CARDOSO, Mirlane Guimarães de Melo. Efeito potencializador do antineoplásico paclitaxel (TAXOL) na hiperalgesia inflamatória experimental induzida por zymosan. 2003. 127 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2003. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-05-07T13:49:25Z No. of bitstreams: 1 2003_dis_mgmcardoso.pdf: 948719 bytes, checksum: 74fac9ee50502a1b6865c0976f5275ed (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-05-08T16:52:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2003_dis_mgmcardoso.pdf: 948719 bytes, checksum: 74fac9ee50502a1b6865c0976f5275ed (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-08T16:52:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2003_dis_mgmcardoso.pdf: 948719 bytes, checksum: 74fac9ee50502a1b6865c0976f5275ed (MD5) Previous issue date: 2003 / Paclitaxel (Taxol®) was the first effective antineoplastic in the management of refractory neoplasias to the conventional chemotherapy. It induces clinically to myelosuppression and sensory peripheral neuropathy boundary and cumulative dose, well documented at literature already. Less often the patients exhibited myalgias and arthralgias. As to concern to the inflammatory pain, there is nothing described do date, aiming to correlate the involvement from pro-inflammatory cytokines with the hyperalgesia genesis associated to PCX since the drug induces the alpha-TNF expression gene. It has already been demonstrated, experimentally by several authors, the essential role of alpha-TNF triggering a set of cytokines which active two components of the inflammatory pain (eicosanoid and sympathetic). Findings of our group showed that zymosan (ZY) administrated intraperitoneal (ip) in mice, induces the release of these cytokines by resident macrophages at the wriggling abdominal model (CA) and that their injection intra-articular rat knees produces a feature periarthritis as a sign of hyperalgesia at articular incapacitation model (IA). Based on these findings, the aim of the present work was to evaluate PCX effect at the modulation of nociceptive response induced by zymosan in two animal models of the inflammatory pain. Then, was injected via ip PCX (8mg/kg/an) before two hours of ZY (1mg/cav;ip) in mice on the CA test. Rats were treated with ip PCX (4,8 mg/kg/an) after one hour ZY intra-articular (250mcg/animal;i-art) for IA test. Both tests, the animals were pre-treated subcutaneous via with COX-1 and COX-2 inhibitors, sympathetic blockade and citokines inhibitors. It was demonstrated that PCX (8mg/kg/an) dose potentiates the inflammatory hyperalgesia at CA model, increasing in 183%, being statistical significant at the level p< 0.001, versus experimental group. Such effect was inhibited at level of significance, p< 0.001 and dependent-dose by indomethacin (ED50 0.05mg/kg), celoxib (ED5013.68mg/kg), atenolol(ED50 0.13mg/kg), talidomide (ED50 23.36mg/kg), penthoxyphylin (ED50 8.40mg/kg) and dexamethasone (ED50 0,71mg/kg). This potential effect of at the IA test was justified at IA model in dose 4mg/kg (p< 0,001) by significant increase of time of suspension the paws through arthritis at third and fourth hours versus experimental group. By same way there was significant inhibition at the level p< 0.001 of this magnification of the pre-treated rats. Latter, PCX (Taxol®) magnified significantly the inflammatory hyperalgesia induced by ZY at CA and IA models, justifying one sided myalgias and artralgias of the patients by using PCX, suggesting the involvement of the hyperalgesic citokines - alpha-TNF, prostanoids and sympathetic mediators of the genesis of this hyper-nociceptive effect. / Paclitaxel(Taxol®), foi o 1º antineoplásico efetivo no tratamento de cânceres refratários a quimioterapia convencional. Clinicamente, induz mielossupressão e neuropatia periférica sensorial dose-limitante e cumulativa, já bem documentada na literatura. Menos freqüentemente os pacientes tratados apresentam mialgias e artralgias. No que diz respeito à dor inflamatória, nada foi descrito até o momento, visando correlacionar o envolvimento das citocinas pró-inflamatórias, com a gênese da hiperalgesia associada ao PCX, já que a droga induz a expressão do gene TNF-alpha. Experimentalmente já foi demonstrado por vários autores, o papel fundamental do TNF-alpha desencadeando uma cascata de citocinas que ativam os dois componentes da dor inflamatória (eicosanóide e simpático). Dados do nosso laboratório registram que o zymosan (ZY) administrado ip em camundongos, induz a liberação dessas citocinas por macrófagos residentes no modelo de contorção abdominal (CA), e que sua injeção intra-articular em joelhos de ratos produz uma periartrite característica tida como sinal de hiperalgesia no modelo de incapacitação articular (IA). Com base nestes achados, constituiu-se objetivo do presente trabalho, avaliar o efeito do PCX na modulação da resposta nociceptiva induzida pelo ZY em dois modelos animais de dor inflamatória. Para tanto, injetou-se via ip PCX (8mg/kg/an) 2h antes do ZY (1mg/cav;ip) em camundongos no teste CA. Ratos foram tratados ip com PCX 4 e 8mg/kg/an) 1 h após da administração intra-articular ZY (250mcg/an) no teste IA. Em ambos os testes os animais foram pré-tratados via Sc com inibidores de COX-1 e COX-2, bloqueador simpático e inibidores de citocinas. Ficou demonstrado que PCX na dose de 8mg/kg potencializa a hiperalgesia inflamatória no modelo de CA, aumentando de maneira significativa (p< 0.001) o n° de CA em 183%, em relação ao controle. Tal efeito foi inibido de maneira significativa (p<0.001) e dose-dependente pela indometacina (ED50 0,05mg/kg), celecoxib (ED50 13,68mg/kg), atenolol (ED50 0,13mg/kg), talidomida (ED50 23,36mg/kg), pentoxifilina (ED50 8,40mg/kg) e dexametasona (ED50 0,71mg/kg). No teste de IA, esse efeito potencializador foi ratificado pelo aumento significativo do tempo de suspensão da pata (p< 0.001) na 3ª e 4ªh de artrite em relação ao controle, na dose 4mg/kg de PCX. Da mesma forma houve inibição significativa (p< 0.001) dessa amplificação nos ratos pré-tratados. Por fim, o PCX (Taxol®) amplifica significativamente a hiperalgesia inflamatória induzida pelo ZY no modelo de CA e IA, o que justifica em parte as mialgias e artralgias dos pacientes em uso de PCX e indiretamente sugere a participação de citocinas hiperalgésicas (TNF-alpha), prostanóides e mediadores simpáticos na gênese deste efeito hipernociceptivo.

