Os autores descrevem um estudo Fase I de cisplatina com decitabina, um novo agente hipometilante de DNA, em pacientes com tumores sólidos avançados, seguido de uma avaliação do início da Fase II da combinação em pacientes com câncer pulmonar não de pequenas células inoperável (CPNPC). No teste da Fase I, a cisplatina foi estudada a uma dose fixa de 33 mg/m², enquanto a decitabina foi graduada em quatro (I-IV) níveis de escala de dosagem (45, 67, 90 para 120 mg/m², respectivamente) em grupos consecutivos de, no mínimo, 3 pacientes por nível de dosagem. A decitabina foi administrada a pacientes na forma de infusão intravenosa por 2 horas, ao passo que a cisplatina foi administrada de forma intravenosa imediatamente após o fim da infusão de decitabina. Ambos os agentes foram administrados nos dias 1-3, a cada 21 dias. Vinte e um pacientes foram incluídos no teste da Fase I. O nível IV de dosagem (20 mg/m² de decitabina) foi considerado a dose máxima tolerada (DMT), e as toxicidades limitantes de dosagem foram neutropenia, trombocitopenia e mucosite. As doses recomendadas para os testes da Fase II em pacientes com risco significativo e não significativo foram 90 (nível III) e 67 mg/m² (nível II), respectivamente. Uma resposta parcial de curta duração foi observada em um paciente com câncer cervical, enquanto duas regressões secundárias foram documentadas em pacientes com CPNPC e câncer cervical, respectivamente. A dosagem no nível II foi escolhida para o teste da Fase II em pacientes com CPNPC. Quatorze pacientes consecutivos foram incluídos nessa parte do estudo. Sua média de idade era de 57 anos (faixa de 39-75), com proporção homens/mulheres de 11/3 e um desempenho médio OMS de 1 (0-2). estágio da doença era IIIB (5) e IV (9). Em um caso, foi administrada irradiação no tórax. Avaliou-se um total de 30 séries de tratamento para toxicidade e resposta, com uma média de duas séries por paciente (1-4). Observaram-se neutropenia e trombocitopenia em graus (3-4) em cerca de metade dos casos. Também foram observadas mucosites, diarreia, náuseas, vômitos e erupções na pele em alguns pacientes (Tabelas 3 e 4). Três respostas secundárias foram documentadas, as quais perduraram por 4,16 e 36 semanas. A média de sobrevida dos pacientes foi de 15 semanas (4-38). Como conclusão, a combinação de cisplatina com decitabina não exibiu atividade antitumor significativa em pacientes com CPNPC, conforme dosagem e programa aplicados neste teste, que justificasse sua avaliação posterior nessa população de pacientes.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-11-18T18:04:29Z No. of bitstreams: 1 2014_CamilaMirandaMoura.pdf: 3899556 bytes, checksum: 84a9fb39e5724c74288152f91a7500df (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-11-19T10:06:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_CamilaMirandaMoura.pdf: 3899556 bytes, checksum: 84a9fb39e5724c74288152f91a7500df (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-19T10:06:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_CamilaMirandaMoura.pdf: 3899556 bytes, checksum: 84a9fb39e5724c74288152f91a7500df (MD5) / As infecções fúngicas são agravos persistentes à saúde pública. O atual quadro das micoses revela o aumento de sua incidência mundial e o surgimento de espécies com resistência intrínseca a antifúngicos disponíveis. Diante disso, a comunidade científica tem se empenhado na busca de alternativas terapêuticas. Os produtos naturais têm sido intensamente investigados quanto à atividade biológica. No Brasil, o bioma Cerrado se destaca pela rica diversidade química, sendo fonte promissora para o isolamento de metabólitos secundários ativos. Assim, este trabalho avaliou a atividade de extratos e substâncias da espécie do Cerrado, Astronium fraxinifolium Schott (Anacardiaceae), em leveduras, dermatófitos e células tumorais. Em uma triagem de atividade de extratos dos órgãos de A. fraxinifolium em diferentes polaridades, o extrato acetato de etila da casca da raiz foi o mais ativo, apresentando amplo espectro de ação em todos os fungos testados com valores de CIM de 0,24 a 125 ?g/mL. A partir desse extrato foram isolados dois triterpenos do tipo cicloartano: 3-?-cicloartenol (1) e 3-?-cicloeucalenol (2). Com interesse em contribuir para a quimiotaxonomia de Anacardiaceae, o extrato acetato de etila das folhas também foi submetido ao fracionamento cromatográfico devido ao seu perfil químico e ao interesse na fitoquímica da espécie. Desse extrato foram identificados uma cetona esteroidal - tremulona (3) - e dois triterpenos pentacíclicos - ?-amirina (4) e lupeol (5). Os compostos 1 e 2 apresentaram efeito citotóxico em células leucêmicas da linhagem HL-60 com valores de CI50 de 10,8 ?g/mL e 9,2 ?g/mL, respectivamente. __________________________________________________________________________ ABSTRACT / Fungal infections are persistent public health issues. The current picture of mycoses reveals an increase in their global incidence and an arise of species with intrinsic resistance to available antifungal agents. Seeing that, the scientific community has been searching for therapeutic alternatives. The natural products have been thoroughly investigated for their biological activity. In Brazil, the Cerrado biome stands out for its rich chemical diversity, being a promising source for the isolation of active secondary metabolites. Therefore, the present work evaluated the activity of extracts and substances from the Cerrado’s species, Astronium fraxinifolium Schott (Anacardiaceae), in yeasts, dermatophytes and tumoral cells. In a triage of activity from A. fraxinifolium organs’ extracts in different polarities, the ethyl acetate extract from the root’s bark was the most active, presenting broad-spectrum action in all the fungi tested with MIC values from 0.24 to 125 μg/ml. From this extract two cycloartane-type triterpenes were isolated: 3-β-cycloartenol (1) and 3-β-cycloeucalenol (2). In order to contribute to the chemotaxonomy of Anacardiaceae, the ethyl acetate extract from the leaves was also submitted to chromatographic fractionation due to its chemical profile and to the interest in the species’ phytochemistry. From this extract were identified a steroidal ketone – tremulone (3) – and two pentacyclic triterpenes – β-amyrin (4) and lupeol (5). The compounds 1 and 2 showed cytotoxic effect on leukemic cells line HL-60 with IC50 values of 10.8 μg/ml and 9.2 μg/ml, respectively.

