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Produção de fragmentos de anticorpos monoclonais (scFv) contra isolados de campo do vírus da bronquite infecciosa das galinhas utilizando phage display /

Fernandes, Camila Cesario. January 2009 (has links)
Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Camillo Del Cistia Andrade / Banca: Janete Apparecida Desidério Sena. / Resumo: Anticorpos monoclonais se constituem na base de vários testes usados na detecção e na identificação de antígenos. Nesse contexto, tais imuno-reagentes têm sido extensivamente empregados na identificação de estirpes virais envolvidas na etiologia de surtos de bronquite infecciosa a campo, permitindo o aperfeiçoamento das técnicas de detecção e caracterização antigênica do vírus da bronquite infecciosa das galinhas (VBI). No presente estudo, uma biblioteca de fragmentos de anticorpos de galinha originalmente preparada por "phage display" contra a estirpe vacinal (H120) do VBI, foi usada para a seleção de fragmentos de anticorpos recombinantes com reatividade cruzada para as estirpes heterólogas IBVPR01, IBVPR05, isoladas de surtos a campo no Brasil e SE-17, isolada nos Estados Unidos. Após três ciclos de "panning", foi identificado pelo ELISA um conjunto de 15 anticorpos scFv expressos em fagos e com reatividade cruzada para essas mesmas estirpes do VBI. A análise por Western-blotting revelou que três desses clones apresentavam fagos expressando fragmentos de anticorpos monoclonais com reatividade cruzada para a nucleoproteína N das três estirpes do VBI e também para a forma recombinante dessa nucleoproteína derivada da estirpe M41. Concluindo, os fragmentos de anticorpos monoclonais recombinantes scFv-N produzido em fagos interagem com um epítopo mais conservado da proteína N do VBI e apresentam um grande potencial para utilização na detecção e no diagnóstico direto desse vírus e no estudo de evolução de variantes desse vírus. / Abstract: Monoclonal antibodies are the basis of various techniques used for antigen detection or characterization, and their use is specially recommended for the identification of viral strains involved in the etiology of outbreaks of infectious bronchitis, because these antibodies are homogeneous, highly specific and fully characterized, allowing the improvement of detection of immunological techniques and antigenic characterization of avian infectious bronchitis virus strains (IBV). We used a phage display library prepared previously against the IBV vaccine strain (H120) for the selection of new scFv antibody fragments reacting with heterologous IBV strains isolated from outbreaks in Brazil (IBVPR01, IBVPR05) and USA (SE-17). After three cycles of panning a set of 15 scFv antibodies was expressed in phages and exhibited crossreaction in ELISA with these three viral strains. Western-blotting analysis showed that three of this clone set were expressing scFv specific for the nucleoprotein of these IBV strains, as well as to the recombinant form of this protein derived from M41 strain of IBV. In conclusion, the recombinant fragments of monoclonal antibodies expressed by phage-display technique have a great potential for future use in immunodiagnostic techniques and study the evolution of variant strains of this virus. / Mestre
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Dificuldades na obtenção e caracterização de anticorpos monoclonais murinos anti-proteína F recombinante do vírus (RSV) para diagnóstico laboratorial /

Souza, Aparecida Vitória Gonçalves de. January 2009 (has links)
Orientador: Elenice Deffune / Banca: Mirthes Ueda / Banca: Rejane Tommasini Grotto / Resumo: O Vírus Sincicial Respiratório humano (VSR) é o principal agente causal das Infecções Respiratórias Agudas (IRAs) em lactantes e pré-escolares. Apresenta dois subgrupos - A e B - sendo o primeiro responsável por quadros clínicos mais graves. Os RNA mensageiros virais codificam 11 proteínas conhecidas, das quais a proteína F é responsável pela fusão viral à célula e se apresenta na forma de F0 com peso molecular de 67kDa, podendo ser clivada em duas unidades: F2 de 20kDa e a F1 de 47kDa. A proteína F recombinante (Fr), expressa em E.coli (BL21A no vetor pET28a), foi cedida por pesquisadores da UNESP de São José do Rio Preto. Com intuito de produzir anticorpos monoclonais contra a proteína Fr para fins de diagnóstico laboratorial, inoculamo-la em camundongos isogênicos Balb/c. Durante o desenvolvimento do monoclonal, foi necessário a eliminação da contaminação de cultura por Mycoplasma ssp. Após ajuste de dose de inoculação e descontaminação do antígeno (hipótese: contaminação com endotoxinas provenientes de E.coli), seis clones secretores de anticorpos