LIMA, D. J. B. Estudo da atividade anticâncer da marinobufagenina, um bufadienolídeo extraído de anfíbios da espécie Rhinella marina. 2016. 92 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal do Ceará, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-03-29T11:16:23Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_djblima.pdf: 1352205 bytes, checksum: e38247c17ab1d644502df66d14a1b12c (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-03-29T11:16:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_djblima.pdf: 1352205 bytes, checksum: e38247c17ab1d644502df66d14a1b12c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-29T11:16:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_djblima.pdf: 1352205 bytes, checksum: e38247c17ab1d644502df66d14a1b12c (MD5) Previous issue date: 2016-01-22 / Cancer is a complex genetic disease, considered one of the leading causes of death in the world. The use of substances derived from natural products has grown over the years and is an important source for the therapeutic arsenal. Bufadienolides, a group of cardioactive steroids with a 24 carbon structures are commonly found in glands of toads from Bufonidae family. These molecules a have wide range of biological activities, including anti-cancer effects. Bufadienolides have shown anti-proliferative effect on various human cancer cell lines by inducing death and cell cycle arrest. Marinobufagenin, a bufodienolide extracted from Rhinella marina toad especies was chosen to determine its standard cytotoxic and mechanism of action. Despite showing high cytotoxicity in human tumor cells, the sample showed no cytotoxicity to murine strains. In vitro experiments were performed using the PC3 prostate adenocarcinoma lineage. Cells were incubated with different concentrations of marinobufagenin (0.37, 0.75 and 1.5 mM) for 24 hours. The viability of PC3 cells was evaluated by flow cytometry, which showed that the number of cells reduced when incubated with the lowest concentration (0.37 mM) tested. However, no reduction in the percentage of cells with intact membranes was seen. The analysis of phosphatidylserine externalization by flow cytometry also revealed the increase of apoptotic cells at concentrations 0.75 and 1.5 uM. The flow citometry analysis of the nuclear contents, showed the accumulation of cells in G2 / M phase in all tested concentrations. Marinobufagenin did not damage the DNA in either PC3 or PBMC. In addiction, morphological changes were observed, including cytoplasmic shrinkage and perinuclear halo formation. Moreover, modifications on the pattern of cells adesion were also observed in cells treated with the bufadienolide. Despite lack of further studies to confirm its anticancer mechanisms, morphological changes occurred, the cycle-specific behavior and the lack of genotoxicity of Marinobufagenina make it an interesting molecule in the search for new drugs with antitumor potential. / O câncer é uma complexa doença de origem genética, considerada uma das principais causas de morte por doença no mundo. A utilização de substâncias derivadas de produtos naturais tem crescido com o passar dos anos, constituindo uma importante fonte no arsenal terapêutico. Os bufadienolídeos são esteróides cardioativos de 24 carbonos, isolados de extratos de glândulas de sapos da família Bufonidae. Essas moléculas possuem grande variedade de atividades biológicas, incluindo atividade anticâncer. Os bufadienolídeos tem demonstrado comportamento antiproliferativo em várias linhagens de células cancerígenas humanas por induzir morte e parada do ciclo celular. A marinobufagenina, um bufadienolídeo extraído do anfíbio Rhinella marina, foi escolhida para determinamos o seu padrão citotóxico e mecanismo de ação. Apesar de demonstrar alta citotoxicidade em células tumorais humanas, a amostra não apresentou citotoxicidade para linhagens murinas. Experimentos in vitro foram realizados utilizando-se a linhagem de adenocarcinoma de próstata PC3. As células foram