Orientador: Bernardo Laks / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Fisica Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-07-26T18:10:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_AnaClaudiaMonteiro_M.pdf: 1092356 bytes, checksum: a4f1e8fd0b64059aac3d7bb92ef6697c (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Elipcinas e seus derivados são uma classe de moléculas utilizadas no tratamento do câncer humano por apresentarem forte atividade citotóxica e antitumoral. Os mecanismos de ação são multimodais, podendo incluir, entre outros, efeitos como intercalação no DNA, geração de espécies oxidantes e interferência na atividade catalítica da topoisomerase. A contribuição relativa de cada um destes mecanismos, devido à sua complexidade, ainda é um problema em aberto e que demandará muita investigação. Através de cálculos semi-empíricos de química quântica - PM3 e ZINDO/S-CI - mostramos que é possível correlacionar alguns índices eletrônicos com a seletividade biológica em uma nova classe de compostos - análogos aza das elipcinas - como a 6-11-Dimethyl-5H-pyrido [3 ' ; 4 ' : 4; 5] pyrolo [2, 3 - g ] isoquinoline - e seus derivados. O cálculo de curvas equipotenciais eletrostáticas permitiu também a determinação de centros ativos e suas correlações com o índice de afinidade aparente / Abstract: Ellipticine and derivatives constitute a material class of powerful anticancerous agents that have been used in the treatment ofhuman cancer due their hight cytotoxicity and anti - tumor activity. The action mechanisms are multimodal, including binding to DNA through intercalation, generation of oxidizing species and interference with the catalytic activity of topoisomerase. The relative contribution of each one of these mechanisms, still remain an open problem. We have used quantum mechanics semiempirical methods - PM3 and ZINDO/S-CI - in order to search for the possibility of relationship between some electronic indexes and the biological activity in a new class of compounds: the aza analogues of ellipticine like 6-11-Dimethyl-5H-pyrido [3', 4' : 4, 5] pyrolo [2, 3 - g] isoquinoline - and their derivatives. Furthermore the determination of the active sites and their relation with the apparent afinity indexes are done through the analysis of the calculated electrostatic fields / Mestrado / Física / Mestre em Física

Orientadores: Carmem Verissima Ferreira, Hiroshi Aoyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T11:24:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_TelmaMariaAraujo_D.pdf: 6074336 bytes, checksum: e6dab7e3aafad9713e6fc89d823e83ff (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi relacionar o efeito citotóxico do ácido okadáico um potente e específico inibidor de serinaJtreonina fosfatase (PP1 e PP2A) e trans-desidrocrotonína, um 19-nor-clerodane, é o maior norditerpeno obtido da croton Cajucara; uma planta medicinal brasileira, a qual apresenta importante atividade bíologica como antineoplásica e antiulcerigênica sobre a cultura primária de linfócitos humanos com a atividade de fosfatases. Primeiramente, a fosfatase total foi caracterizada cineticamente através dos seguintes estudos: efeitos de substrato, pH, potenciais inibidores, metais e outros compostos. Nossos resultados mostraram que a fosfatase predominante nos linfócitos trata-se de uma proteína tirosina fosfatase, uma vez que hidrolisou eficientemente tirosina fosfato (60%), foi fortemente inibida pelo pervanadato (100%), vanadato (80%), p-cloromercuribenzoato (90%), coquetel inibidor de proteína tirosina fosfatase (70%) e apresentou insensibilidade ao ácido okadáico (100 nM). Nos estudos de citotoxicidade avaliamos o efeito do ácido okadáico e da desidrocrotonina, através dos seguintes parâmetros: redução do MTT (integridade mitocondrial), conteúdo total de proteínas (número de células) e atividade fosfatásica (metabolismo celular). Nos testes de citotoxicidade o ácido okadáico e a desidrocrotonina (na ausência do mitogêno) apresentaram efeito tóxico sobre linfócitos humanos quando analisados os parâmetros fosfatase e MTT com valores de ICso 47 e 100nM para o ácido okadáico; 450 fJM para a desidrocrotonina. O efeito mitogênico do OKA (10nM) sobre os linfócitos foi detectado 10 min após o tratamento com este composto, o qual causou aumento de 30% no número de células, este efeito foi inibido na presença da desidrocrotonina. Quando avaliamos o efeito da desidrocrotonina na CD45 purificada observamos uma inibição significativa. Este composto apresenta ação oxidante, portanto a inibição da fosfatase por estes compostos pode ser devido a formação de adutos. Os resultados obtidos neste estudo indicam que a PTP presente nos linfócitos pode servir de forma complementar, como um parâmetro de viabilidade celular e nos fornecer informações importantes sobre o metabolismo celular / Abstract: The aim of this work was to correlate the cytotoxic effeet of Okadaic acid is a potent, speeifie inhibitor of protein serine/threonine phosphatase (PP1 and PP2A).and trans-dehydrocrotonin, a 19-nor-clerodane, is the major norditerpene obtained from Croton cajueara, a Brazilian medicinal plant, which present important biological activities as antineoplasic and antiulcerogenic on the primary culture of human Iymphocytes with phosphatase activities. Firstly, the kinetic of total phosphatase from these cells