monoclonais foram produzidos (5 do tipo IgM e 1 do tipo IgG2a) e testados, simultâneamente, contra toxina bacteriana e proteína Fr (40μg/mL) por técnica de ELISA indireto. Paralelamente, testes por citometria de fluxo foram realizados, incubando-se os clones obtidos com E.coli (bactéria com membrana permeabilizada e in natura). Os clones (VIRSV2-87A74 e VIRSV2-87A80) apresentam um reconhecimento inespecífico de proteínas da E. coli e não foi possível caracterizar os clones obtidos em função da dificuldade de se obter novas amostras de proteína Fr. Para o futuro, os anticorpos obtidos deverão ser marcados com isotiocinato de fluoroceína e comporem um amplo teste epidemiológico em paralelo com o kit disponível em mercado respeitando a sazonalidade da doença. Novos ensaios para caracterização... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Human Respiratory Syncytial Virus (HRSV) is the main cause of Acute Respiratory Insufficiency in suckling child and children below 5 years old. It has 2 subgroups - A and B - being the first one responsible for more dangerous clinical situations. The viral messenger RNA codifies 11 known proteins, which the F protein is responsible for the viral fusion and it is presented as F0 with molecular weight of 67kDa, but once is broke it generates two units: F2 with 20kDa and F1 with 47kDa. The recombinant F (Fr) protein were expressed on E.coli (BL21A, on vector pET28a), and it was given to us by researches from UNESP of São José do Rio Preto. Wishing to produce monoclonal antibodies (Mab) against Fr protein to laboratorial diagnosis, mice (Balb/c) were inoculated with de antigen (Fr protein). During the development of the Mab, it was necessary to eliminate, from the culture, Mycoplasma spp. After we adjusted the necessary amount to inoculate on the mice and eradicated the contamination of the antigen (hypotheses: there were endotoxins from the E.coli), six clones that secrete Mab were produced (5 of the kind IgM, and 1 of the kind IgG2a) and they were tested, simultaneously, against bacterium toxin and Fr protein (40μg/mL) using ELISA technique. Together, flow cytometry test were performed when we incubated the clones with E. coli (bacterium with permeable membrane and in natura). The clones (VIRSV2-87A74 and VIRSV2-87A80) presented an unspecific recognition for the proteins from E.coli and it was not possible to characterize the cells because we couldn't get more samples of Fr protein. For the future, the Mab should be conjugated with FITC and then, they must be part of a wide epidemiologic test side by side from the commercial kit, always respecting the seasonal disease. New assays to characterize antibodies (like Western blotting and imunepreciptation) are already being done... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre
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Diarréia viral bovina(BVD) : aspectos epidemiológicos da infecção persistente, avaliação sorológica da resposta imune e caracterização molecular do virús /

Dias, Fabio Carvalho. January 2008 (has links)
Orientador: Samir Issa Samara / Banca: Claudia Del Fava / Banca: Amauri Alcindo Alfieri / Banca: Adolorata Aparecida Bianco Carvalho / Banca: Aramis Augusto Pinto / Resumo: A ocorrência de anticorpos neutralizantes contra os genótipos do vírus da diarréia viral bovina (BVDV 1 e BVDV 2) foi verificada, pelo teste de virusneutralização (VN), em 260 amostras de soro sangüíneo de 26 rebanhos não vacinados contra o BVDV, provenientes dos Estados de Minas Gerais e São Paulo. Do total de amostras, 102 (39,2%) reagiram ao BVDV, das quais 81 (31,1 %) foram reagentes ao BVDV 1 e ao BVDV 2, sete (2,7%) reagiram apenas ao BVDV 1 e 14 (5,4%) reagiram apenas ao BVDV 2. Nos mesmos rebanhos, verificou-se também a presença sugestiva de animais persistentemente infectados (PI) por meio da pesquisa de anticorpos neutralizantes em cinco amostras de soro sangüíneo de bezerros sentinelas com idade entre 6 e 12 meses. A ocorrência de animais PI foi pesquisada em três dos 26 rebanhos, dos quais foram colhidas amostras pareadas de sangue de todos os animais do rebanho. Todas as amostras foram submetidas ao teste de VN contra o BVDV 1 e o BVDV 2, e naquelas não reagentes a pelo menos um dos genótipos, bem como nas amostras provenientes de bovinos com menos de seis meses de idade, foi realizada a pesquisa do vírus pela RT-PCR. Em um dos rebanhos foram detectados dois animais PI, cujas estirpes foram caracterizadas geneticamente como pertencentes ao subgenótipo eVOV 1 b. A infecção natural pelo BVDV foi monitorada nos três rebanhos selecionados para a pesquisa de animais PI, sendo que em dois deles constatou-se a eliminação do BVDV. No entanto, a infecção permaneceu no rebanho em que haviam sido detectados dois animais PI, pois foram diagnosticados posteriormente um animal transitoriamente infectado (TI) e novos animais reagentes ao vírus. Foram submetidos à análise estatística os resultados dos testes de VN contra o BVDV 1 e o BVDV 2, realizados em 1925 amostras de soro sangüíneo obtidas no período de execução... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The occurrence of neutralizing antibodies against to bovine viral diarrhoea virus genotypes (BVDV 1 and BVDV 2) has been confirmed by virusneutralization test (VN) in 260 samples of blood serum undertaken in the states of Minas Gerais and São Paulo, Brazil. Samples were retrieved from 26 cattle herds which were not BVDV vaccinated. One hundred and two samples (39.2%) were reagents to BVDV, or rather, 81 (31.1%) were reagents to BVDV 1 and BVDV 2, seven (2.7%) were reagents to BVDV 1 only and 14 (5.4%) were reagents to BVDV 2 only. In the same herds, the significant presence of persistently infected (PI) animais was also verified by a research involving neutralizing antibodies in five samples of blood serum in 6 to 12¬month-old calves. The occurrence of PI animais was researched in three out of 26 herds by paired blood samples of total animais in the herdo Ali samples were analyzed by VN test against to BVDV 1 and BVDV 2, and virus research was undertaken by RT-PCR in samples which were not reagent to at least one of the genotypes and in samples of less than 6-month-old cattle. Two PI animais, genetically characterized as belonging to BVDV 1 b subgenotype, were detected in one of the herds. BVDV natural infection was monitored in three herds selected for PI animais research. BVDV was eliminated in two herds. However, infection remained in the herd in which two PI animais were diagnosed, because a transiently infected animal (TI) and other virus-reagent animais were detected later on. Statistical analysis evaluated VN test results against BVDV 1 and BVDV 2 with 1925 samples of blood serum obtained during the research period. Although no significant ditterences were found between BVDV 1 reagent bovines and BVDV 2 reagent ones (p>0.05), a significant ditterence was detected among titles of antibodies from samples which were reagent to both genotypes (p<0.0001). / Doutor
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Determinação do período de absorção de imunoglobulinas pela mucosa intestinal de cabritos : influência do tempo decorrido entre o nascimento e a ingestão de colostro nos parâmetros bioquímicos, hemogasométricos e imunológicos de caprinos recém-nascidos /

Yanaka, Rodrigo. January 2009 (has links)
Orientador: Francisco Leydson Formiga Feitosa / Banca: Raimundo de Souza Lopes / Banca: José Jurandir Fagliari / Resumo: Os objetivos deste estudo foram determinar o período de absorção intestinal de macromoléculas colostrais em cabritos alimentados com colostro bovino e caprino, e avaliar a variação dos parâmetros bioquímicos, hemogasométricos e imunológicos de cabras e cabritos no período até 75 dias pós-parto. Para tanto, determinaram-se as concentrações séricas de proteína total (refratometria), separação eletroforética das frações protéicas (eletroforese em acetato de celulose), imunoglobulina G (IgG) bovina e caprina (imunodifusão radial), as atividades séricas de aspartatoaminotransferase (AST), fosfatase alcalina (FA), gamaglutamiltransferase (GGT), os teores de creatinina e ureia, e os valores hemogasométricos e glicêmicos, nos momentos zero, dois, sete, 15, 30 e 75 dias pós-parto. Os cabritos que ingeriram colostro bovino até 12 horas pós-nascimento adquiriram títulos regulares de imunoglobulinas. Após 22 horas pós-parto, os cabritos não tiveram absorção adequada de macromoléculas colostrais, sendo classificados como portadores de falha de transferência de imunidade passiva. Aos 75 dias, todos os cabritos possuíam inadequadas concentrações de IgG. Os cabritos alimentados com colostro caprino tiveram concentrações mais elevadas de IgG quando comparados aos daqueles que ingeriram colostro bovino. Aos dois dias pósnascimento a concentração de GGT teve correlação significativa com a IgG, podendo, esta enzima, ser utilizada na avaliação da transferência de imunidade passiva. As cabras e os cabritos tiveram variações protéicas, bioquímicas e hemogasométricas até os 75 dias pós-parto, com pouca relevância clínica. / Abstract: The aims of this study was to determine the absorption period of colostrum macromolecules by intestinal wall of goat kids fed bovine or caprine colostrum, and evaluate the variation of biochemistry, blood gas and immunologic parameters of goats and kids at post-partum period until 75 days. To accomplish