tratadas com diferentes concentrações da amostra marinobufagenina (0,37, 0,75 e 1,5 μM) por 24 horas. A viabilidade das células PC3 foi avaliada por citometria de fluxo, mostrou que o número de células reduziu a partir da menor concentração (0,37 μM) testada sem, contudo, haver redução na porcentagem de células com membrana íntegra. A análise da externalização da fosfatidilserina por citometria de fluxo revelou aumento de células com padrão apoptótico nas concentrações 0,75 e 1,5 μM. Já a análise do conteúdo nuclear, nos mostrou acúmulo de células na fase G2/M em todas as concentrações testadas. A marinobufagenina não foi capaz de causar danos ao DNA de PC3 e de CMSP. Observou-se, ainda, uma série de alterações morfológicas e no citoesqueleto de células tratadas com o bufadienolídeo, a exemplo da acentuada retração citoplasmática e formação de halos perinucleares. Além disso, modificações do padrão adesivo das células também foram observadas em células tratadas com o bufadienolídeo. Apesar de necessitar de mais estudos para delinear seu mecanismo de ação anticâncer; as modificações morfológicas, o comportamento ciclo-específico e a ausência de genotoxicidade tornam a Marinobufagenina uma molécula interessante na prospecção de novos fármacos com potencial antitumoral.

Segundo a última estimativa, realizada em 2012 pelo projeto GLOBOCAN/IARC, o tipo de câncer mais incidente no mundo foi o câncer de pulmão, com mais de 1,8 milhões de casos diagnosticados. No Brasil, em 2016, existiram mais de 17000 e 10000 novos casos de câncer de pulmão entre homens e mulheres, respectivamente. O tabagismo representa a principal causa do câncer de pulmão e os tratamentos disponíveis são pouco efetivos, pois geralmente o diagnóstico é realizado quando a doença encontra-se em estágio avançado. Apesar dos avanços terapêuticos nas últimas décadas, 14% dos pacientes diagnosticados sobrevivem 5 anos. Neste contexto, a busca por novas propostas terapêuticas para o câncer de pulmão torna-se relevante. Os compostos metálicos de rutênio surgiram como uma alternativa promissora aos compostos a base de platina, por serem menos tóxicos e mais seletivos. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos de novos complexos de rutênio (II), PIPE e CINAM, sobre o comportamento proliferativo de células da linhagem A549, as quais são derivadas de adenocarcinoma de pulmão humano, um dos subtipos de câncer mais frequentemente diagnosticados em pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas. Além disso, objetivou-se entender os mecanismos envolvidos com a atividade antiproliferativa e citotóxica dos referidos complexos. A viabilidade celular foi determinada por ensaio colorimétrico (MTS) e ensaio de exclusão por azul de tripano. Adicionalmente foi realizado ensaio de capacidade clonogênica e análise de progressão do ciclo celular. A observação do padrão de distribuição de elementos do citoesqueleto e a determinação do índice mitótico foram feitos a partir de preparações citológicas marcadas para tubulina e actina F. O potencial pró-apoptótico foi investigado através do ensaio de anexina V e ensaio de despolarização de membrana mitocondrial. Os resultados demonstram que ambos os complexos estudados são efetivos em reduzir a viabilidade e inibir a proliferação de células A549, contudo CINAM mostrou-se mais citotóxico em relação ao PIPE. Quando PIPE foi utilizado na concentração de 9 μM foi possível observar aumento na frequência de células em G0/G1 com concomitante redução da população em S, indicando bloqueio do ciclo celular na transição G1/S, provavelmente, em decorrência da redução dos níveis de fosforilação de ERK e redução de expressão de ciclina D1. O efeito citotóxico de PIPE (18 μM) e CINAM (2 e 4 μM) está relacionado com atividade pró-apoptótica desses compostos. Os dados obtidos no presente estudo demonstram que PIPE e CINAM são promissores agentes antitumorais. / According to the last estimative performed in 2012 by GLOBOCAN/IARC, lung cancer is the most