was studied through the following properties: substrate specificity, optimum pH, effect of potential inhibitors, metais and compounds. Our results showed that the main phosphatase present in the cellular extract was a protein tyrosine phosphatase, once the tyrosine phosphate was effieiently hydrolized by the enzyme (60%), inhibíton by vanadate (100%), pchlromereuribenzoate (90%), PTP cocktail inhibitor and insensíbílity by okadaíc acid. The eytotoxicity studies of okadaic acid and dehydrocrotonin on human Iymphoeytes were evaluated through three endpoints of cytotoxicity: MTT reduction (mitochondrial function), protein content (cel! number indication) and phosphatase activity (cel! metabolism). Okadaic acid and dehydrocrotonin presented toxíc effects when the parameters phosphatase and MTT were analyzed, with the following ICso values: 47 and 100 nM for okadaic acid and 450 jJM for dehydrocrotonín. The mitogenic effect of OKA (10nM) was detected after 10 minutes of treatment with this compound, which inereased 30% of cell number. However, when OKA was incubated with dehydrocrotonin, the cel! proliferation was prevented. Dehydrocrotonin caused significative inhibition of CO45 purified from Iymphocyte membranes. This compound presents oxidant action, then the inhibition of PTP by dehydrocrotonin could be due the adducts formation. The results obtained in this study indicate that PTP from Iymphocytes could be utilized as parameter of cel! viability and provi de important information about cel! metabolism / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Magíster en Química área de Especialización en Química Medicinal y Memoria para optar al Título de Químico / Los derivados quinónicos poseen interesantes aplicaciones en áreas de la química de materiales y medicinal. Estos compuestos pueden ser encontrados tanto en la naturaleza como obtenerse sintéticamente, su síntesis ha despertado interés, debido a la posibilidad de funcionalizarlas, con el objetivo de mejorar sus propiedades, y también obtener nuevas estructuras. En este trabajo se informa la síntesis y caracterización de una serie de amino-, tio- y carbazolquinonas estructuralmente relacionadas con calotrixinas. Para la síntesis de amino y tioquinonas se utilizó un protocolo de química verde, utilizando agua como solvente. En una segunda etapa, se realizó la ciclación de quinonas que presentan sustituyentes dadores o aceptores en posiciones no impedidas, mediante el uso de acetato de paladio (II)1. Estos compuestos fueron caracterizados espectroscópicamente mediante resonancia magnética nuclear (1H, 13C y experimentos bidimensionales), sus actividades biológicas preliminares fueron estudiadas en líneas celulares de carcinoma mamario de ratón TA3. / Quinone derivatives have shown interesting applications in diverse chemical areas such as materials and medicinal chemistry. These compounds can be found in nature or being synthesized, and their synthesis has awakened some interest because they can be functionalized, and new structures can be obtained. In this work the synthesis and characterization of a series of amino-, tio- and carbazolquinones structurally related to Calothrixins are reported. For amino and tioquinone-derivative synthesis, a green chemistry protocol has been followed, using water as solvent. In a second stage, quinones containing donor or acceptor moieties not sterically hindered, were cyclized using Palladium (II) acetate 1. The quinone derivatives were characterized utilizing nuclear magnetic resonance techniques (1H, 13C and bidimensional), and their preliminary biological activities were studied using TA3 mammary carcinoma cells from mice / Fondecyt

Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-10-09T21:02:26Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO José Guedes da Silva Júnior.pdf: 2699851 bytes, checksum: 680fbb4f9eaf27c316716d1074b117f5 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-11-21T19:31:43Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO José Guedes da Silva Júnior.pdf: 2699851 bytes, checksum: 680fbb4f9eaf27c316716d1074b117f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-21T19:31:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO José Guedes da Silva Júnior.pdf: 2699851 bytes, checksum: 680fbb4f9eaf27c316716d1074b117f5 (MD5) Previous issue date: 2015-02-09 / FACEPE / Segundo a Organização Mundial de Saúde as neoplasias estão entre as doenças com maior índice de mortalidade, acometendo aproximadamente 17 milhões de pessoas em todo o mundo. Desta maneira, a pesquisa de novos compostos contra o câncer é fundamental, para que novos medicamentos antineoplásicos com maior eficácia e mais segurança sejam desenvolvidos. Nesse contexto, esse projeto propôs a síntese e avaliação antitumoral de ftalimidas glicoconjugadas sobre tumores sólidos experimentais em camundongos albinos suíços machos. A síntese química das ftalimidas glicoconjugadas com triazóis (1A, 1B e 1C) foi obtida através da reação de cicloadição 1,3-dipolar. A citotoxicidade in vitro foi realizada em linhagens de células MCF-7, HL 60 e NCL H292 utilizando o método colorimétrico de MTT (3- [4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio) de acordo com o protocolo do National Câncer Institute (NCI). A atividade anti-tumoral in vivo foi avaliada em 5 grupos de camundongos: controle negativo que