FERREIRA, Paulo Michel Pinheiro. Determinação do potencial antitumoral de diterpenos isolados das folhas de casearia sylvestris swarts. 2007. 116 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2007. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-05-09T13:23:30Z No. of bitstreams: 1 2007_dis_pmpferreira.pdf: 1196579 bytes, checksum: a935fec4b14aad5c6d07e5025c6428b8 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-05-14T16:01:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_dis_pmpferreira.pdf: 1196579 bytes, checksum: a935fec4b14aad5c6d07e5025c6428b8 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-14T16:01:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_dis_pmpferreira.pdf: 1196579 bytes, checksum: a935fec4b14aad5c6d07e5025c6428b8 (MD5) Previous issue date: 2007 / Knowing the importance of mammalian cell culture in evaluating the cytotoxicity of new substances with therapeutic action, this work initially examined the cytotoxicity (by MTT assay) and hemolytic activity of 7 clerodane diterpenoids (acid hardiwickiico, casearins L, O and U and its degradation product, and casearins X and Y) isolated from leaves of Casearia sylvestris against a panel of 9 tumor cell lines and on mouse erythrocytes. All diterpenes studied showed no hemolytic effect, while casearin U (Cas U) was found to be the most active against tumor cells. Cytotoxic activity of Cas U seems to depend on the ring structure formed by carbons C-18 and C-19, since acid hydrolysis and ring opening led to a decrease or total loss of bioactivity. Subsequently, studies on the mechanism of action of Cas U (0.4, 0.8 and 1.6 µg/mL) revealed a concentration-dependent decrease in cell viability as determined by trypan blue dye exclusion and in DNA synthesis assayed by BrdU incorporation, where this antiproliferative mechanism of Cas U was not found to be dependent on an inhibitory action on topoisomerase I. Morphological analysis assessed by hematoxylin/eosin and ethidium bromide/acridine orange staining showed alterations in the pattern of cell death toward necrosis according to concentration, as seen by membrane disintegration and pyknotic nuclei (1.6 µg/mL). However, there also were cell volume reduction, and condensation and fragmentation of nuclear chromatin, consistent signs with apoptosis. DNA fragmentation was examined by flow cytometry and genotoxicity determined with the comet assay, and Cas U activity was found to be dependent on concentration but did not differ between normal (human peripheral lymphocytes) and malignant (HL-60) cells. Antitumor activity of Cas U was tested in mice transplanted with sarcoma 180 (10 and 25 mg/kg/day, intraperitoneally; 25 mg/kg/day, orally), and only the highest intraperitoneal dose was found to effective, leading to 90 % inhibition of tumor growth, with reversible changes in the kidneys. These findings point to the potential of Cas U as a model molecule to synthesize new compounds with anticancer properties. / Sabendo da importância de células de mamíferos em cultura para avaliar a citotoxicidade de novas substâncias com ação terapêutica, o presente trabalho determinou, inicialmente, a atividade citotóxica por MTT e hemolítica de 7 diterpenos clerodanos (ácido hardiwickiico, casearinas L, O, U e sua forma degradada, e casearinas X e Y) isolados a partir das folhas de Casearia sylvestris frente a um painel de 9 linhagens de células tumorais e a eritrócitos de camundongos. Na ausência de hemólise de todos os diterpenos, a Casearina U (Cas U) mostrou ser o mais ativo contra células tumorais. A atividade citotóxica da Cas U parece depender do anel formado pelos carbonos C-18 e C-19, uma vez que a hidrólise ácida e sua abertura levam à diminuição ou perda total da bioatividade. Posteriormente, os estudos de mecanismo de ação com a Cas U (0,4; 0,8 e 1,6 µg/mL) revelaram redução concentração-dependente na viabilidade celular por azul de tripan e na síntese de DNA por incorporação de BrdU, sendo o mecanismo antiproliferativo da Cas U independente de ação inibitória sobre a topoisomerase I. As análises morfológicas feitas por hematoxilina/eosina e por incorporação de brometo de etídio/laranja de acridina mostraram alteração no padrão de morte em favorecimento da necrose proporcional à concentração, como desintegração membranar e picnose nuclear (1,6 µg/mL), embora tenha ocorrido também retração celular, condensação e fragmentação da cromatina nucleares (0,4 e 0,8 µg/mL), sinais condizentes com apoptose. Nos ensaios de fragmentação do DNA por citometria de fluxo e de genotoxicidade por cometa, a atividade da Cas U foi concentração-dependente e sem diferenciação entre células normais (linfócitos periféricos humanos) e cancerosas (HL-60). A avaliação antitumoral (10 e 25 mg/kg/dia, intraperitoneal; 25 mg/kg/dia, oral) em camundongos transplantados com Sarcoma 180 revelou atividade apenas na maior dose via intraperitoneal, causando redução de 90 % do crescimento tumoral e alterações renais incipientes e reversíveis, enfatizando a potencialidade da Cas U como molécula modelo para a síntese de novos compostos com propriedades anti-câncer.

JUSTINO, Priscilla Fernanda Campos. Saccharomyces boulardii reverte a resposta inflamatória e funcional presente na mucosite intestinal induzida por 5-fluorouracil em camundongos. 2011. 89 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2011. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-05-09T14:06:08Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_pfcjustino.pdf: 2173455 bytes, checksum: 6190a3fb5bece18f1d9124dcc4fb94e1 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-05-14T16:01:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_pfcjustino.pdf: 2173455 bytes, checksum: 6190a3fb5bece18f1d9124dcc4fb94e1 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-14T16:01:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_pfcjustino.pdf: 2173455 bytes, checksum: 6190a3fb5bece18f1d9124dcc4fb94e1 (MD5) Previous issue date: 2011 / Intestinal mucositis is a frequent side-effect associated to 5-fluorouracil (5-FU) clinical use and results in inflammatory events. It is characterized by epithelial ulcerations in the mucosa and clinical manifestations of abdominal pain, nauseas and diarrhea. Saccharomyces boulardii is a probiotic yeast which has been shown to protect the gastrointestinal microflora from disequilibrium and from associated gastrointestinal disorders. Aim: To evaluate the effect of treatment with Saccharomyces boulardii in inflammatory response and alterations in the gastrintestinal motility in the course of intestinal mucositis experimental induced by 5-FU. Methods: Swiss male mice (25-30g) were treated with 5-FU (450mg/Kg, ip) or saline (control). Other groups received 3 or 6 days during SB (800mg/Kg, gavage) until the day of sacrifice, every day. A group pretreated received the SB for 3 days before and 3 days after administration of 5-FU (SB 6D) and another group received SB only 3 days after administration of 5-FU (SB 3D). At day 3 after 5-FU, the animals were sacrificed, samples of jejunum and ileum were collected to assess the injury epithelial morphometry, histological scores, the activity of MPO, nitrite levels and the concentration of GSH. For evaluation of cytokine samples of jejunum and ileum were removed and the ELISA was determined concentrations of IL-1β and CXCL1. In the technique of gastric emptying, the animals received the same treatment described above. Later, they were left to fast for 18 hours from d6 to d7. At d7, were administered 