incident type of cancer with more than 1.8 million of diagnosed cases. In Brazil, there were more than 17,000 and 10,000 new cases of lung cancer in 2016, respectively, between men and women. Smoking represents the main cause of lung cancer, and available treatments are not very effective considering that the disease is commonly diagnosed in advanced stage. Although improving the therapeutic approach in the last decades, only 14% of the patients diagnosed with lung cancer survive for 5 years. In this framework, it is relevant to identify new therapeutic proposes against lung cancer. Ruthenium metal compounds emerge as a promising alternative to platinum-based compounds, therefore they displayed lower cytotoxic and they are more selectivity for tumor cells. Thus, the present study aimed to evaluate the effects of innovative ruthenium(II) complexes (PIPE and CINAM) on proliferative behavior of A549 cells, which are derived from human lung adenocarcinoma, a subtype of lung cancer more frequently diagnosed in patients with non-small cell lung cancer. Moreover, the possible molecular mechanisms involved with antiproliferative and cytotoxic activities of the ruthenium complexes were investigated. Cell viability was evaluated by colorimetric assay (MTS) and trypan blue exclusion assay. Clonogenic capacity assay and cell cycle analysis were also performed. Mitotic index determination and cytoskeleton analysis were carried out from cytological preparations stained for tubulin and F-actin. Pro-apoptotic potential was investigated through anexina V and membrane depolarization assays. Results demonstrated that both complexes (CINAM and PIPE) were effective in reducing cell viability and inhibiting proliferation of A549 cells, however CINAM was more cytotoxic than PIPE. When PIPE was used at 9 μM there was increase in G0/G1 cell population with concomitant reduction in frequency of cell in S-phase, indicating cell cycle arrest in G1/S transition. This event was, probably, due to reduction of phosphorylation levels of ERK and reduction of cyclin D1 expression. Cytotoxic effect of PIPE (18 μM) and CINAM (2 and 4 μM) is related to pro-apoptotic activity these compounds. Taken together, the data demonstrated that PIPE and CINAM are promising antitumor agents. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Os produtos naturais bioativos são fontes em potencial para o tratamento de diversas doenças associadas a altos índices de mortalidade na população mundial como, por exemplo, os cânceres e doenças infecciosas. Alguns fenilpropanoides, em especial o eugenol, o qual está presente nos óleos essenciais de diversas espécies vegetais, demonstram atividades relevantes como antimicrobianos e antiparasitários. Além disso, há diversos relatos científicos que demonstram o potencial antiproliferativo do eugenol frente a linhagens distintas de células tumorais. Da mesma forma, diversas substâncias que contêm o grupo funcional sulfonamida foram citadas como bioativa, em vista de apresentarem efeitos biológicos importantes, como antibacteriano, antifúngico, antiparasitário e antitumoral. Buscando a obtenção de novos produtos bioativos e em vista das ações biológicas relacionadas ao uso do eugenol e de sulfonamidas, empregou-se nesse trabalho a estratégia de hibridação molecular para o planejamento de substâncias inéditas que contemplassem resíduos estruturais do eugenol ou diidroeugenol e uma subunidade sulfonamídica. As oito substâncias finais propostas foram obtidas com sucesso a partir da condensação do cloreto de p-acetamidobenzenossulfonila com derivados orto e meta-aminofenóis, originados por sua vez de derivados nitrados do eugenol ou de seu análogo, diidroeugenol. Os produtos tiveram suas identidades confirmadas por meio de espectroscopia no infravermelho, de ressonância magnética nuclear e de massas. Na sequência, foram avaliados como antimicrobianos contra bactérias Gram-positivas (Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Enterococcus faecalis) e