recebeu Carboximetilcelulose 1%, grupo controle positivo 5-Fluoruracil e os grupos tratados com as ftalimidas 1A, 1B e 1C durante sete dias. A dose utilizada foi de 20mg/kg/dia e os animais tiveram acesso livre a água e alimentação. No oitavo dia os animais foram sacrificados e obtidos amostras de sangue para análise do hemograma e os tumores para avaliação histológica. As avaliações foram feitas frente ao Carcinoma de Eherlich e ao Sarcoma 180. A avaliação da inibição tumoral (TWI%) foi realizada através do cálculo: TWI= C-T/Cx100, onde C: é a medida do peso dos tumores do grupo controle negativo e T: é a média dos pesos dos tumores dos animais tratados. Foi realizado o ensaio antiinflamatório por peritonite também na dose 20mg/Kg e o Ácido Acetilsalicilico como controle positivo. Os valores foram expressos como média ± desvio padrão, com um intervalo de confiança de 95%, as diferenças estatísticas foram acessados por ANOVA. Os resultados obtidos na citotoxicidade In vitro demonstraram que compostos sintetizados apresentaram baixa percentagem de inibição do crescimento das células NCIH 292, HL60 e MCF-7 (>20). Já na atividade antitumoral In vivo com o tumor Ehrlich os animais tratados com o composto 1A tiveram uma inibição de 63,8% do tumor, enquanto os tratados com o composto 1B tiveram 62,8% de inibição tumoral e com o composto 1C 62%. O grupo controle positivo tratado com 5-Fluorouracil apresentou inibição de 76,6%. Frente ao Sarcoma 180 o composto 1A inibiu em 70,6% o crescimento tumoral, o composto 1B em 62,% e o composto 1C 64,3%, já o grupo tratado com o 5-Fluoracil inibiu o crescimento do tumor em 76,8%. Não foram encontradas alterações hematológicas em nenhum dos grupos experimentais. Os compostos 1A, 1B e 1C mostraram-se também capazes de reduzir o número de leucócitos do líquido peritoneal formado na cavidade dos animais, apresentando boa atividade Anti-inflamatória. Os resultados obtidos demonstraram boa atividade antitumoral das ftalimidas glicoconjugadas frente ao Carcinoma de Ehrlich e ao Sarcoma 180 In vivo, além de excelente atividade Anti-inflamatória, colocando esses compostos como grupos farmacofóricos promissores para tratamento do câncer. / Cancer is a group of diseases characterized by loss of control of cell differentiation and proliferation. According to the World Health Organization (WHO) neoplasms are among the diseases with the highest mortality rate, affecting approximately 17 million people worldwide. Thus, the search for new compounds against cancer is critical for developing new anticancer drugs with greater efficacy and safety. In this context, this project proposes the synthesis and antitumor evaluation of phthalimides glycoconjugate on experimental solid tumors in Swiss albino male mice. Chemical synthesis of glycoconjugate with triazoles phthalimides (1A, 1B, and 1C) was obtained by 1,3-dipolar cycloaddition reaction. The in vitro cytotoxicity evaluation was performed on MCF-7, HL60 and NCL H292 cell lines by colorimetric method using the MTT (3- [4,5- dimethylthiazole-2-il]-2,5- diphenyltetrazolium), according to the protocol of the National Cancer Institute (NCI). The in vivo anti-tumor activity was assessed in 5 groups of mice, each with eight animals: a negative control group that received carboxymethylcellulose 1%, a positive control group treated with 5-fluorouracil and the other groups treated with the phthalimides 1A, 1B and 1C, for seven days. The dose was 20 mg/kg/day and the animals had free access to food and water. On the eighth day the animals were sacrificed and blood samples collected for complete blood count and examination of the tumors for histological evaluation. The evaluations were made against Eherlich carcinoma and sarcoma 180. Assessment of tumor inhibition (TWI%) was performed by calculating: TWI = TC / CX100, where C: is the measure of the weight of tumors of the negative control group and T: is the average weight of the tumors of treated animals. It was conducted the anti-inflammatory peritonitis assay also at 20 mg/kg using acetylsalicylic acid as positive control. Values were expressed as mean ± standard deviation, with a 95% confidence interval, and the statistical differences were assessed by ANOVA. Results from the in vitro cytotoxicity showed that the synthesized compounds showed a low percentage of growth inhibition of cells NCIH 292, HL-60 and MCF-7 (> 20). While in vivo antitumor activity with Ehrlich tumor, animals treated with compound 1A had a 63.8% inhibition of tumor, ones treated with the compound 1B had 62.8% tumor inhibition and compound 1C had 62%. The positive control group treated with 5-fluorouracil showed 76.6% inhibition. Front Sarcoma 180, the 1A compound inhibited in 70.6% tumor growth, compound 1B in 62% and compound 1C in 64.3%, whereas the group treated with 5-Fluoracil inhibited tumor growth by 76.8%. No hematological changes were found in any of the experimental groups. Compounds 1A, 1B and 1C also show up able to reduce the number of leukocytes in the peritoneal fluid formed in the cavity of the animals, demonstrating good anti-inflammatory activity. The results showed good antitumor activity of phthalimides glycoconjugate against Ehrlich carcinoma and sarcoma 180 in vivo as well as excellent anti-inflammatory activity, placing these compounds as promising pharmacophore groups for cancer treatment.