0.3 ml of glucose solution (5%) containing phenol red (VF) to 0.75 mg / ml in each animal. After 20 min, the animals were sacrificed and underwent a laparotomy. The small intestine was exposed and divided into 3 equal parts: proximal, medial and distal. With the aid of a beaker containing a solution of NaOH (100ml, 0.1 N) the volume of the stomach and small intestine segments were determined. The sample absorbance was read in a wavelength of 540 nm. Results: Treatment with 5-FU was able to induce intestinal injury with a significant impairment of epithelial barrier function in the presence of the following changes: severe shortening of the villus, crypts of partial necrosis, vacuolization of cells, infiltration and mono polymorphonuclear free radical production with consumption of GSH, increased levels of nitrite, increased concentration of IL-1β and CXCL1 and changes in gastrointestinal motility. Treatment with SB significantly reduced intestinal damage, with recovery of villous height, crypt depth recovery, decreased neutrophil infiltration and nitrite levels, increased levels of glutathione and reduced concentrations of IL-1β and CXCL1. However, treatment with SB was able to reverse the delayed gastric emptying and gastrointestinal transit. Conclusion: 5-FU induces intestinal mucositis in mice involving IL-1β and CXCL1, which is associated with delayed gastric emptying and gastrointestinal transit in. Treatment with SB, both 3D and 6D, were able to reverse the inflammatory changes, and revert the changes in gastrointestinal motility associated with mucositis by 5 - FU in mice. / A mucosite induzida por antineoplásicos é um fator limitante na terapia anticâncer. O trato gastrintestinal é vulnerável por causa da alta proliferação e frequência de renovação celular. Saccharomyces boulardii (SB) é uma levedura probiótica que é utilizado para proteger a microflora gastrintestinal do desequilíbrio e de distúrbios gastrintestinais associados. Objetivos: Avaliar o efeito do tratamento com SB na resposta inflamatória e nas alterações da motilidade digestiva no curso da mucosite intestinal experimental induzida por 5-FU. Métodos: Camundongos machos Swiss (25-30g) foram tratados com 5-FU (450mg/Kg, i.p.) ou com solução salina (controle). Outros grupos receberam durante 3 ou 6 dias SB (800mg/Kg, gavagem) até o dia do sacrifício, diariamente. Um grupo pré-tratado recebeu o SB por 3 dias antes e 3 dias depois da administração do 5-FU (SB 6D) e outro grupo recebeu SB somente 3 dias após a administração do 5-FU (SB 3D). No 3º dia após o 5-FU ou 5-FU+SB (3D ou 6D), os animais foram sacrificados, amostras de jejuno e íleo foram retiradas para avaliar a injúria epitelial por morfometria, escores histológicos, atividade de MPO, níveis de nitrito e concentração de GSH. Para avaliação de citocinas pelo método de ELISA foi determinada a concentração de IL-1β e CXCL1. Já na técnica de esvaziamento gástrico os animais receberam o mesmo tratamento descrito anteriormente. Posteriormente, foram deixados em jejum de 18 horas. No 7º dia foram administrados 0,3 ml da solução glicosada (5%) contendo vermelho de fenol (VF) a 0,75 mg/ml em cada animal. Após 20 min, os animais foram sacrificados e submetidos a uma laparotomia mediana. O intestino delgado foi exposto e divido em 3 partes iguais: proximal, medial e distal. Com o auxílio de uma proveta contendo uma solução de NaOH (100ml, 0,1N) o volume do estômago e dos segmentos do intestino delgado foram determinados. A absorbância da amostra foi lida à 540nm. Resultados: O tratamento com 5-FU foi capaz de induzir uma lesão intestinal com um importante comprometimento da barreira epitelial funcional com a presença das seguintes alterações: encurtamento acentuado das vilosidades intestinais, necrose parcial de criptas, vacuolização de células, presença de infiltrado de polimorfonucleares, produção de radicais livres com consumo de GSH, aumento dos níveis de nitrito, aumento na concentração de IL-1β e CXCL1 e alterações na motilidade digestiva. O tratamento com SB reduziu significativamente as lesões intestinais, com recuperação da altura dos vilos, recuperação da profundidade das criptas, diminuição do infiltrado neutrofílico e dos níveis de nitrito, aumento dos níveis de glutationa e redução da concentração de IL-1β e CXCL1. Contudo, o tratamento com SB foi capaz de reverter o retarde do esvaziamento gástrico e do transito gastrintestinal. Conclusão: 5-FU induz mucosite intestinal em camundongos com a participação de IL-1β e CXCL1, a qual se associa com retarde no esvaziamento gástrico e no transito gastrintestinal. O tratamento com SB foi capaz de reverter os achados inflamatórios e as alterações na motilidade digestiva associadas à mucosite por 5- FU em camundongos.

O 5-fluorouracil (5-FU) é um antineoplásico análogo pirimídico empregado no tratamento de muitos tipos de cânceres. Três diferentes mecanismos de citotoxicidade são atribuídos a este agente: incorporação de fluoronucleotídeos no DNA ou RNA e a inibição da enzima timidilato sintase. O 5-FU pode ser convertido ao seu metabólito ativo, o 5-fluoro-2´-deoxiuridina-5´-monofosfato (FdUMP), que por sua vez, pode inibir a enzima timidilato sintase (TS), responsável pela síntese de timidina monofosfato a partir de uridina monofosfato; a inibição de TS leva ao desbalanço do pool de nucleotídeos, diminuindo a concentração de dTTP, aumentando a de dUTP e, como conseqüência, levando à incorporação de uracil na cadeia de DNA. No presente estudo comparamos a atividade citotóxica de 5-FU e de seu metabólito FdUMP e as vias de reparação de DNA envolvidas na eliminação das lesões induzidas por estas substâncias. A atividade citotóxica foi avaliada em células de adenocarcinoma de cólon humano, linhagem SW620. As vias de reparação foram estudadas em linhagens de Saccharomyces cerevisiae deficientes em genes de reparo para excisão de bases (BER), excisão de nucleotídeos (NER), recombinação homóloga (HR), recombinação não-homóloga (NHEJ) e síntese translesão (TLS). Para se investigar a possível sobreposição das vias de reparo, foram empregados quádruplos mutantes em BER e NER, HR ou TLS. Os resultados em células tumorais humanas mostraram que tanto 5-FU, quanto FdUMP desencadeiam morte celular por apoptose. Ao avaliar a progressão do ciclo celular, observou-se que 5-FU leva a parada em G1, enquanto que FdUMP, parada em G2. Com a finalidade de se investigar se estas paradas de ciclo celular estariam relacionadas a quebras de DNA, foram empregados ensaios de fosforilação da histona H2AX e os testes de cometa alcalino e de micronúcleos. Observou-se que ambas as drogas induzem fragmentação no DNA, uma vez que foram observadas quebras de fita simples e formação de micronúcleos. Logo, a diferença na progressão do ciclo celular não está relacionada com a habilidade das drogas em induzir quebras. Desta forma, sugere-se que o efeito diferencial de 5-FU e FdUMP na progressão do ciclo celular depende do tipo de lesão induzida pelas drogas e as vias de reparação de DNA implicadas no reconhecimento das mesmas. Ao empregar linhagens de S. cerevisiae proficientes e deficientes em reparo tratadas com 5-FU e FdUMP, observou-se que a proteína Apn1 é de extrema importância no reparo das mesmas, uma vez que apn1Δ foi o mais sensível de todos mutantes e ntg1Δntg2Δapn1Δ apresentou grande sensibilidade aos tratamentos com ambas as drogas. As lesões causadas por 5-FU seriam reconhecidas principalmente pela Ntg2, o que resulta em significativa sensibilidade em ntg2Δ e ntg1Δntg2Δ. Entretanto, para