitoria). Adicionalmente, se determinó el porcentaje de unión a albumina de los derivados y se estudió cómo influye esta proteína en la actividad de los compuestos in vitro. Por último, se estudió la efectividad in vivo utilizando un modelo de infección en larvas de Galleria mellonella. Se evidenció que DFUCh-O5 y DFUCh-P4 no afectan la viabilidad de células mamíferas; HeLa, SH-SY5Y y H4-II-E-C3, a las concentraciones en que son activos como antibacterianos. Los compuestos poseen CIM90 similar a la exhibida por vancomicina sobre los aislamientos clínicos de S. aureus resistentes a meticilina. Frente a los aislamientos de E. faecium resistentes a vancomicina estudiados, DFUCh-P4 resultó 64 veces más activo que vancomicina y DFUCh-O5 128 veces más activo que esté fármaco. Los derivados son bactericidas en todos los aislamientos estudiados. En los estudios de cinética de muerte, los compuesto tardaron menos de 2 horas en reducir el 99,9% de la población bacteriana ensayada. Los derivados no tienen efecto post antibiótico significativo sobre las especies S. aureus y Enterococcus sp. prototipo. Ambos derivados tienen potencial de inducir mutaciones frente a una exposición aguda y cronica en S. aureus resistente a meticilina, pero estas mutaciones no se mantienen en la generaciones sucesivas de la población bacteriana. DFUCh-P4 y DFUCh-O5 poseen la misma 16 efectividad que vancomicina sobre los modelos de infección en G. mellonela provocado por S. aureus sensible a meticilina o E. faecalis. En este trabajo se demostró, que los derivados poseen potencial terapéuticos como compuestos antibacterianos de uso humano, ya que poseen una alta actividad sobre bacterias Gram positivas multirresistentes y no afectan la viabilidad de células mamíferas / In April 2015, the World Health Organization (WHO) presented a report that revealed the current situation regarding antimicrobial resistance in 114 countries, which revealed a dangerous scenario: the phenomenon of resistance It is disseminated throughout the world and is present in a wide variety of pathogens responsible for common infections, such as those of the urinary tract, gonorrhea, diarrhea, pneumonia and sepsis. Among these agents are Gram-negative bacilli, methicillinresistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Enterococcus sp. Resistant to vancomycin (ERV), are the last responsible for diseases with high mortality rates, such as child sepsis and endocarditis. Added to this scenario is the scarce advancement and investment by large pharmaceutical companies in the development of new antimicrobials. In response to this, in 2010, the American Society for Infectious Diseases (IDSA), together with other entities, launched the program "The 10x'20 Initiative: Looking for a global commitment to develop 10 new antibacterial drugs by 2020", an initiative that. The Drug Development Laboratory of the University of Chile has worked on the development of new resources for the development of new molecular entities (NEMs) with antimicrobial activity for the year 2020. Arilmercaptoquinonics compounds rationally designed from the structure of ubiquinone, looking to block the bacterial electron transport chain (CTeB). Previous results have shown that the compounds obtained have an interesting activity on Gram-positive bacteria such as S. aureus susceptible to methicillin, MRSA and Enterococcus faecalis. From the series of synthesized compounds, it highlighted; DFUCh-O5 and DFUCh-P4. In the present investigation, we sought to determine the potential of therapeutic application of the synthesized derivatives and thereby discern which is the best candidate to be able to advance to preclinical phases that consider the use of animal models. First, the toxicity of the compounds was studied on human and murine cells through the MTT method. The values MIC90 and MBC90 were determined for the derivatives under study according to CLSI standards, on population of clinical isolates of Staphylococcus aureus and Enterococcus faecium multiresistant, isolated from different sterile sites (blood, bones, etc.) and different 18 hospital centers of Chile during 2014, provided by the Institute of Public Health of Chile. The antibacterial activity of the derivatives was characterized, through the quantification of the post-antibiotic effect, the studies of the time-kill curves of the derivatives, the potential for the induction of mutations of the derivatives on cultures exposed in acute and chronic form to these. On the other hand, the activity of the compounds in association