Memoria para optar al Título de Bioquímico / El cáncer es una patología que ha concentrado por muchos años, una gran atención y constante investigación en búsqueda de nuevos fármacos para su tratamiento. Con el objeto de desarrollar nuevas terapias contra esta enfermedad, analizamos el potencial antineoplásico de dos nuevos compuestos orgánicos: 4,4- Dimetil-5-8-dihidroxinaftaleno-1-ona (DHN) y 9,10-dihidroxi-4,4-dimetil-5,8-dihidro- 1(4H)-antraceno (DHA). En primera instancia estudiamos el efecto de estos compuestos sobre la proliferación de células tumorales humanas U937 y K562, mediante el método de exclusión del colorante azul de tripan. Los resultados mostraron en ambas líneas celulares que DHN y DHA provocaron una disminución de la viabilidad en forma dosis-dependiente, con selectividad sobre células tumorales y no sobre células normales (PBMC) con un IC50 a 72 horas de 7,96 μM para DHA y 40,39 μM para DHN en U937 y de 0,68 μM para DHA y 32,10 uM para DHN en K562. Sabiendo que señales proinflamatorias favorecen el proceso carcinogénico, se estudió el efecto que tendrían ambos compuestos sobre la expresión de Cox-2 en células U937, previamente diferenciadas a macrófago con TPA y estimuladas con LPS. Los inmunowesterblot mostraron una disminución de la inducción y expresión de dicha enzima por acción de DHA a una concentración de 10 uM. Mediante ensayos de viabilidad se observó que ambos compuestos en combinación con extractos naturales no exhiben mayor efecto inhibitorio sobre la viabilidad; sin embargo, con indometacina un antiinflamatorio conocido, se potencia el efecto inhibitorio que tiene DHA. Por otra parte, mediante citometria de flujo se midió el efecto de DHN y DHA sobre el potencial de membrana mitocondrial con rodaminal23 y la generación de ROS mediante CM-H2DCFDA. Los resultados muestran una despolarización de la membrana por acción de ambos compuestos en especial por DHA y una baja generación de ROS por parte de ambos. Dado que las células NK constituyen un importante mecanismo de defensa antitumoral, se evaluó el efecto de DHN y DHA sobre la actividad citotóxica mediada por células NK midiendo la liberación de 51Cr desde células blanco K562. Los resultados indicaron que ambos compuestos no alteran la respuesta normal de las células NK. De acuerdo a estos resultados podemos inferir que DHA y DHN ejercen una importante acción antitumoral inhibiendo la proliferación de células tumorales. Sin embargo el efecto de DHA es mayor al de DHN, esto podría explicarse probablemente debido a un efecto citotóxico mediado por la despolarización de la membrana mitocondrial, y/o inhibiendo la respuesta proinflamatoria mediada por Cox-2, sin generación de especies reactivas por parte de ningún compuesto y sin afectar la respuesta inmune innata / Cancer is a pathology that has concentrated, a great deal of attention in biological research aimed principally to find new drugs for its treatment. For this reason we decided to study the antitumoral effects of two new organic compounds: 4,4-Dimetil-5-8-dihidroxinaftaleno-1-ona (DHN) and 9,10-dihidroxi-4,4-dimetil-5,8- dihidro-1(4H)-anthraceno (DHA). In the first place we studied the effect of these compounds on the proliferation of two human tumor cells lines, U937 and K562, using the trypan blue dye exclusion method. Our data showed a decrease on the cell viability in a dose-dependent manner. Tumor cell lines resulted more sensitive to these compounds. Thus the IC50 values were 7.96 μM for DHA and 40.39 μM for DHN in U937; 0.68 μM for DHA and 32.10 uM for DHN in K562. Interestingly PBMC viability was not affected by these compounds. It has been shown that proinflammatory signals favor the carcinogenic process. Thus we evaluated the effect of DHN and DHA on the in vitro LPS-induced COX-2 expression. Our results showed that both compounds partially inhibited LPSinduced expression of COX-2. A 60 % and 80% suppressed expression of COX-2 were observed by DHN and DHA respectively. On the other hand, these compounds in combination with anti-inflammatory natural plants extracts did not shown any additive effect upon tumour cell viability. Nevertheless, indometacina a well known antiinflammatory drug, in combination with DHA increased the tumour cell citotoxicity effect. In order to understand the mechanism of action of these compounds we evaluated whether the mitochondrial membrane potential of K562 cells could change due to DHA and DHN. Our results showed that treatment with both compounds induced a depolarization of the mitochondrial membrane as assessed with rhodamine123. Moreover, the depolarization induced by DHA was higher than DHN. On the other hand, when we study the effects of DHA and DHN on the intracellular formation of reactive oxygen species no ROS generation was detectable by any of these compounds. Morover our findings show that both compounds could protect from ROS at 25 μM. NK cells constitute an important mechanism of antitumor defense. For this reason it is desirable that DHN and DHA did not affect at all the NK cell function. Thus, NK citotoxic activity was measured using the 51Cr release assay from the target cell K562. Our results indicated that neither DHA nor DHN affected NK citotoxic activity. According to these results we can conclude that DHA exerts an important antitumor upon U937 and K562 tumor cells, probably due to the depolarization of the mitochondrial membrane, and/or inhibiting the expression of Cox-2, without generation of reactive species and without affecting the innate immune response