o reconhecimento dos danos por FdUMP são necessárias a participação tanto de Ntg1 quanto Ntg2, como visto na elevada sensibilidade do duplo mutante ntg1Δntg2Δ. As deficiências em Ung1 e Rad27 não revelaram diferenças significativas em relação às linhagens selvagens, bem como nos mutantes em NER (rad1Δ e rad10Δ), HR (rad52Δ), NHEJ (rad50Δ) e TLS (rev1Δ e rev3Δ), para ambas as drogas. No emprego de quádruplos mutantes, verificou-se que ntg1Δntg2Δapn1Δrad52Δ mostrou uma acentuada sensibilidade quando tratado com 5-FU. Estes resultados sugerem que os danos gerados por 5-FU poderiam ser reconhecidos e removidos pela DNA glicosilase Ntg2 e AP endonucleases Apn1 do BER, levando a quebras de fita simples e dupla de DNA, que seriam reparadas por HR (Tipo RAD52). Entretanto, para o tratamento com FdUMP não foram observadas diferenças significativas quando comparado com a linhagem selvagem. Ao analisar a sensibilidade dos mutantes ntg1Δntg2Δapn1Δrad1Δ e ntg1Δntg2Δapn1Δrev3Δ, verificou-se que os mesmos não foram sensíveis ao tratamento com FdUMP, entretanto apresentaram moderada sensibilidade quando tratados com 5-FU. O conjunto desses resultados nos leva a sugerir que uma pequena parte dos sítios AP produzidos pelo tratamento com 5-FU poderia ser processada por NER e TLS, sendo a participação de HR a mais importante. As lesões geradas por FdUMP seriam reparadas principalmente por BER, com a participação de Ntg1, Ntg2 e Apn1, porém não pode ser descartado o possível envolvimento da reparação de bases mal-emparelhadas - MMR, uma vez que se observou previamente, uma parada no ciclo celular em G2 em células de adenocarcinoma de cólon humano SW620. / 5-fluorouracil (5-FU) is an antineoplastic drug pyrimidic analogue employed in the treatment of several cancers. Three different mechanisms of cytotoxicity are attributed to this agent: misincorporation of fluoronucleotides in DNA or RNA and inhibition of thymidilate sintase enzime. 5-FU could be converted to its active metabolite, 5-fluoro-2´-deoxiuridina-5´-monofosfato (FdUMP), that could inhibit the thymidilate sintase (TS), related to thymidine synthesis from uridine; TS inhibition leads to nucleotide pool imbalance, decreasing thymine concentration and increasing uracil, as consequence, it leads to uracil incorporation into DNA. The present study compared the cytotoxic activity of 5-FU and its active metabolite FdUMP, and the DNA repair pathways involved in removing lesions induced by these substances. Cytotoxicity was evaluated in human colon adenocarcinoma cells, SW620. DNA repair pathwayas were studied in Saccharomyces cerevisiae deficient in base excision repair (BER), nucleotide excision repair (NER), homologous recombination (HR), non-homologous end joining (NHEJ) and translesion synthesis (TLS). To investigate the overlapping of DNA repair pathways, we employed quadruple mutants in BER and NER, HR or TLS. Results in human tumor cells showed that both 5-FU and FdUMP induce cell death by apoptosis. When we investigated the cell cycle progression, we observed that 5-FU lead G1 arrest, while FdUMP induced G2 arrest. In order to investigate if these arrests would be related to DNA breaks, alkaline comet assay, fosforilation of H2AX histone and micronucleus assay were employed. We observed that both drugs induce DNA fragmentation, since single strand breaks and micronucleus were evidenced. Thus, the difference in cell cycle progression is not related to the ability of 5-FU and FdUMP in induce breaks. This way, we suggest that the differential effect of 5-FU and FdUMP in cell cycle progression depends on the type of lesion originated by drugs and the DNA repair pathways implicated in recognize them. By employing S. cerevisiae strains proficient and deficient in DNA repair treated with 5-FU and FdUMP, it was observed that Apn1 protein is extremely important in repairing these lesions, since apn1Δ was the most sensitive of all mutants employed and ntg1Δntg2Δapn1Δ showed high sensitivity to treatments with both drugs. Lesions caused by 5-FU would be recognized mainly by Ntg2, what results in significant sensitivity in ntg2Δ and ntg1Δntg2Δ. However, for recognition of FdUMP damage it is necessary the participation of both Ntg1 and Ntg2, as observed in high sensitivity of ntg1Δntg2Δ double mutant. Deficiencies in Ung1 and Rad27 did not reveal significant differences in relation to WT, as well as mutants in NER (rad1Δ e rad10Δ), HR (rad52Δ), NHEJ (rad50Δ) e TLS (rev1Δ e rev3Δ), for both drugs. When we employed quadruple mutants, we verified that ntg1Δntg2Δapn1Δrad52Δ showed higher sensitivity when treated with 5-FU. These data suggest that damage generated by 5-FU could be recognized and removed by DNA glycosylases Ntg2 and AP endonuclease Apn1 from BER, generating DNA single and double strand breaks, that could be repaired by HR (RAD52 Type). However, for FdUMP, we did not observe significant differences in comparison to WT. By investigating the sensitivity of ntg1Δntg2Δapn1Δrad1Δ and ntg1Δntg2Δapn1Δrev3Δ, we observed that they were not sensitized by FdUMP, however, they present a slight sensitivity when treated with 5-FU. These results lead us to suggest that a small part of AP sites generated by 5-FU could be processed by NER and TLS, and HR would be the most significant. Lesions by FdUMP would be repaired mainly by BER, with participation of Ntg1, Ntg2 and Apn1, however, we can not discharge the possible involvement of mismatch repair pathway - MMR, since we previous observed G2 arrest in SW620 human colon adenocarcinoma cells.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Química, 2016. / Submitted by Marianna Gomes (mariannasouza@bce.unb.br) on 2016-12-07T17:32:36Z No. of bitstreams: 1 2016_IdioAlvesdeSousaFilho.pdf: 2464547 bytes, checksum: 5eac925799f0df893b51f5538b96b903 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-04T18:06:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_IdioAlvesdeSousaFilho.pdf: 2464547 bytes, checksum: 5eac925799f0df893b51f5538b96b903 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-04T18:06:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_IdioAlvesdeSousaFilho.pdf: 2464547 bytes, checksum: 5eac925799f0df893b51f5538b96b903 (MD5) / O etoposídeo é um antineoplásico utilizado para tratamento de câncer de pulmão, de testículos, de mama, cânceres pediátricos e linfomas. É um medicamento que merece atenção especial devido ao seu potencial mutagênico e carcinogênico, não tendo um tratamento adequado para o descarte de frascos contaminados. Os tratamentos convencionais usados pelas ETEs não podem removê-lo completamente, sendo descartado no meio ambiente, na maior parte dos casos, ainda como composto ativo, sendo necessária a busca por processos mais eficientes para eliminá-lo. Os POAs aparecem como um processo alternativo mais eficiente que os tradicionais para a remoção de compostos orgânicos resistentes. O estanato de estrôncio (SrSnO3) é um material cerâmico que apresenta estrutura compatível com uma perovsquita distorcida, com propriedades interessantes e, tem sido estudado em função da sua variada aplicação, inclusive como fotocatalisador. Neste trabalho, o SrSnO3 foi sintetizado pelo método de combustão e estado sólido, sendo posteriormente nitretado por reação de amonólise gasosa para promover a atividade fotocatalítica na região do visível. O material obtido foi caracterizado pelas técnicas de DRX, Infravermelho, Raman e MEV. O material sintetizado possui área superficial de 3,28 m2 g-1 e 9,07 m2 g-1, band gap foi de 4,06 eV e 4,05 