these objectives the serum concentrations of total protein (refractometry), electrophoretic proteins fractions separation (acetate cellulose electrophoresis), bovine and caprine immunoglobulin G (IgG) by radial immunodiffusion assay, biochemicals assays for aspartateaminotransferase (AST), alkaline phosphatase (ALP), gammaglutamyltransferase (GGT), creatinine and urea, hole blood assays for blood gas parameters and glycemia were determined at zero, two, seven, 15, 30 and 75 days postpartum. Kids which fed bovine colostrum until 12 hours after birth have acquired regular immunoglobulins titres. After 22 hours postpartum kids didn't presented adequate absorption of colostrum macromolecules, being classified as failure of passive immunity transference. Although all kids presented bovine IgG at 75 days after birth, their low concentrations doesn't provide adequate protection. Kids fed caprine colostrum presented higher concentrations of IgG compared to those fed bovine colostrum. At two days after birth GGT concentration correlated significantly with IgG, so it can be used as passive immunity predictor. Goats and kids had variations on protein, biochemical and blood gas variables until 75 days postpartum, but with physiological and/or nutritional causes, these findings had little clinical relevance for the animals. / Mestre
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Anticorpos policlonais, leveduras vivas e monensina sódica em dietas de alto concentrado para bovinos confinados /

Rodrigues, Érico, 1977- January 2010 (has links)
Orientador: Mário de Beni Arrigoni / Banca: André Mendes Jorge / Banca: Rafael da Costa Cervieri / Banca: Cristiana Andrighetto / Banca: Alexandre Amstalden Moraes Sampaio / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da alimentação de bovinos da raça Nelore com dietas de alto concentrado com preparado anticorpo policlonal (PAP), leveduras vivas - Saccharomyces cerevisae (LEV), monensina sódica (MON), associação entre PAP e LEV (MIX) e sem aditivos - controle (CTL) no desempenho, características de carcaça e custo do quilograma de peso vivo ganho em confinamento. Foram utilizados 95 bovinos Nelore, não castrados, com 20 meses de idade, oriundos de recria a pasto, terminados em confinamento por 112 dias com dietas de alto concentrado iso-protéicas e iso-energéticas. Não houve efeito (P>0,05) do ionóforo MON sobre ingestão de matéria seca durante o período de confinamento, porém a MON exerceu efeito (P<0,05) reduzindo a ingestão de matéria seca em percentagem do peso vivo nos primeiros 28 dias de confinamento em relação aos demais aditivos alimentares. Não houve efeito (P>0,05) do ionóforo MON em relação ao ganho de peso médio diário ao longo do confinamento, mais houve efeito negativo (P<0,05) do aditivo LEV, que diminuiu o ganho de peso dos animais ao longo do período de confinamento, consequentemente apresentou uma pior (P>0,05) conversão alimentar e um maior (P>0,05) custo para o quilo ganho em confinamento. O fornecimento de leveduras vivas também propiciou menor (P<0,05) peso de carcaça quente e peso de carcaça em arrobas. Os animais que receberam os aditivos alimentares PAP e LEV apresentaram (P<0,05) menor quantidade de gordura visceral na carcaça em relação aos animais que receberam MON. A utilização de PAP e LEV não alteram (P>0,05) as medidas de área de olho de lombo (AOL), espessura de gordura subcutânea (EGS) e espessura de gordura subcutânea do músculo Biceps femoris (EGG) em relação à MON e CTL / Abstract: The objective of this study was to evaluate the effects of feeding Nellore bullocks with high concentrate diets containing: polyclonal antibody preparation (PAP), live yeast - Saccharomyces cerevisae (LEV), sodic monensin (MON), the association of PAP e LEV (MIX) and a control group on performance, carcass traits, and cost of gain. The diets were iso-energetic and iso-proteic and the feeding period was 112 days. There was no effect (P>0.05) of feeding ionophores on dry matter intake during total feeding period, however MON reduced (P<0.05) dry matter intake as body weight percentage in the first 28 days, compared to the others feed additives. There was no effect (P>0.05) of feeding MON in averaged daily gain, but on the other hand, there was found a negative effect (P<0.05) of feeding LEV, which decreased averaged daily gain, increased feed conversion and cost of gain. The addition of LEV in the diets also decreased (P<0.05) hot carcass weight. Animals that received PAP and LEV presented (P<0.05) less visceral fat than MON. The inclusion of PAP and LEV did not altered (P>0.05) ultrasound measurements compared to MON and CTL / Doutor

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