Memoria para Optar al Título de Bioquímico / Los Análisis electroquímicos de nitrosos aril dihidropiridinas muestran que estos compuestos pueden modificar los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS). Los ROS son pro-oxidantes derivados del oxígeno que en concentraciones fisiológicas pueden estar involucrados en transducción de señales, que durante un estrés oxidativo se encuentran en exceso y pueden provocar daños a importantes funciones biológicas afectando la viabilidad celular. De hecho, el incremento en la producción de ROS ha sido implicado en muchos procesos fisiológicos y patológicos incluyendo envejecimiento y carcinogénesis. Dada la importancia de estas especies, tanto en procesos normales como patológicos, se estudió el potencial efecto antitumoral de estos nitrosocompuestos. Para ello, se evaluó el efecto de los nitrosoderivados sobre la viabilidad celular utilizando las líneas de células tumorales (RAW, U937, K562) y células mononucleares obtenidas desde sangre periféricas de donantes normales (PBMC), mediante ensayos con el reactivo 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2Htetrazolium (MTS). También se cuantificó el efecto sobre la generación de ROS en células tumorales y PBMC usando el marcador diclorodihidrofluoresceina diacetato (DCFH-DA). Además, debido a la importancia de la enzima COX-2 en el desarrollo de la tumorogénesis, se evaluó el efecto de los nitrosocompuestos sobre la actividad de esta enzima inducida in vitro por LPS. Finalmente, se midió el efecto sobre la actividad citotóxica de las células Natural Killer mediante el ensayo de liberación de 51Cr desde células blancos radiomarcadas, dado que las células NK representan una importante defensa del sistema inmune innato contra células tumorales. Nuestros resultados indicaron que los nitrosos aril dihidropiridinas generan un efecto citotóxico dosis dependiente sobre las células tumorales. Sorprendentemente las células PBMC muestran mayor resistencia al efecto de estos nitrosoderivados, lo cual, se refleja en los IC50 obtenidos de los análisis de viabilidad celular, donde los IC50 para células tumorales variaron entre 4-19 μM, en cambio, para células PBMC variaron entre 43-63 μM. Por otro lado, los resultados obtenidos de los experimentos de generación de ROS mostraron que los nitrosocompuestos aumentan los niveles de ROS en células K562, pero no en PBMC. También, se observó una inhibición de la expresión de COX-2 inducida por Lipopolisacárido (LPS) por efecto de los nitrosocompuestos. Además, la actividad de las células NK no varió por acción de estos compuestos en ninguna de las concentraciones analizadas. Estos resultados sugieren que los nitrosocompuestos presentan citotoxicidad principalmente sobre células tumorales la que podría estar mediada por generación de ROS. La inhibición de la expresión de COX-2 potenciaría esta actividad antitumoral. Además, al no afectar la actividad de las células NK mantienen activa la respuesta antitumoral inmunológica innata. Los resultados obtenidos permiten concluir que los nitrosocompuestos presentaron una importante actividad antineoplásica sin afectar de manera significativa la viabilidad de las células mononucleares ni la Actividad citotóxica de células Natural Killer (ACNK). Esto, asociado al efecto sobre COX-2, refuerza el potencial antitumoral de estos compuestos lo cual apoya estudios adicionales para dilucidar su mecanismo de acción / Electrochemical analisys of dihidropyridines show that these compounds can modify intracellular levels of reactive oxygen species (ROS). ROS are pro-oxidating derivatives of oxygen, which at physiological concentrations can be involved in signals transduction. However, during oxidative stress, high levels of ROS have additional unfavorable effects upon crucial biological function which can dramatically affect cellular viability. In fact, increase in the production of ROS has been implicated in many human disease processes, including aging and carcinogenesis. Thus, due to the importance of nitrosocompounds, both in normal and pathological processes, we decided to study the potential antitumoural effects of these derivatives. For this reason we studied the in vitro effects of nitroso aril dihidropyridines on the cellular viability of several tumour cells lines (RAW, U937, K562) and also in PBMC using the reagent 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4- sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) assay. Besides, the intracellular generation of ROS in the presence of nitrosocompounds in tumor cells and PBMC was measured with the fluoroprobe CM-H2 DCFDA (5-(and -6)-chloromethyl-2`,7`-dichlorodihydrofluorescein diacetate). Because COX-2 plays an important role in carcinogenesis and its expression is modulated by ROS we evaluated the effect of Nitrosocompounds on the in vitro Lipopolisacarid (LPS)-induced expression of COX-2. An important defense of the innate immune response against tumor cells is due to NK cell function. Thus, we measured the effect of Nitrosocompounds on the natural killer citotoxic activity of PBMC using the Cr51 release assay. Our findings indicate that the dihidropyridines derivatives produce a dose response citotoxic effect on tumour cells. Surprinsingly, PBMC showed to be more resistance to the effect of these nitrosoderivates. In fact the IC50 values for tumour cells viability varies between 4-19 μM while for PBMC the IC50 values ranged between 43-63 μM. This result correlates with ROS generation were nitrosocopounds significantly raised ROS levels in K562 cells, but not in PBMC. Moreover, nitrocompounds induced an important inhibition of LPS induced-COX-2 expression in RAW cells. On the other side, NK cell activity of PBMC was not modified by these composed. These findings suggest that the nitrosoderivatives exerted a citotoxic effect mainly on the tumour cell lines studied and that correlates with and increased ROS levels and an inhibition of COX-2 expresion. In conclusion these results indicates that nitrosoderivatives have a potential antitumour activity