eV para o pó sintetizado por reação de combustão e estado sólido, respectivamente. Foram otimizadas as condições experimentais dos processos de degradação fotocatalítica da solução de etoposídeo (0,4 mol L-1), pH 5 e concentração do catalisador 1 g L-1. Os resultados mostraram que as reações de degradação utilizando o SrSnO3 combinado com H2O2 geraram uma mineralização da solução de etoposídeo da ordem de 97,98 % (± 4,03x10-3), obtendo-se quase a sua completa degradação da solução. Foram realizados ensaios com o TiO2 nas mesmas condições utilizadas para a remoção do etoposídeo na solução, porém obteve-se uma menor porcentagem de degradação que com o SrSnO3. Os testes realizados com o SrSnO3:N se mostraram ineficientes para tais condições estudadas, degradando apenas 2,90 % (±7,6x10-2). Além disso, os ensaios de toxicidade indicaram que a degradação da solução de etoposídeo na condição ótima, não torna a solução tóxica para a espécie Danio rerio se comparada à solução inicial. Os testes cometa e micronúcleo mostraram que, após os ensaios de degradação, há a remoção do potencial mutagênico e de seus efeitos genotóxicos. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Etoposide is an antineoplastic used for treating lung cancer, testicular, breast, pediatric cancers and lymphomas. It is a medicament deserves special attention because of their mutagenic and carcinogenic potential. Conventional treatments used by STPs can not remove it completely, being disposed in the environment, in the most cases, still as active compound being necessary to search for more efficient methods to eliminate it. The AOPs appears as a more efficient alternative to the traditional process for removing organic resistant compounds. The strontium stannate (SrSnO3) is a ceramic material having a structure compatible with a distorted perovskite with interesting properties and it has been studied because of its varied application, including as a photocatalyst. In this work, the SrSnO3 was synthesized by the solid state and combustion method, and was subsequently nitrided by gas ammonolysis reaction to promote the photocatalytic activity in the visible region. The obtained powder was characterized by XRD, infrared, Raman and SEM techniques, the synthesized material has showed surface area of 3.28 m2 g-1 and 9.07 m2 g-1 and band gap was 4.06 eV and 4.05 eV for combustion and solid respectively. The experimental conditions were optimized for photocatalytic degradation processes of etoposide solution (0.4 mol L-1): pH 5 and catalyst concentration 1 g L-1. The results showed that the degradation reactions using SrSnO3 combined with H2O2 generated a mineralization of etoposide solution of 97.98% (± 4.03 x 10-3) to give its nearly complete removal from the solution. Assays were conducted in TiO2 under the same conditions used for the removal of etoposide in solution, however it was obtained a lower degradation percentage than with the SrSnO3. Tests conducted with SrSnO3:N had proved inefficient for such conditions studied, degrading only 2.90% (± 7.6x!0-2). Moreover, the toxicity tests showed that the degradation of the etoposide solution in optimum condition does not make the solution toxic to the Danio rerio species comparing to the initial solution. The comet and micronucleus assays showed that, after the degradation tests there is the removal of mutagenic potential and its genotoxic effects.

O 5-Fluorouracil (5-FU) é um agente antitumoral amplamente empregado no tratamento de diversos tipos de cânceres. Embora haja muitos trabalhos publicados com este antineoplásico, estudos sobre seus mecanismos de ação ainda tornam-se necessários a fim de se obter protocolos clínicos mais eficazes. Desta forma, novos aspectos sobre seu mecanismo de citotoxicidade foram investigados neste trabalho. Na primeira parte foram avaliadas as vias de reparação de DNA que participam em resposta a danos induzidos pelo 5-FU e seus efeitos comparados com o seu metabólito ativo FdUMP em Saccharomyces cerevisiae. Os resultados apontam que as lesões induzidas pelo 5-FU podem ser processadas pela vias de reparo por excisão de bases (BER), reparação de bases mal-emparelhadas (MMR), reparo pós-replicativo (PRR) e recombinação homóloga (HR), enquanto que os danos induzidos pelo FdUMP seriam reconhecidos e removidos apenas pelas vias BER e MMR. Estas diferenças no recrutamento das vias de reparo relacionam-se aos diferentes tipos de lesões que são geradas pelos antimetabólitos: o 5-FU induz quebras de fita simples (SSBs) e duplas (DSBs), enquanto que o FdUMP forma principalmente SSBs. Na segunda parte foi investigada a participação de modeladores da cromatina na citotoxicidade do 5-FU em S. cerevisiae. Os resultados em conjunto sugerem que os remodeladores da cromatina dependentes de ATP e algumas acetiltransferases de histona podem influenciar na citotoxicidade do agente 5-FU, possivelmente atuando no relaxamento da cromatina, e assim facilitando os processos de reparação de DNA por HR e PRR. Na terceira parte foi avaliada a resposta ao dano no DNA por ATR/Chk1 e ATM/Chk2 em células tumorais humanas. Os resultados mostraram que o 5-FU ativa principalmente a via ATR/Chk1. Ao se investigar os efeitos do 5-FU em combinação com o AZD7762, um inibidor de Chk1/2, observou-se aumento de sensibilidade ao agente antitumoral, diretamente relacionado ao aumento de células em sub-G1, diminuição em G2/M e indução de mitose prematura. Os resultados em conjunto obtidos neste trabalho nos permitem uma melhor compreensão destes mecanismos de ação do 5-FU, e fornece subsídios para melhora de protocolos terapêuticos. / 5-Fluorouracil (5-FU) is an antitumor drug employed in the treatment of several cancer types. Despite many studies have been conduced with this antineoplasic drug, investigations concerning on its action mechanism become necessary in order to obtain more efficient clinical protocols. Therefore, new aspects about its cytotoxicity mechanism were investigated in this work. First, DNA repair pathways involved in the repair of 5-FU-induced lesions were evaluated and compared to the effects of its active metabolite FdUMP in Saccharomyces cerevisiae. Our data showed that lesions induced by 5-FU may be processed by base excision repair (BER), mismatch repair (MMR), post-replication repair (PRR) and homologous recombination (HR), while FdUMP lesions are recognized and removed only by BER and MMR. These differences in repair pathways recruitment are related to the different lesion types induced by the antimetabolites: 5-FU induces single- and double stranded breaks (SSBs and DSBs), while FdUMP induces mainly SSBs. In the second part we investigated the participation of chromatin remodeling in the 5- FU cytotoxicity in S. cerevisiae. Together, our data suggest that ATP-dependent chromatin remodeling and some histone acetyltransferases may influence 5-FU cytotoxicity, probably acting in chromatin relaxation and facilitating DNA repair process by HR and PRR. In the third part, the DNA damage response by ATR/Chk1 and ATM/Chk2 were evaluated in human tumor cells. The data showed that 5-FU activates mainly ATR/Chk1 pathway. When we investigate the effects of 5-FU in combination with AZD7762, the Chk1/2 inhibitor, we observed increased sensitivity to this antitumor agent, directly related to enhanced number of sub-G1 cells, decrease in the G2/M cells, and premature mitose induction. Our data permit a better comprehension of 5-FU action mechanisms and provide clues to improve the current therapeutics protocols.