Gram-negativas (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella typhimurium) e contra espécies patogênicas ou oportunistas de Candida (C. albicans, C. tropicalis, C. krusei, C. glabrata e C. parapsilosis). Avaliou-se, ainda, a atividade anti-Trypanosoma cruzi em formas epimastigotas do parasito e também a atividade antiproliferativa contra linhagens celulares derivadas de cânceres humanos (A549, HepG2, HT144 e MCF7). Três derivados sulfonamídicos (7a, 7b e 7c) apresentaram atividade antibacteriana com valores de CI50 na faixa de 299,40 a 297,62 μM, frente Bacillus cereus e Staphylococcus aureus. Seis derivados sulfonamídicos (6a, 6c, 7a, 7b, 7c e 7d) exibiram atividade antifúngica com valores de CI50 entre 664,89 a 748,50 μM, frente C. albicans, C. krusei, C. glabrata e C. parapsilosis. Na avaliação da atividade tripanocida, todos os oito derivados sulfonamídicos mostraram-se ativos com valores de CI50 na faixa de 217,26 a 420,21 μM. Já na avaliação da atividade antiproliferativa, apenas três derivados (6b, 6d e 7a) exibiram atividade promissora frente a linhagem de adenocarcinoma de mama (MCF7) com valores de CI50 entre 116,60 a 164,90 μM. Mesmo que os valores de CI50 encontrados nestes ensaios biológicos sejam maiores que aqueles obtidos para os fármacos referência, é importante destacar que, em alguns, casos as substâncias híbridas propostas resultaram em produtos menos tóxicos e com maior atividade que seus precursores fenilpropanoides. Por conseguinte, representam moléculas inéditas passíveis de alteração estrutural para otimização de atividade. / Bioactive natural products are potential sources for the treatment of various diseases associated with high mortality rates in the world population, such as cancers and infectious diseases. Some phenylpropanoids, especially eugenol, which are present in the essential oils of several plant species, demonstrate relevant activities as antimicrobials and antiparasitics. In addition, there are several scientific reports that demonstrate the antiproliferative potential of eugenol against distinct lines of tumor cells. Likewise, several substances containing the sulfonamide functional group have been cited as responsible for important biological effects such as antibacterial, antifungal, antiparasitic and anticancer. In order to obtain new bioactive products and in view of the biological actions related to the use of eugenol and sulfonamides, it was proposed herein the use of molecular hybridization strategy in the design of new substances that contained structural motifs of eugenol or dihydroeugenol and a sulfonamide subunit. The eight final proposed substances were successfully obtained from the condensation of p-acetamidobenzenesulfonyl chloride with ortho and meta-aminophenols derivatives, which came from nitrated derivatives of eugenol or dihydroeugenol. The products checked by infrared spectroscopy, nuclear magnetic resonance and mass spectroscopy. They were evaluated as antimicrobials against Gram-positive (Staphylococcus aureus, Bacillus cereus and Enterococcus faecalis) and Gram-negative bacteria (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Salmonella typhimurium) and against pathogenic or opportunistic species of Candida (C. albicans, C. tropicalis, C. krusei, C. glabrata and C. parapsilosis). Anti-Trypanosoma cruzi activity in epimastigote forms of the parasite and antiproliferative activity against cell lines derived from human cancers (A549, HepG2, HT144 and MCF7) were also evaluated. Three sulfonamides derivatives (7a, 7b and 7c) presented antibacterial activity with IC50 values ranging from 299.40 to 297.62 μM, against Bacillus cereus and Staphylococcus aureus. Six sulfonamides derivatives (6a, 6c, 7a, 7b, 7c and 7d) exhibited antifungal activity with IC50 values between 664.89 and 748.50 μM, against C. albicans, C. krusei, C. glabrata and C. parapsilosis. In the evaluation of trypanocidal activity, all eight sulfonamides derivatives were active with IC50 values