with linezolid, vancomycin and daptomycin was evaluated by determining the CFI index (Fractional Inhibitory Concentration) In addition, the albumin binding percentage of the derivatives was determined and this protein was studied. in the activity of the compounds in vitro Finally, effectiveness was studied in vivo using a model of infection in larvae of Galleria mellonella. Evidence of DFUCh-O5 and DFUCh-P4 does not affect the viability of mammalian cells; HeLa, SH-SY5Y and H4-II-E-C3, at concentrations that are active as antibacterial drugs. The compounds possess a vancomycin-like activity on the clinical isolates of S. aureus resistant to methicillin. Faced with the isolates of vancomycin-resistant E. faecium studied, DFUCh-P4 was 64 times more active than vancomycin and DFUCh-O5 was 128 times more active than the drug. The activity exhibited is bactericidal in all isolates studied. In studies of death kinetics, isolation took less than hours to reduce 99.9% of the bacterial population tested. The compounds have no significant post-antibiotic effect on S. aureus and Enterococcus spp. prototype. Both derivatives have the potential to induce mutations in the face of acute and chronic MRSA exposure, but these mutations are not maintained in successive generations of the bacterial population. DFUCh-P4 and DFUCh-O5 have the same effectiveness than vancomycin on G. mellonela model infection by S. aureus or E. faecalis. In this study it was demonstrated that the derivatives have therapeutic potential as antibacterial compounds for human use, since they have a high activity on multiresistant Gram positive bacteria and do not affect the viability of mammalian cells

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / En la actualidad, y en los últimos diez años, la nanotecnología ha entrado en auge, dada su capacidad para resolver problemáticas de distinta índole. En particular, la nanomedicina permite generar distintas plataformas de entrega de fármacos, los cuales pueden ser protegidos y guiados a distintos tejidos y órganos. El objetivo del presente trabajo es desarrollar nanopartículas de óxido de zinc (ZnO) dopadas con magnesio, que permitan la conjugación a drogas y puedan disolverse a pH tumoral (pH 4.0 – 5.5). Las nanopartículas de ZnO poseen la particularidad de disolverse en condiciones ácidas. De esta forma, al ingresar a la célula por medio de endocitosis, las nanopartículas pueden componer un sistema de entrega de fármaco antitumoral controlado, con disolución de las mismas, liberando Zn+2 al medio intracelular de la célula en conjunto con la droga transportada, y con un potencial efecto sinérgico. Para explorar este sistema de entrega de fármacos, la primera parte del trabajo correspondió a la síntesis de las nanopartículas. Para lo cual se empleó el método de precipitación, el que consiste en la reacción de sales de zinc y magnesio con hidróxido de potasio. En la segunda parte del trabajo se evaluó el perfil toxicológico de las nanopartículas de ZnO en embriones de Danio rerio para corroborar su potencial toxicidad. Luego, las nanopartículas fueron funcionalizadas con dos polímeros, polialilamina y poliestirensulfonato, y un aminosilano APTES, con el objeto de obtener nanopartículas que puedan conjugarse con distintas drogas. Finalmente, se utilizó curcumina, como droga modelo, conjugada con la nanopartícula desnuda y funcionalizada, con el objeto de evaluar la capacidad de asociación de la droga a la nanopartícula. Se lograron desarrollar nanopartículas de ZnO dopadas con magnesio, las cuales tienen gran capacidad de adhesión a drogas que tengan estructura de tipo carbonilo-hidroxilo (por ejemplo, curcumina, doxorubicina y daunorubicina), posiblemente por medio de la formación de compuestos coordinados. En embriones de Danio rerio, son tóxicas, sin embargo, el recubrimiento del conjunto nanopartícula-droga, podría disminuir la toxicidad de estas. Así, próximos estudios biológicos podrán explorar estos aspectos en mayor detalle y la mejora del nanosistema / Currently, and in the last ten years, nanotechnology has boomed, given its ability to solve problems of various kinds. In particular, nanomedicine allows generating different drug delivery platforms, which can be protected and guided to different tissues and organs. The objective of this work was to develop zinc oxide nanoparticles (ZnO) doped with magnesium, which allows conjugation to drugs and can dissolve at tumoral pH (pH 4.0 - 5.5). The ZnO nanoparticles have the particularity of dissolving in acidic conditions. In