O 5-Fluorouracil (5-FU) é um agente antitumoral amplamente empregado no tratamento de diversos tipos de cânceres. Embora haja muitos trabalhos publicados com este antineoplásico, estudos sobre seus mecanismos de ação ainda tornam-se necessários a fim de se obter protocolos clínicos mais eficazes. Desta forma, novos aspectos sobre seu mecanismo de citotoxicidade foram investigados neste trabalho. Na primeira parte foram avaliadas as vias de reparação de DNA que participam em resposta a danos induzidos pelo 5-FU e seus efeitos comparados com o seu metabólito ativo FdUMP em Saccharomyces cerevisiae. Os resultados apontam que as lesões induzidas pelo 5-FU podem ser processadas pela vias de reparo por excisão de bases (BER), reparação de bases mal-emparelhadas (MMR), reparo pós-replicativo (PRR) e recombinação homóloga (HR), enquanto que os danos induzidos pelo FdUMP seriam reconhecidos e removidos apenas pelas vias BER e MMR. Estas diferenças no recrutamento das vias de reparo relacionam-se aos diferentes tipos de lesões que são geradas pelos antimetabólitos: o 5-FU induz quebras de fita simples (SSBs) e duplas (DSBs), enquanto que o FdUMP forma principalmente SSBs. Na segunda parte foi investigada a participação de modeladores da cromatina na citotoxicidade do 5-FU em S. cerevisiae. Os resultados em conjunto sugerem que os remodeladores da cromatina dependentes de ATP e algumas acetiltransferases de histona podem influenciar na citotoxicidade do agente 5-FU, possivelmente atuando no relaxamento da cromatina, e assim facilitando os processos de reparação de DNA por HR e PRR. Na terceira parte foi avaliada a resposta ao dano no DNA por ATR/Chk1 e ATM/Chk2 em células tumorais humanas. Os resultados mostraram que o 5-FU ativa principalmente a via ATR/Chk1. Ao se investigar os efeitos do 5-FU em combinação com o AZD7762, um inibidor de Chk1/2, observou-se aumento de sensibilidade ao agente antitumoral, diretamente relacionado ao aumento de células em sub-G1, diminuição em G2/M e indução de mitose prematura. Os resultados em conjunto obtidos neste trabalho nos permitem uma melhor compreensão destes mecanismos de ação do 5-FU, e fornece subsídios para melhora de protocolos terapêuticos. / 5-Fluorouracil (5-FU) is an antitumor drug employed in the treatment of several cancer types. Despite many studies have been conduced with this antineoplasic drug, investigations concerning on its action mechanism become necessary in order to obtain more efficient clinical protocols. Therefore, new aspects about its cytotoxicity mechanism were investigated in this work. First, DNA repair pathways involved in the repair of 5-FU-induced lesions were evaluated and compared to the effects of its active metabolite FdUMP in Saccharomyces cerevisiae. Our data showed that lesions induced by 5-FU may be processed by base excision repair (BER), mismatch repair (MMR), post-replication repair (PRR) and homologous recombination (HR), while FdUMP lesions are recognized and removed only by BER and MMR. These differences in repair pathways recruitment are related to the different lesion types induced by the antimetabolites: 5-FU induces single- and double stranded breaks (SSBs and DSBs), while FdUMP induces mainly SSBs. In the second part we investigated the participation of chromatin remodeling in the 5- FU cytotoxicity in S. cerevisiae. Together, our data suggest that ATP-dependent chromatin remodeling and some histone acetyltransferases may influence 5-FU cytotoxicity, probably acting in chromatin relaxation and facilitating DNA repair process by HR and PRR. In the third part, the DNA damage response by ATR/Chk1 and ATM/Chk2 were evaluated in human tumor cells. The data showed that 5-FU activates mainly ATR/Chk1 pathway. When we investigate the effects of 5-FU in combination with AZD7762, the Chk1/2 inhibitor, we observed increased sensitivity to this antitumor agent, directly related to enhanced number of sub-G1 cells, decrease in the G2/M cells, and premature mitose induction. Our data permit a better comprehension of 5-FU action mechanisms and provide clues to improve the current therapeutics protocols.

O 5-fluorouracil (5-FU) é um antineoplásico análogo pirimídico empregado no tratamento de muitos tipos de cânceres. Três diferentes mecanismos de citotoxicidade são atribuídos a este agente: incorporação de fluoronucleotídeos no DNA ou RNA e a inibição da enzima timidilato sintase. O 5-FU pode ser convertido ao seu metabólito ativo, o 5-fluoro-2´-deoxiuridina-5´-monofosfato (FdUMP), que por sua vez, pode inibir a enzima timidilato sintase (TS), responsável pela síntese de timidina monofosfato a partir de uridina monofosfato; a inibição de TS leva ao desbalanço do pool de nucleotídeos, diminuindo a concentração de dTTP, aumentando a de dUTP e, como conseqüência, levando à incorporação de uracil na cadeia de DNA. No presente estudo comparamos a atividade citotóxica de 5-FU e de seu metabólito FdUMP e as vias de reparação de DNA envolvidas na eliminação das lesões induzidas por estas substâncias. A atividade citotóxica foi avaliada em células de adenocarcinoma de cólon humano, linhagem SW620. As vias de reparação foram estudadas em linhagens de Saccharomyces cerevisiae deficientes em genes de reparo para excisão de bases (BER), excisão de nucleotídeos (NER), recombinação homóloga (HR), recombinação não-homóloga (NHEJ) e síntese translesão (TLS). Para se investigar a possível sobreposição das vias de reparo, foram empregados quádruplos mutantes em BER e NER, HR ou TLS. Os resultados em células tumorais humanas mostraram que tanto 5-FU, quanto FdUMP desencadeiam morte celular por apoptose. Ao avaliar a progressão do ciclo celular, observou-se que 5-FU leva a parada em G1, enquanto que FdUMP, parada em G2. Com a finalidade de se investigar se estas paradas de ciclo celular estariam relacionadas a quebras de DNA, foram empregados ensaios de fosforilação da histona H2AX e os testes de cometa alcalino e de micronúcleos. Observou-se que ambas as drogas induzem fragmentação no DNA, uma vez que foram observadas quebras de fita simples e formação de micronúcleos. Logo, a diferença na progressão do ciclo celular não está relacionada com a habilidade das drogas em induzir quebras. Desta forma, sugere-se que o efeito diferencial de 5-FU e FdUMP na progressão do ciclo celular depende do tipo de lesão induzida pelas drogas e as vias de reparação de DNA implicadas no reconhecimento das mesmas. Ao