in the range of 217.26 to 420.21 μM. In the evaluation of antiproliferative activity, only three derivatives (6b, 6d and 7a) exhibited promising activity against the breast adenocarcinoma line (MCF7) with IC50 values between 116.60 and 164.90 μM. Even though the IC50 values found in these biological assays are higher than those obtained for the reference drugs, it is important to note that in some cases the proposed hybrid substances have resulted in less toxic and more active products than their phenylpropanoid precursors. Therefore, they represent new molecules that can be altered structurally for optimization of activity. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Alterações epigenéticas, como metilação do DNA e modificações pós traducionais em histonas, tem importante papel na carcinogênese mamária. A modulação de eventos epigenéticos constitui relevante alvo terapêutico, devido ao seu caráter reversível. Experimentalmente, o ácido docosahexaenoico (DHA), um membro da família dos ácidos graxos ômega-3, é capaz de diminuir proliferação, induzir morte celular e diminuir o potencial invasivo de células tumorais de mama. No entanto, os mecanismos antitumorais do DHA e sua capacidade de modular eventos epigenéticos ainda não estão totalmente elucidados. Nosso objetivo foi verificar, in vitro, a ação do DHA em eventos epigenéticos em diferentes linhagens de carcinoma mamário humano. Três linhagens celulares de câncer de mama (MDA-MB-231, SKBR-3 e MCF-7) foram tratadas durante 72 horas com 100 ?M de DHA ou etanol (controle). As modificações pós traducionais em histonas, acetilação no resíduo de lisina 9 da histona 3 (H3K9ac) e no resíduo 16 da histona 4 (H4K16ac), bem como trimetilação no resíduo de lisina 9 da histona 3 (H3K9me3) e no resíduo de lisina 27 da histona 3 (H3K27me3) foram avaliadas pela técnica de western blot. A análise da expressão do genes RASSF1A, DNMT1, DNMT3A e DNMT3B foi feita pela técnica da reação em cadeia da polimerase quantitativa via transcriptase reversa (RT-qPCR). A avaliação do padrão de metilação de região promotora do gene RASSF1A foi realizada pela técnica de reação em cadeia da polimerase metilação específica (MS-PCR). Foram também analisadas as fases do ciclo celular por citometria de fluxo. Comparado ao controle, o DHA induziu a acetilação no resíduo 16 da histona 4 (H4K16ac) nas linhagens MCF7 (p = 0,04) e MDA-MB-231 (p = 0,03). Observamos que a H3K9me3 foi parcialmente inibida nas linhagens MDA-MB-231 e SKBR-3, após o tratamento com DHA, mas sem alcançar valor estatisticamente significante. Encontramos também diminuição dos níveis de H3K27me3 após o tratamento com DHA nas três linhagens estudadas, porém não foi estatisticamente significativo. O DHA aumentou a expressão do gene RASSF1A na linhagem MCF-7 (1,98 vezes, p = 0,03), mas não nas linhagens MDA-MB-231 e SKBR-3. Não houve mudanças estatisticamente significativas na expressão dos genes DNMT1, DNMT3A e DNMT3B. As análises qualitativas da metilação demonstraram que a região promotora analisada do gene RASSF1A apresentou-se hipermetilada nas três linhagens celulares. Após o tratamento com DHA, houve tendência de desmetilação na região promotora do RASSF1A na linhagem MCF-7 e SKBR3, mas não na linhagem MDA-MB-231. Não houve diferença significativa na porcentagem de morte e distribuição das células MDA-MB-231, SKBR-3 e MCF-7 nas diferentes fases do ciclo celular após tratamento com DHA. Em conclusão, o DHA pode atuar em mecanismos epigenéticos e, ainda, reativar o gene supressor de tumor, como RASSF1A, anteriormente silenciado por hipermetilação, em células MCF-7. Espera-se que esses resultados contribuam para melhor compreensão do potencial papel anticâncer do DHA no câncer de mama / Epigenetic changes, such as DNA methylation and post-translational histone modifications, play an important role in mammary tumorigenesis. Epigenetic events are important as therapeutic targets, because of its reversible nature. Experimentally, docosahexaenoic acid (DHA), a member of the omega-3 fatty acids family, can reduce proliferation, induce apoptosis and decrease the invasive potential of breast tumor cells. However, the antitumor mechanism of DHA and its ability to modulate epigenetic events are not completely understood. Our objective was to verify, in vitro, the action of DHA in epigenetic events related to transcriptional reactivation of tumor suppressor gene, such as RASSF1A, in different human breast cancer cell lines. Three breast cancer cell lines (MCF-7, MDA-MB-231, SKBR-3) were treated with DHA (100 ?M) or vehicle (ethanol) for 72 hours. Western blot was used to analyze histone modification, as histone H3 lysine 9 (H3K9ac) and histone H4 lysine 16 (H4K16ac) acetylation, H3K9 trimethylation (H3K9me3) and H3K27 trimethylation (H3K27me3). Real time quantitative PCR (RT-qPCR) was performed for gene expression quantification of RASSF1A, DNMT1, DNMT3A and DNMT3B. DNA methylation of the promoter region of RASSF1A was evaluated by methylation specific PCR (MS-PCR). Moreover, we evaluated the phases of the cell cycle by flow cytometry. Compared to control cells, DHA induced H4K16ac in MCF-7 (p=0.04) and MDA-MB-231 (p=0.03). We observed that H3K9me3 was partially inhibited in MDA-MB-231 and SKBR-3 cells, after treatment with DHA, but did not reach a statistically significant value. We also found decreased levels of H3K27me3 after treatment with DHA in the three cell lines studied, but not statistically significant. DHA increased RASSF1A expression on MCF-7 (1.98 fold; p=0.03), but not in MDA-MB-231 and in SKBR-3 cells. There were no statistically significant changes in expression of genes DNMT1, DNMT3A and DNMT3B. These three breast cancer cells lines show methylation in specific region of RASSF1A promoter. DHA treatment increased RASSF1A promoter region hypomethylation in MCF-7 and SKBR-3. No significant difference was observed in the percentage of cell death nor cell distribution of MDA-MB-231, SKBR-3 and MCF-7 at different stages of the cell cycle after treatment with DHA. In conclusion, we suggest that DHA may act beneficially in epigenetic mechanisms and reactivation of tumor suppressor gene, RASSF1A as previously silenced by hypermethylation. It is hoped that these results can contribute to better understanding of the anticancer role of DHA in breast cancer

Alterações epigenéticas, como metilação do DNA e modificações pós traducionais em histonas, tem importante papel na carcinogênese mamária. A modulação de eventos epigenéticos constitui relevante alvo terapêutico, devido ao seu caráter reversível. Experimentalmente, o ácido docosahexaenoico (DHA), um membro da família dos ácidos graxos ômega-3, é capaz de diminuir proliferação, induzir morte celular e diminuir o potencial invasivo de células tumorais de mama. No entanto, os mecanismos antitumorais do DHA e sua capacidade de modular eventos epigenéticos ainda não estão totalmente elucidados. Nosso objetivo foi verificar, in vitro, a ação do DHA em eventos epigenéticos em diferentes linhagens de carcinoma mamário humano. Três linhagens celulares de câncer de mama (MDA-MB-231, SKBR-3 e MCF-7) foram tratadas durante 72 horas com 100 ?M de DHA ou etanol (controle). As modificações pós traducionais em histonas, acetilação no resíduo de lisina 9 da histona 3 (H3K9ac) e no resíduo 16 da histona 4 (H4K16ac), bem como trimetilação no resíduo de lisina 9 da histona 3 (H3K9me3) e no resíduo de lisina 27 da histona 3 (H3K27me3) foram avaliadas pela técnica de western blot. A análise da expressão do genes RASSF1A, DNMT1, DNMT3A e DNMT3B foi feita pela técnica da reação em cadeia da polimerase quantitativa via transcriptase reversa (RT-qPCR). A avaliação do padrão de metilação de região promotora do gene RASSF1A foi realizada pela técnica de reação em cadeia da polimerase metilação específica (MS-PCR). Foram também analisadas as fases do ciclo celular por citometria de fluxo. Comparado ao controle, o DHA induziu a acetilação no resíduo 16 da histona 4 (H4K16ac) nas linhagens MCF7 (p = 0,04) e MDA-MB-231 (p = 0,03). Observamos que a H3K9me3 foi parcialmente inibida nas linhagens MDA-MB-231 e SKBR-3, após o tratamento com DHA, mas sem alcançar valor estatisticamente significante. Encontramos também diminuição dos níveis de H3K27me3 após o tratamento com DHA nas três linhagens estudadas, porém não foi estatisticamente significativo. O DHA aumentou a expressão do gene RASSF1A na linhagem MCF-7 (1,98 vezes, p = 0,03), mas não nas linhagens MDA-MB-231 e SKBR-3. Não houve mudanças estatisticamente significativas na expressão dos genes DNMT1, DNMT3A e DNMT3B. As análises qualitativas da metilação demonstraram que a região promotora analisada do gene RASSF1A apresentou-se hipermetilada nas três linhagens celulares. Após o tratamento com DHA, houve tendência de desmetilação na região promotora do RASSF1A na linhagem MCF-7 e SKBR3, mas não na linhagem MDA-MB-231. Não houve diferença significativa na porcentagem de morte e distribuição das células MDA-MB-231, SKBR-3 e MCF-7 nas diferentes fases do ciclo celular após tratamento com DHA. Em conclusão, o DHA pode atuar em mecanismos epigenéticos e, ainda, reativar o gene supressor de tumor, como RASSF1A, anteriormente silenciado por hipermetilação, em células MCF-7. Espera-se que esses resultados contribuam para melhor compreensão do potencial papel anticâncer do DHA no câncer de mama / Epigenetic changes, such as DNA methylation and post-translational histone modifications, play an important role in mammary tumorigenesis. Epigenetic events are important as therapeutic targets, because of its reversible nature. Experimentally, docosahexaenoic acid (DHA), a member of the omega-3 fatty acids family, can reduce proliferation, induce apoptosis and decrease the invasive potential of breast tumor cells. However, the antitumor mechanism of DHA and its ability to modulate epigenetic events are not completely understood. Our objective was to verify, in vitro, the action of DHA in epigenetic events related to transcriptional reactivation of tumor suppressor gene, such as RASSF1A, in different human breast cancer cell lines. Three breast cancer cell lines (MCF-7, MDA-MB-231, SKBR-3) were treated with DHA (100 ?M) or vehicle (ethanol) for 72 hours. Western blot was used to analyze histone modification, as histone H3 lysine 9 (H3K9ac) and histone H4 lysine 16 (H4K16ac) acetylation, H3K9 trimethylation (H3K9me3) and H3K27 trimethylation (H3K27me3). Real time quantitative PCR (RT-qPCR) was performed for gene expression quantification of RASSF1A, DNMT1, DNMT3A and DNMT3B. DNA methylation of the promoter region of RASSF1A was evaluated by methylation specific PCR (MS-PCR). Moreover, we evaluated the phases of the cell cycle by flow cytometry. Compared to control cells, DHA induced H4K16ac in MCF-7 (p=0.04) and MDA-MB-231 (p=0.03). We observed that H3K9me3 was partially inhibited in MDA-MB-231 and SKBR-3 cells, after treatment with DHA, but did not reach a statistically significant value. We also found decreased levels of H3K27me3 after treatment with DHA in the three cell lines studied, but not statistically significant. DHA increased RASSF1A expression on MCF-7 (1.98 fold; p=0.03), but not in MDA-MB-231 and in SKBR-3 cells. There were no statistically significant changes in expression of genes DNMT1, DNMT3A and DNMT3B. These three breast cancer cells lines show methylation in specific region of RASSF1A promoter. DHA treatment increased RASSF1A promoter region hypomethylation in MCF-7 and SKBR-3. No significant difference was observed in the percentage of cell death nor cell distribution of MDA-MB-231, SKBR-3 and MCF-7 at different stages of the cell cycle after treatment with DHA. In conclusion, we suggest that DHA may act beneficially in epigenetic mechanisms and reactivation of tumor suppressor gene, RASSF1A as previously silenced by hypermethylation. It is hoped that these results can contribute to better understanding of the anticancer role of DHA in breast cancer