this way, upon entering the cell by means of endocytosis, the nanoparticles can compose a controlled antitumor drug delivery system, with their dissolution, releasing Zn+2 in the intracellular medium of the cell in conjunction with the transported drug, and with a potential synergistic effect. To explore this drug delivery system, the first part of the work corresponded to the synthesis of nanoparticles. For this, the precipitation method was used, which consists of the reaction of zinc and magnesium salts with potassium hydroxide. In the second part of the work, the toxicological profile of the ZnO nanoparticles in Danio rerio embryos was evaluated to corroborate its potential toxicity. Then, nanoparticles were functionalized with two polymers, polyalylamine and polystyrene sulfonate, and an aminosilane APTES, in order to obtain nanoparticles that could be conjugated with different drugs. Finally, curcumin was used, as a model drug, conjugated with the nude and functionalized nanoparticle, in order to evaluate the association of the drug to the nanoparticle. ZnO nanoparticles doped with magnesium were developed and have great capacity of adhesion to drugs that have carbonyl-hydroxyl groups in their structure (for example, curcumin, doxorubicin and daunorubicin), possibly through the formation of coordinated compounds. In Danio rerio embryos, they are toxic, however, the coating of the nanoparticle-drug set, could diminish the toxicity of these. Thus, next biological studies will be able to explore these aspects in greater detail and the improvement of the nanosystem

Doctor en Química / En el presente trabajo se logró la extracción de nueve diterpenos naturales a partir de extractos de Azorella compacta obtenidos a partir de éter de petróleo y acetato de etilo. Ocho de estos diterpenos están descritos en la literatura y se determinaron mediante espectroscospía 1H/13C-RMN, y a través de comparación con estándares previamente aislados, mientras que el ácido 16-normulin-11-en-13-ona-20-oico (29) se aisló por primera vez describiendo su estructura mediante1H/13C-RMN, IR, UV y espectroscopía de masas. Los nueve diterpenos obtenidos fueron derivatizados mediante cambios funcionales para dar paso a veintidós diterpenos semisintéticos que fueron caracterizados espectroscópicamente. Posteriormente se determinó la actividad antibacteriana de los diterpenos, tanto naturales como semisinteticos, los cuales fueron ensayados en cepas de Staphylococcus aureus, Mycobaterium smegmatis y Escherichia coli. Los resultados obtenidos indicaron que dos diterpenos naturales y cuatro diterpenos modifcados presentaron actividad biológica contra las bacterias mencionadas. También fue posible determinar que al modificar químicamente las estructuras de diterpenos naturales se observó un incremento de la actividad antibacteriana. Además se observó que al incorporar los compuestos naturales o semisintéticos en soluciones acuosas de micelas formadas con Pluronic F-127, no se detectó aumento de la actividad biológica. iii Seis de los diterpenos descritos en este trabajo presentaron una mayor actividad biología. Las modificaciones estructurales llevadas a cabo dieron lugar, en algunos casos, a un incremento de la actividad incluso en aquellos compuestos naturales que no poseían capacidad de inhibir el crecimiento bacteriano. / Universidad de Chile y Conicyt por los financiamientos otorgados que me permitieron cursar mis estudios.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El perfil farmacocinético de los adultos mayores sufre una serie de alteraciones debido a que experimentan cambios fisiológicos asociados al envejecimiento capaces de modificar la estructura y funcionamiento de los diferentes sistemas de su organismo. Dichos cambios, sumados a las co-morbilidades que pueden presentar estos pacientes al ser hospitalizados en unidades no críticas, condicionan la respuesta y éxito de las terapias farmacológicas con antimicrobianos, dado que pueden afectar el logro de un índice PK/PD óptimo. El objetivo de este estudio fue desarrollar y optimizar una metodología analítica mediante HPLC acoplado a un detector UV/Vis para cuantificar ertapenem en plasma humano, para posteriormente ser aplicado en la caracterización del perfil farmacocinético de este antibiótico en adultos mayores hospitalizados en unidades no críticas, a los que, además, se les debió determinar su composición corporal. Para llevar a cabo lo anterior se reclutó a pacientes hospitalizados en la Unidad Geriátrica de Agudos del Hospital Clínico