O 5-Fluorouracil (5-FU) é um agente antitumoral amplamente empregado no tratamento de diversos tipos de cânceres. Embora haja muitos trabalhos publicados com este antineoplásico, estudos sobre seus mecanismos de ação ainda tornam-se necessários a fim de se obter protocolos clínicos mais eficazes. Desta forma, novos aspectos sobre seu mecanismo de citotoxicidade foram investigados neste trabalho. Na primeira parte foram avaliadas as vias de reparação de DNA que participam em resposta a danos induzidos pelo 5-FU e seus efeitos comparados com o seu metabólito ativo FdUMP em Saccharomyces cerevisiae. Os resultados apontam que as lesões induzidas pelo 5-FU podem ser processadas pela vias de reparo por excisão de bases (BER), reparação de bases mal-emparelhadas (MMR), reparo pós-replicativo (PRR) e recombinação homóloga (HR), enquanto que os danos induzidos pelo FdUMP seriam reconhecidos e removidos apenas pelas vias BER e MMR. Estas diferenças no recrutamento das vias de reparo relacionam-se aos diferentes tipos de lesões que são geradas pelos antimetabólitos: o 5-FU induz quebras de fita simples (SSBs) e duplas (DSBs), enquanto que o FdUMP forma principalmente SSBs. Na segunda parte foi investigada a participação de modeladores da cromatina na citotoxicidade do 5-FU em S. cerevisiae. Os resultados em conjunto sugerem que os remodeladores da cromatina dependentes de ATP e algumas acetiltransferases de histona podem influenciar na citotoxicidade do agente 5-FU, possivelmente atuando no relaxamento da cromatina, e assim facilitando os processos de reparação de DNA por HR e PRR. Na terceira parte foi avaliada a resposta ao dano no DNA por ATR/Chk1 e ATM/Chk2 em células tumorais humanas. Os resultados mostraram que o 5-FU ativa principalmente a via ATR/Chk1. Ao se investigar os efeitos do 5-FU em combinação com o AZD7762, um inibidor de Chk1/2, observou-se aumento de sensibilidade ao agente antitumoral, diretamente relacionado ao aumento de células em sub-G1, diminuição em G2/M e indução de mitose prematura. Os resultados em conjunto obtidos neste trabalho nos permitem uma melhor compreensão destes mecanismos de ação do 5-FU, e fornece subsídios para melhora de protocolos terapêuticos. / 5-Fluorouracil (5-FU) is an antitumor drug employed in the treatment of several cancer types. Despite many studies have been conduced with this antineoplasic drug, investigations concerning on its action mechanism become necessary in order to obtain more efficient clinical protocols. Therefore, new aspects about its cytotoxicity mechanism were investigated in this work. First, DNA repair pathways involved in the repair of 5-FU-induced lesions were evaluated and compared to the effects of its active metabolite FdUMP in Saccharomyces cerevisiae. Our data showed that lesions induced by 5-FU may be processed by base excision repair (BER), mismatch repair (MMR), post-replication repair (PRR) and homologous recombination (HR), while FdUMP lesions are recognized and removed only by BER and MMR. These differences in repair pathways recruitment are related to the different lesion types induced by the antimetabolites: 5-FU induces single- and double stranded breaks (SSBs and DSBs), while FdUMP induces mainly SSBs. In the second part we investigated the participation of chromatin remodeling in the 5- FU cytotoxicity in S. cerevisiae. Together, our data suggest that ATP-dependent chromatin remodeling and some histone acetyltransferases may influence 5-FU cytotoxicity, probably acting in chromatin relaxation and facilitating DNA repair process by HR and PRR. In the third part, the DNA damage response by ATR/Chk1 and ATM/Chk2 were evaluated in human tumor cells. The data showed that 5-FU activates mainly ATR/Chk1 pathway. When we investigate the effects of 5-FU in combination with AZD7762, the Chk1/2 inhibitor, we observed increased sensitivity to this antitumor agent, directly related to enhanced number of sub-G1 cells, decrease in the G2/M cells, and premature mitose induction. Our data permit a better comprehension of 5-FU action mechanisms and provide clues to improve the current therapeutics protocols.