empregar linhagens de S. cerevisiae proficientes e deficientes em reparo tratadas com 5-FU e FdUMP, observou-se que a proteína Apn1 é de extrema importância no reparo das mesmas, uma vez que apn1Δ foi o mais sensível de todos mutantes e ntg1Δntg2Δapn1Δ apresentou grande sensibilidade aos tratamentos com ambas as drogas. As lesões causadas por 5-FU seriam reconhecidas principalmente pela Ntg2, o que resulta em significativa sensibilidade em ntg2Δ e ntg1Δntg2Δ. Entretanto, para o reconhecimento dos danos por FdUMP são necessárias a participação tanto de Ntg1 quanto Ntg2, como visto na elevada sensibilidade do duplo mutante ntg1Δntg2Δ. As deficiências em Ung1 e Rad27 não revelaram diferenças significativas em relação às linhagens selvagens, bem como nos mutantes em NER (rad1Δ e rad10Δ), HR (rad52Δ), NHEJ (rad50Δ) e TLS (rev1Δ e rev3Δ), para ambas as drogas. No emprego de quádruplos mutantes, verificou-se que ntg1Δntg2Δapn1Δrad52Δ mostrou uma acentuada sensibilidade quando tratado com 5-FU. Estes resultados sugerem que os danos gerados por 5-FU poderiam ser reconhecidos e removidos pela DNA glicosilase Ntg2 e AP endonucleases Apn1 do BER, levando a quebras de fita simples e dupla de DNA, que seriam reparadas por HR (Tipo RAD52). Entretanto, para o tratamento com FdUMP não foram observadas diferenças significativas quando comparado com a linhagem selvagem. Ao analisar a sensibilidade dos mutantes ntg1Δntg2Δapn1Δrad1Δ e ntg1Δntg2Δapn1Δrev3Δ, verificou-se que os mesmos não foram sensíveis ao tratamento com FdUMP, entretanto apresentaram moderada sensibilidade quando tratados com 5-FU. O conjunto desses resultados nos leva a sugerir que uma pequena parte dos sítios AP produzidos pelo tratamento com 5-FU poderia ser processada por NER e TLS, sendo a participação de HR a mais importante. As lesões geradas por FdUMP seriam reparadas principalmente por BER, com a participação de Ntg1, Ntg2 e Apn1, porém não pode ser descartado o possível envolvimento da reparação de bases mal-emparelhadas - MMR, uma vez que se observou previamente, uma parada no ciclo celular em G2 em células de adenocarcinoma de cólon humano SW620. / 5-fluorouracil (5-FU) is an antineoplastic drug pyrimidic analogue employed in the treatment of several cancers. Three different mechanisms of cytotoxicity are attributed to this agent: misincorporation of fluoronucleotides in DNA or RNA and inhibition of thymidilate sintase enzime. 5-FU could be converted to its active metabolite, 5-fluoro-2´-deoxiuridina-5´-monofosfato (FdUMP), that could inhibit the thymidilate sintase (TS), related to thymidine synthesis from uridine; TS inhibition leads to nucleotide pool imbalance, decreasing thymine concentration and increasing uracil, as consequence, it leads to uracil incorporation into DNA. The present study compared the cytotoxic activity of 5-FU and its active metabolite FdUMP, and the DNA repair pathways involved in removing lesions induced by these substances. Cytotoxicity was evaluated in human colon adenocarcinoma cells, SW620. DNA repair pathwayas were studied in Saccharomyces cerevisiae deficient in base excision repair (BER), nucleotide excision repair (NER), homologous recombination (HR), non-homologous end joining (NHEJ) and translesion synthesis (TLS). To investigate the overlapping of DNA repair pathways, we employed quadruple mutants in BER and NER, HR or TLS. Results in human tumor cells showed that both 5-FU and FdUMP induce cell death by apoptosis. When we investigated the cell cycle progression, we observed that 5-FU lead G1 arrest, while FdUMP induced G2 arrest. In order to investigate if these arrests would be related to DNA breaks, alkaline comet assay, fosforilation of H2AX histone and micronucleus assay were employed. We observed that both drugs induce DNA fragmentation, since single strand breaks and micronucleus were evidenced. Thus, the difference in cell cycle progression is not related to the ability of 5-FU and FdUMP in induce breaks. This way, we suggest that the differential effect of 5-FU and FdUMP in cell cycle progression depends on the type of lesion originated by drugs and the DNA repair pathways implicated in recognize them. By employing S. cerevisiae strains proficient and deficient in DNA repair treated with 5-FU and FdUMP, it was observed that Apn1 protein is extremely important in repairing these lesions, since apn1Δ was the most sensitive of all mutants employed and ntg1Δntg2Δapn1Δ showed high sensitivity to treatments with both drugs. Lesions caused by 5-FU would be recognized mainly by Ntg2, what results in significant sensitivity in ntg2Δ and ntg1Δntg2Δ. However, for recognition of FdUMP damage it is necessary the participation of both Ntg1 and Ntg2, as observed in high sensitivity of ntg1Δntg2Δ double mutant. Deficiencies in Ung1 and Rad27 did not reveal significant differences in relation to WT, as well as mutants in NER (rad1Δ e rad10Δ), HR (rad52Δ), NHEJ (rad50Δ) e TLS (rev1Δ e rev3Δ), for both drugs. When we employed quadruple mutants, we verified that ntg1Δntg2Δapn1Δrad52Δ showed higher sensitivity when treated with 5-FU. These data suggest that damage generated by 5-FU could be recognized and removed by DNA glycosylases Ntg2 and AP endonuclease Apn1 from BER, generating DNA single and double strand breaks, that could be repaired by HR (RAD52 Type). However, for FdUMP, we did not observe significant differences in comparison to WT. By investigating the sensitivity of ntg1Δntg2Δapn1Δrad1Δ and ntg1Δntg2Δapn1Δrev3Δ, we observed that they were not sensitized by FdUMP, however, they present a slight sensitivity when treated with 5-FU. These results lead us to suggest that a small part of AP sites generated by 5-FU could be processed by NER and TLS, and HR would be the most significant. Lesions by FdUMP would be repaired mainly by BER, with participation of Ntg1, Ntg2 and Apn1, however, we can not discharge the possible involvement of mismatch repair pathway - MMR, since we previous observed G2 arrest in SW620 human colon adenocarcinoma cells.