de la Universidad de Chile, a los que se les realizaron mediciones antropométricas y se les extrajeron muestras de sangre que fueron almacenadas para su posterior análisis. Paralelamente se trabajó evaluando diferentes condiciones experimentales que influyeran en el desarrollo de la metodología analítica y que permitieran validarla según parámetros internacionales. La metodología analítica desarrollada utilizó una columna Waters Spherisorb® y una fase móvil ajustada a pH 2,4 compuesta por el 70% de buffer fosfato 10 mM y 30% de acetonitrilo. Además, la velocidad de flujo fue de 0,9 ml/min y la longitud de onda utilizada fue de 310 nm. A la metodología se le realizaron diferentes ensayos para validarla, pero no cumplió con el parámetro de exactitud y precisión inter-día, por lo que se descartó. Por otro lado, de los 3 pacientes reclutados, 2 correspondieron a hombres y la edad promedio de la muestra fue de 82,3 ± 8,0 años. El peso real se pudo determinar en solo 2 pacientes y dio un promedio de 59,2 ± 15,4 kg. A su vez, el peso y la estatura se estimaron con diferentes métodos, arrojando valores de 54,5 ± 8,1 kg y 49,8 ± 3,8 kg y de 1,65 ± 0,1 m y 1,52 ± 0,1 m, respectivamente. El IMC clasificó a la muestra como normal o con déficit de peso, dependiendo de los datos utilizados. En relación a la composición corporal y estado nutricional de cada paciente, se pudo determinar que ID#1 estaba en riesgo de desnutrición/desnutrición, ID#2 se hallaba normal e ID#3 se encontraba en desnutrición/normal / The pharmacokinetic profile of older adults suffers a series of alterations because they experience physiological changes associated with aging, capable of modifying the structure and functioning of the different systems of their organism. These changes, added to the co-morbidities that these patients can present when hospitalized in non-critical units, condition the response and success of pharmacological therapies with antimicrobials, since they can affect the achievement of an optimal PK/PD index. The objective of this study was to develop and optimize an analytical methodology using HPLC coupled to a UV/Vis detector to quantify ertapenem in human plasma, to be subsequently applied in the characterization of the pharmacokinetic profile of this antibiotic in older adults hospitalized in non-critical units, to which, in addition, their body composition should have been determined. To carry out the above, hospitalized patients were recruited in the Geriatric Acute Unit of the Hospital Clínico de la Universidad de Chile, who underwent anthropometric measurements and blood samples were taken and stored for later analysis. At the same time, we worked evaluating different experimental conditions that influenced the development of the analytical methodology and that allowed to validate it according to international parameters. The developed analytical methodology used a Waters Spherisorb® column and a mobile phase adjusted to pH 2.4 composed of 70% of 10 mM phosphate buffer and 30% of acetonitrile. In addition, the flow rate was 0.9 ml/min and the wavelength used was 310 nm. The methodology was subjected to different tests to validate it, but it did not comply with the parameter of accuracy and precision inter-day, so it was discarded. On the other hand, of the 3 patients recruited, 2 corresponded to men and the average age of the sample was 82.3 ± 8.0 years. Actual weight could be determined in only 2 patients and averaged 59.2 ± 15.4 kg. In turn, weight and height were estimated using different methods, yielding values of 54.5 ± 8.1 kg and 49.8 ± 3.8 kg and of 1.65 ± 0.1 m and 1.52 ± 0.1 m, respectively. The body mass index classified the sample as normal or with a weight deficit, depending on the data used. In relation to the body composition and nutritional status of each patient, it was determined that ID#1 was at risk of malnutrition/malnutrition, ID#2 was normal and ID#3 was malnutrition/normal