O 5-fluorouracil (5-FU) é um antineoplásico análogo pirimídico empregado no tratamento de muitos tipos de cânceres. Três diferentes mecanismos de citotoxicidade são atribuídos a este agente: incorporação de fluoronucleotídeos no DNA ou RNA e a inibição da enzima timidilato sintase. O 5-FU pode ser convertido ao seu metabólito ativo, o 5-fluoro-2´-deoxiuridina-5´-monofosfato (FdUMP), que por sua vez, pode inibir a enzima timidilato sintase (TS), responsável pela síntese de timidina monofosfato a partir de uridina monofosfato; a inibição de TS leva ao desbalanço do pool de nucleotídeos, diminuindo a concentração de dTTP, aumentando a de dUTP e, como conseqüência, levando à incorporação de uracil na cadeia de DNA. No presente estudo comparamos a atividade citotóxica de 5-FU e de seu metabólito FdUMP e as vias de reparação de DNA envolvidas na eliminação das lesões induzidas por estas substâncias. A atividade citotóxica foi avaliada em células de adenocarcinoma de cólon humano, linhagem SW620. As vias de reparação foram estudadas em linhagens de Saccharomyces cerevisiae deficientes em genes de reparo para excisão de bases (BER), excisão de nucleotídeos (NER), recombinação homóloga (HR), recombinação não-homóloga (NHEJ) e síntese translesão (TLS). Para se investigar a possível sobreposição das vias de reparo, foram empregados quádruplos mutantes em BER e NER, HR ou TLS. Os resultados em células tumorais humanas mostraram que tanto 5-FU, quanto FdUMP desencadeiam morte celular por apoptose. Ao avaliar a progressão do ciclo celular, observou-se que 5-FU leva a parada em G1, enquanto que FdUMP, parada em G2. Com a finalidade de se investigar se estas paradas de ciclo celular estariam relacionadas a quebras de DNA, foram empregados ensaios de fosforilação da histona H2AX e os testes de cometa alcalino e de micronúcleos. Observou-se que ambas as drogas induzem fragmentação no DNA, uma vez que foram observadas quebras de fita simples e formação de micronúcleos. Logo, a diferença na progressão do ciclo celular não está relacionada com a habilidade das drogas em induzir quebras. Desta forma, sugere-se que o efeito diferencial de 5-FU e FdUMP na progressão do ciclo celular depende do tipo de lesão induzida pelas drogas e as vias de reparação de DNA implicadas no reconhecimento das mesmas. Ao empregar linhagens de S. cerevisiae proficientes e deficientes em reparo tratadas com 5-FU e FdUMP, observou-se que a proteína Apn1 é de extrema importância no reparo das mesmas, uma vez que apn1Δ foi o mais sensível de todos mutantes e ntg1Δntg2Δapn1Δ apresentou grande sensibilidade aos tratamentos com ambas as drogas. As lesões causadas por 5-FU seriam reconhecidas principalmente pela Ntg2, o que resulta em significativa sensibilidade em ntg2Δ e ntg1Δntg2Δ. Entretanto, para o reconhecimento dos danos por FdUMP são necessárias a participação tanto de Ntg1 quanto Ntg2, como visto na elevada sensibilidade do duplo mutante ntg1Δntg2Δ. As deficiências em Ung1 e Rad27 não revelaram diferenças significativas em relação às linhagens selvagens, bem como nos mutantes em NER (rad1Δ e rad10Δ), HR (rad52Δ), NHEJ (rad50Δ) e TLS (rev1Δ e rev3Δ), para ambas as drogas. No emprego de quádruplos mutantes, verificou-se que ntg1Δntg2Δapn1Δrad52Δ mostrou uma acentuada sensibilidade quando tratado com 5-FU. Estes resultados sugerem que os danos gerados por 5-FU poderiam ser reconhecidos e removidos pela DNA glicosilase Ntg2 e AP endonucleases Apn1 do BER, levando a quebras de fita simples e dupla de DNA, que seriam reparadas por HR (Tipo RAD52). Entretanto, para o tratamento com FdUMP não foram observadas diferenças significativas quando comparado com a linhagem selvagem. Ao analisar a sensibilidade dos mutantes ntg1Δntg2Δapn1Δrad1Δ e ntg1Δntg2Δapn1Δrev3Δ, verificou-se que os mesmos não foram sensíveis ao tratamento com FdUMP, entretanto apresentaram moderada sensibilidade quando tratados com 5-FU. O conjunto desses resultados nos leva a sugerir que uma pequena parte dos sítios AP produzidos pelo tratamento com 5-FU poderia ser processada por NER e TLS, sendo a participação de HR a mais importante. As lesões geradas por FdUMP seriam reparadas principalmente por BER, com a participação de Ntg1, Ntg2 e Apn1, porém não pode ser descartado o possível envolvimento da reparação de bases mal-emparelhadas - MMR, uma vez que se observou previamente, uma parada no ciclo celular em G2 em células de adenocarcinoma de cólon humano SW620. / 5-fluorouracil (5-FU) is an antineoplastic drug pyrimidic analogue employed in the treatment of several cancers. Three different mechanisms of cytotoxicity are attributed to this agent: misincorporation of fluoronucleotides in DNA or RNA and inhibition of thymidilate sintase enzime. 5-FU could be converted to its active metabolite, 5-fluoro-2´-deoxiuridina-5´-monofosfato (FdUMP), that could inhibit the thymidilate sintase (TS), related to thymidine synthesis from uridine; TS inhibition leads to nucleotide pool imbalance, decreasing thymine concentration and increasing uracil, as consequence, it leads to uracil incorporation into DNA. The present study compared the cytotoxic activity of 5-FU and its active metabolite FdUMP, and the DNA repair pathways involved in removing lesions induced by these substances. Cytotoxicity was evaluated in human colon adenocarcinoma cells, SW620. DNA repair pathwayas were studied in Saccharomyces cerevisiae deficient in base excision repair (BER), nucleotide excision repair (NER), homologous recombination (HR), non-homologous end joining (NHEJ) and translesion synthesis (TLS). To investigate the overlapping of DNA repair pathways, we employed quadruple mutants in BER and NER, HR or TLS. Results in human tumor cells showed that both 5-FU and FdUMP induce cell death by apoptosis. When we investigated the cell cycle progression, we observed that 5-FU lead G1 arrest, while FdUMP induced G2 arrest. In order to investigate if these arrests would be related to DNA breaks, alkaline comet assay, fosforilation of H2AX histone and micronucleus assay were employed. We observed that both drugs induce DNA fragmentation, since single strand breaks and micronucleus were evidenced. Thus, the difference in cell cycle progression is not related to the ability of 5-FU and FdUMP in induce breaks. This way, we suggest that the differential effect of 5-FU and FdUMP in cell cycle progression depends on the type of lesion originated by drugs and the DNA repair pathways implicated in recognize them. By employing S. cerevisiae strains proficient and deficient in DNA repair treated with 5-FU and FdUMP, it was observed that Apn1 protein is extremely important in repairing these lesions, since apn1Δ was the most sensitive of all mutants employed and ntg1Δntg2Δapn1Δ showed high sensitivity to treatments with both drugs. Lesions caused by 5-FU would be recognized mainly by Ntg2, what results in significant sensitivity in ntg2Δ and ntg1Δntg2Δ. However, for recognition of FdUMP damage it is necessary the participation of both Ntg1 and Ntg2, as observed in high sensitivity of ntg1Δntg2Δ double mutant. Deficiencies in Ung1 and Rad27 did not reveal significant differences in relation to WT, as well as mutants in NER (rad1Δ e rad10Δ), HR (rad52Δ), NHEJ (rad50Δ) e TLS (rev1Δ e rev3Δ), for both drugs. When we employed quadruple mutants, we verified that ntg1Δntg2Δapn1Δrad52Δ showed higher sensitivity when treated with 5-FU. These data suggest that damage generated by 5-FU could be recognized and removed by DNA glycosylases Ntg2 and AP endonuclease Apn1 from BER, generating DNA single and double strand breaks, that could be repaired by HR (RAD52 Type). However, for FdUMP, we did not observe significant differences in comparison to WT. By investigating the sensitivity of ntg1Δntg2Δapn1Δrad1Δ and ntg1Δntg2Δapn1Δrev3Δ, we observed that they were not sensitized by FdUMP, however, they present a slight sensitivity when treated with 5-FU. These results lead us to suggest that a small part of AP sites generated by 5-FU could be processed by NER and TLS, and HR would be the most significant. Lesions by FdUMP would be repaired mainly by BER, with participation of Ntg1, Ntg2 and Apn1, however, we can not discharge the possible involvement of mismatch repair pathway - MMR, since we previous observed G2 arrest in SW620 human colon adenocarcinoma cells.

Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-08-07T19:47:17Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Ana Lygia dos Santos.pdf: 2337591 bytes, checksum: b38012def1bbf5adf52bdbd4060eed5b (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-08-15T21:25:08Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Ana Lygia dos Santos.pdf: 2337591 bytes, checksum: b38012def1bbf5adf52bdbd4060eed5b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-15T21:25:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Ana Lygia dos Santos.pdf: 2337591 bytes, checksum: b38012def1bbf5adf52bdbd4060eed5b (MD5) Previous issue date: 2013-02-27 / FACEPE / A solasodina, alcalóide esteroidal obtido principalmente de plantas do gênero Solanum, pertencente à família Solanaceae, que apresenta duas formas glicosiladas: solamargina e solasonina. A potente ação antitumoral da solasodina frente tumores malignos e benignos de pele, é decorrente da presença de uma mistura de glicosídeos presentes na molécula e já vem sendo comercializado como Curadem®. A porção glicosídica, portanto, viabiliza o reconhecimento de receptores de membrana induzindo sua internalização e viabilizando sua ação biológica. As limitações de rendimento na extração dos glicosídeos da solasodina permite a extração da aglicona em maior rendimento. Assim sendo, este trabalho visa o desenvolvimento de um nanosistema mais efetivo na entrega da solasodina e avaliação da ação antiproliferativa frente a diferentes linhagens celulares. Nanocápsulas furtivas contendo solasodina (SSD-NC) foram obtidas pelo método de precipitação de um polímero pré-formado e caracterizadas através da avaliação da morfologia por microscopia eletrônica de varredura, determinação do pH, tamanho médio, índice de polidispersão e carga de superfície de partículas. A atividade antiproliferativa da solasodina nanoencapsulada foi avaliada frente às linhagens celulares NIH 3T3 (fibroblastos normais), 4T1 (câncer de glândula mamária de murino) e MCF- 7 (câncer de tumor de mama). A citotoxidade das SSD-NCS foi determinada pelo método MTT após tratamento de 48 horas, utilizando concentrações de 100 a 0,78 μg/mL de SSD-NC. O mecanismo de morte celular avaliado através da marcação com anexina V e iodeto de propídio, a determinação do potencial de membrana mitocondrial e a fragmentação de DNA das células tratadas com SSD-NC (3,125 e 6,25 μg/mL) foram realizados por citometria de fluxo. As células 4T1 e MCF-7 apresentaram uma redução significativa dose e tempo-dependente na viabilidade, enquanto que as células NIH 3T3 apresentaram citoxidade reduzida até concentrações ≥ 25 μg/mL. Os valores de IC50 de SSD-NC nas linhagens 4T1 e MCF-7 foram de 5,31 e 4,14 μg/mL, respectivamente. Aumento na fragmentação do DNA das células 4T1 e na MCF-7 foi observado em função do aumento da concentração de SSD-NC. As células foram marcadas apenas pelo iodeto de propídio, demonstrando perda da permeabilidade da membrana celular, sugerindo necrose como mecanismo de morte celular. A análise do potencial de membrana mitocondrial revelou que o tratamento com SSD-NC induziu alterações na membrana dessas organelas, confirmando os resultados obtidos através do método MTT, onde as células apresentaram alteração em sua viabilidade. Estes achados sugerem que o tratamento das células 4T1 e MCF-7 com SSD-NC induz o processo de necrose associado a severas alterações morfológicas nas células. A encapsulação da solasodina apresentou um potencial efeito antiproliferativo, viabilizando futuros estudo in vivo da ação antitumoral. / Solasodine, a steroidal alkaloid obtained mainly from plants of the genus Solanum and Solanaceae family, is presented in two glycosylated forms: solamargine and solasonine. The potent antitumor action of solasodine against benign and malignant skin tumors is due to the presence of a mixture of glycosides present in its molecular structure, alredy being marketed as Curaderm®. A glycoside moiety, therefore, enables the recognition of membrane receptors and induces the cellular internalization allowing the biological activity. The extraction yield of solasodine glycosides is limited, but the extraction of aglycone occurs in higher yield. Thus, this study aims to develop and characterize more effective delivery nanosystems of solasodine and evaluate its antiproliferative activity against different cell lines. Stealth nanocapsules containing solasodine (SSD-NC) were obtained by the method of interfacial precipitation of a preformed polymer and characterized trough the morphology using scanning electron microscopy, and measurements of pH, particle size, polydispersity and surface charge. The antiproliferative activity of SSD-NC was evaluated against the cell lines NIH 3T3 (normal fibroblasts), 4T1 (murine breast cancer) and MCF-7 (human breast cancer) at concentrations ranging from 25.0 to 0.78μg/ml. The cytotoxicity of SSD-NC was determined by MTT assay after treatment of cells with concentrations varying from 25 to 0.78 μg/mL for 48 hours. The mechanism of cell death was evaluated by annexin V or propidium iodide staining, the mitochondrial membrane potential and DNA fragmentation of cells using flow cytometry at the concentrations of 3.125 and 6.25 μg/mL. A significant reduction in the viability of 4T1 and MCF-7 cells was verified in a dose and time-dependent manner, whereas the normal cells NIH 3T3 showed a lower cytotoxicity up to concentrations ≥ 25 μg/mL. IC50 values of solasodine encapsulated against 4T1 and MCF-7 cells were 5.31 and 4.14 μg/mL, respectively. A slight increase in DNA fragmentation of 4T1 and MCF-7 cells was found with the increase in SSDNC concentrations. Cells were labeled only with propidium iodide, indicating loss of cell membrane permeability and suggesting necrosis as the death mechanism. Analysis of mitochondrial membrane potential showed that the treatment with SSD-NC induces changes in the organelle membranes, confirming the results of the MTT assay, where the cells presented alterations in viability. These findings suggest that treatment of 4T1 and MCF-7 cells with SSDNC induces necrosis process associated with severe morphological changes. Encapsulation of solasodine presented a potential antiproliferative effect, allowing future in vivo study of antitumor action.

Orientador : Lauro E. S. Barata / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-02T02:46:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Minguzzi_Sandro_D.pdf: 2912134 bytes, checksum: fd76b2007568ee78830dbaaef1417b80 (MD5) Previous issue date: 2002 / Doutorado