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las quinolonas y fluoroquinolonas corresponden a un grupo de drogas antibacterianas que han sido ampliamente utilizadas en medicina veterinaria. Particularmente, durante la última década, el uso de estos fármacos ha sido explosivo en producción animal, con el consecuente riesgo de generar residuos de estos fármacos en productos destinados a consumo humano. Con el objetivo de entregar a los consumidores un producto inocuo libre de residuos peligrosos para la salud, se han establecido límites máximos residuales (LMR) por parte de varios países como Japón y Chile y organizaciones internacionales, como la Food and Drug Administration (FDA) y la Unión Europea. El control necesario para que los productos de origen pecuario cumplan con los LMR se realiza dentro de Programas de Control de Residuos. Dichos programas deben contar con metodologías analíticas validadas. En este contexto, el objetivo de este trabajo fue validar un método analítico confirmatorio para la detección de residuos de ácido oxolínico y flumequina en músculo de pollos broiler, mediante el empleo de Cromatografía Líquida con Detector de Masa (LC-Ms/Ms) de acuerdo a las normativas de la Comunidad Europea y la de Estados Unidos de América, de manera que pueda ser utilizado en el Programa Nacional de Control de Residuos de Productos de Exportación. Para validar el método fue necesario fortificar muestras de músculo de pollos broiler libres de antimicrobianos con distintas concentraciones de ácido oxolínico y flumequina y analizarlas utilizando Cromatografía Líquida acoplado a un Detector Masa-Masa (LC-Ms/Ms). La sensibilidad del método determinó un límite de detección o CC de 0,72 µg/kg para ácido oxolínico y 0,53 µg/kg para flumequina. Se obtuvo un límite de cuantificación o CC de 1,21 µg/kg para ácido oxolínico y 1,54 µg/kg para flumequina. El coeficiente de correlación para los analitos fue mayor a 0,9 (R>0,9). De acuerdo a los resultados obtenidos, el método cumple con las condiciones de validación establecidas por la Decisión 2002/657/CE, en relación a los parámetros de linealidad, sensibilidad y repetitividad. En el caso de la recuperación, debido a que este parámetro arrojó valores no aceptados por la norma (Unión Europea, 2002), éste debe ser reevaluado previo al análisis de muestras para la detección de residuos de ácido oxolínico y flumequina en músculo de pollo en caso que éste sea utilizado en un Programa de Control de Residuos. / Quinolones and fluoroquinolones are a group of antibacterial drugs that has been widely used in veterinary medicine. During the last 10 years, these drugs have had an explosive use in food producing animals, wich may cause drug residues in products for human consumption. To assure the delivery of safe products to consumers, maximum residual limits (MRLs) have been established by countries such as Japan and Chile and different organizations, such as the Food and Drug Administration (FDA) and the European Union. Control Programs of Drug Residues are required in order that products from animal origin fulfill the MRLs. These programs must operate with adequately validated analytical methodologies. In this context, the objective of this work was to validate a confirmatory analytical method for the detection of oxolinic acid and flumequine in muscle of chickens, by means of the use of Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-Ms/Ms) according to the European Community and the United States of America requirements, so that it can be used in the National Control Program of Residues of animal products that will be exported to other countries. To validate the analitical method, free-drug muscle samples collected from broiler chickens analysis were needed. Samples were spiked with different concentrations of oxolinic acid and flumequine and analized using LC-Ms/Ms. The sensitivity of the method expressed as detection limit (CC) was 0.72 µg/kg for oxolinic acid and 0.53 µg/kg for flumequine. The detection capability (CCβ) was 1.21 µg/kg for oxolinic acid and 1.54 µg/kg for flumequine. The coefficient of correlation for the analytes was higher than 0.9 (R>0.9). According to these results, the method fulfills the conditions of validation established by Decision 2002/657/CE, in relation to parameters of linearity, sensitivity and repeatability. In the case of the recovery, this parameter threw unacceptable values compared with the established in european regulations (European Community, 2002), and must be again assessed previous to the analysis of samples for oxolinic acid and flumequine residues in a Control Programs of Residues.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de especialización Bioquímica Ambiental y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las abejas llevan a cabo el mayor porcentaje de polinizaciones, tanto de plantas silvestres como domésticas, lo que les otorga una función invaluable para el medio ambiente y los productores que se benefician de ellas. En los últimos años se ha visto disminuido notoriamente su número, representado por la cantidad de colonias perdidas después de la temporada de invierno. Las colonias están sufriendo un síndrome denominado Desorden de Colapso de Colmena (DCC) que consiste en el abandono repentino de la colmena por la mayoría de las abejas obreras. Hasta ahora no se ha podido describir ningún agente que por sí solo desencadene el síndrome, sin embargo, se ha atribuido relevancia a distintos factores que podrían tener influencia en este fenómeno. Algunos de estos factores son patógenos, parásitos y pesticidas. Nosema ceranae es un microsporidio que inicialmente se encontraba en la abeja melífera asiática (Apis cerana) y que en los últimos años ha infectado a la abeja melífera occidental (Apis mellifera). Estudios han relacionado la presencia de N. ceranae con colmenas afectadas por DCC, postulándolo como un factor importante en el desarrollo del síndrome. Individualmente, N. ceranae induce estrés metabólico e inmunosupresión en abejas melíferas, lo que finalmente podría afectar a la colmena comprometiendo así su inmunidad social. La inmunidad social corresponde al conjunto de respuestas que los organismos sociales presentan frente a un patógeno o amenaza, que comprende principalmente cambios en el comportamiento y secreciones en el alimento que producen (jalea real y miel). La miel, además de ser el alimento para las abejas de la colmena, posee actividad antimicrobiana debido a la presencia de peróxido de hidrógeno, generado por la enzima glucosa oxidasa (GOX), metilglioxal (en el caso de la miel de Manuka) y defensina-1, lo que contribuye a la inmunidad social de la colmena. Defensina-1 es un péptido con actividad antimicrobiana producido por distintos tejidos en la abeja melífera, incluyendo las glándulas hipofaríngeas y mandibulares, desde donde se secreta hacia la miel y la jalea real. En este estudio se propone que N. ceranae produce una inmunosupresión en abejas melíferas, lo que se traduciría en una menor generación de peróxido de hidrógeno y presencia de defensina-1 en la miel, indicando un compromiso de su inmunidad social. Dado lo anterior, la hipótesis propuesta es “La miel producida por abejas de la especie Apis mellifera infectadas con el microsporidio Nosema ceranae contiene menor cantidad del péptido antimicrobiano defensina-1 y una actividad de glucosa oxidasa disminuida en relación a la producida por abejas no infectadas.” Los objetivos generales de la tesis fueron: A) Relacionar la presencia del péptido antimicrobiano defensina-1 y la actividad de glucosa oxidasa en miel con la infección por Nosema ceranae en abejas y; B) Contar con métodos de análisis simples para establecer la presencia de defensina-1 en miel basados en espectroscopía molecular. Para ello se obtuvo la fracción comprendida entre 3 y 10 kDa de muestras de miel obtenidas desde el valle central de la región de O’Higgins. Esta fracción se caracterizó mediante fluorescencia y resolución multivariada de curva (MCR), lo que permitió evidenciar la presencia de la defensina por detección del triptófano presente en el péptido. Además, en esta fracción se determinó la presencia de enlaces disúlfuro, asociados a la estructura de la defensina, cuya concentración estuvo correlacionada con la concentración relativa de triptófano en la misma. En la miel no fraccionada se determinaron la actividad de GOX y la actividad antibacteriana, las que estuvieron relacionadas con el contenido relativo de defensina-1. Por otra parte, se expresó y purificó defensina-1 recombinante desde E. coli la que fue sometida a la misma caracterización y/o análisis de la miel fraccionada, permitiendo así tener un patrón de comparación. Paralelamente se determinó la presencia de N. ceranae en las abejas de las colmenas muestreadas mediante recuento de esporas en el microscopio y amplificación de su material genético a través de PCR en tiempo real. Al evaluar el conjunto de resultados se observó que la miel producida por abejas infectadas o que habían sufrido una reciente infección con Nosema spp contenía mayor cantidad de defensina-1 y mayor acumulación de peróxido de hidrógeno en relación a la producida por abejas no infectadas, lo que demuestra que la infección habría inducido una mayor producción del péptido y GOX siendo reflejado en la miel. Esto último se contrapone a la hipótesis planteada inicialmente. Sin embargo, las mieles que presentaron esta relación tienen además un origen geográfico y floral común; lo que igualmente podría ser la causa de la relación observada o que la defensina-1 y GOX se expresen constitutivamente en mayor cantidad en estas colonias, presentando así una ventaja genética sobre otras ante posibles infecciones / Honey bees are responsible of the highest percentage of pollination, including wild and domesticated plants, which gives them a priceless function for environment and producers who benefit from them. In recent years their number has been reduced, represented in the loss of colonies after winter season. Colonies are suffering a syndrome called Colony Collapse Disorder (CCD) which consists in the sudden abandonment of the colony by most of the worker bees. Until now there is no agent described that can trigger the syndrome by itself, however, several factors have been attributed to influence in this phenomenon. Some of these factors are pathogens, parasites and pesticides. Nosema ceranae is a microsporidian which was founded at first in the Asiatic honeybee (Apis cerana) and in the last years has infected the European honeybee (Apis mellifera). Studies have related de N. ceranae presence in bee hive affected by CCD, postulating it as an important factor in the development of this syndrome. Individually, N. ceranae induce metabolic stress and immunosuppression in honeybees, compromising the social immunity. Social immunity is the group of responses that social organisms have developed against a pathogen or threat, includes mainly behavior changes and secretions to the food produced (royal jelly and honey). The honey is the food for hive’s bee and has antimicrobial activity due to the presence of hydrogen peroxide, generated by glucose oxidase enzyme (GOX), methylglyoxal (in manuka honey) and defensin-1, which contributes to the social immunity of the hive. Defensin-1 is a peptide with antimicrobial activity produced by several cell types in the honey bee, including hypopharyngeal and mandibular glands, from where it is secreted towards honey and royal jelly. In this study, it is proposed that N. ceranae produces an immunosuppression in honey bees, which would result in a lower generation of hydrogen peroxide and the presence of defensin-1 in honey, indicating a compromise of their social immunity. Given the last, the proposed hypothesis is "The honey produced by bees (Apis mellifera) infected with Nosema ceranae contains less antimicrobial peptide defensin-1 and decreased glucose oxidase activity in relation to that produced by non-infected bees." The general objectives of the project are: A) To relate the presence of the antimicrobial peptide defensin-1 and the activity of glucose oxidase in honey with the infection by Nosema ceranae in bees and; B) Have simple analysis methods to establish the presence of defensin-1 in honey based on molecular spectroscopy. For this, the fraction comprised between 3 and 10 kDa of honey samples from the central valley of the O'Higgins region was obtained. This fraction was characterized by fluorescence and multivariate curve resolution (MCR), which allowed to demonstrate the presence of the defensin by detection of tryptophan present in the peptide. In addition, in this fraction the presence of disulfide bridges, associated with the structure of the defensin, whose concentration was correlated with the relative concentration of tryptophan in it, was determined. In the unfractionated honey, GOX activity and antibacterial activity were determined, which were related to the relative content of defensin-1. On the other hand, recombinant defensin-1 was expressed and purified from E. coli which was subjected to the same characterization and/or analysis of the fractionated honey, thus allowing to have a comparison pattern. In parallel, the presence of N. ceranae in the bees of the sampled hives was determined by counting the spores in the microscope and amplifying their genetic material through real-time PCR. When evaluating the set of results, it was observed that the honey produced by bees infected or that had suffered a recent infection with Nosema spp contained a greater amount of defensin-1 and a greater accumulation of hydrogen peroxide in relation to that produced by non-infected bees. Results show that the infection would have induced a higher production of the peptide and GOX being reflected in the honey. These results are the opposite of the proposed hypothesis. However, the honeys that presented this relationship also have a common geographical and floral origin; what could equally be the cause of the observed relationship or that defensin-1 and GOX are constitutively expressed in greater quantity in these colonies, thus presenting a genetic advantage over others in the face of possible infections / Fondecyt