Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / En la presente Memoria se hace un estudio sistemático sobre la síntesis de 9-metoxiy 9-nitro-cromenodihidropiridinas y cromenopiridinas substituídas, las cuales fueron posteriormente caracterizadas física y electroquímicamente. Las estrategias de síntesis fueron divididas en dos grandes grupos: 1.- Estrategias basadas en la condensación de los aldehídos respectivos con acetoacetato de etilo o alternativamente condensaciones del aldehído con 3-aminocrotonato de etilo. 2.- Estrategias basadas en la adición de tipo Michael a 6-metoxi- y 6-nitro-cumarinas previamente sintetizadas. Las operaciones reales para cada una de las estrategias propuestas fueron realizadas y descritas completamente. Los productos obtenidos en cada etapa de reacción fueron caracterizados por su punto de fusión, espectroscopia 1H-RMN, 13C-RMN y análisis elemental. En esta Memoria además se demuestra que las 3-acetilcumarinas-6-substituidas no son intermediarios en la ciclación conducente a cromeno[3,4-c]piridinas, ya que son inertes a la adición 1,4 de acetoacetato de etilo en las condiciones de reacción empleadas. Sin embargo, podrían ser intermediarios de reacción en la obtención de cromeno[4,3-b]piridinas. La caracterización electroquímica fue realizada en medio no acuoso (DMF/ hexafluorofosfato de tetrabutilamonio, 0.1 M TBAHFP), usando como electrodo de trabajo carbón vítreo (0.5 mm), electrodo de referencia Ag/AgCl y electrodo auxiliar un alambre de platino. La asignación de los picos de reducción se basó en un estudio comparativo con modelos en los cuales se puede asignar inequívocamente las señales redox. El anillo lactónico de las cromeno[3,4-c]piridinas se reduce a potenciales menos negativos que los de las respectivas cromeno[4,3-b]piridinas, lo cual puede ser explicado en base a la mayor tensión (y reactividad) que experimenta el ciclo lactónico de las cromeno[3,4-c]piridinas. Se demuestra también en esta Memoria que la conjugación entre el ciclo lactónico y el anillo bencénico substituido, es indispensable para la cuasi-reversibilidad de la señal de reducción del carbonilo lactónico. Una aplicación derivada de este estudio, nos permite diferenciar entre los regioisómeros [3,4-c] y [4,3-b] en forma simple, rápida y eficiente / The present Thesis presents a systematic study of the synthesis of 9-methoxy- and 9-nitro substituted chromenopyridines and chromenodihydropyridines, which were subsequently physical and electrochemically characterized. The synthesis strategies were divided into two groups: 1.- Strategies based on the condensation of the respective aldehydes with acetoacetic acid ethyl ester or alternatively condensation of the aldehyde with 3-ethyl aminocrotonate. 2.- Strategies based on Michael-type addition over 9-methoxy- and 9-nitro-coumarins previously synthesized. The actual operations for each of the proposed strategies were completed and carefully described. The products obtained in each reaction step were characterized by their melting points, 1H-RMN spectroscopy, 13C-RMN spectroscopy, and elemental analysis. This Thesis also shows that 3-substituted-6-acetilcumarins are not intermediates in the cyclization leading to chromene [3,4-c] pyridines as they are inert to the 1,4 addition of ethyl acetoacetate in the reaction conditions employed. However, they may be reaction intermediates in the obtaining of chromene [4,3-b] pyridines. The electrochemical characterization was carried out in non aqueous medium (DMF/ tetrabutylammonium hexafluorophosphate, 0.1 M TBAHFP) using a glassy carbon electrode as working electrode, Ag / AgCl reference electrode and a platinum wire counter electrode. The assignment of reduction peaks was based on a comparative study with models in which redox signals can be assigned unambiguously. The lactone ring of the chromene [3,4-c] pyridines is reduced at less negative potentials than the respective chromene [4,3-b] pyridines. This fact can be explained based on the higher tension (and therefore higher reactivity) experienced by the chromene [3,4-c] pyridines lactone ring. It is also demonstrated in this Thesis that the conjugation between the lactone and the substituted benzene ring is essential for the quasi-reversibility of the signal reduction of the carbonylic lactone. An application resulting from this study allows us to distinguish between regioisomers [3.4-c] and [4.3-b] with a simple, fast and efficient method

La presente memoria da cuenta de la síntesis, caracterización física y electroquímica de cuatro nuevos compuestos: 1-etoxicarbonil-2,4-dimetil-5-oxo-5H-cromeno[3,4- c]dihidropiridina; 1-etoxicarbonil-2,4-dimetil-5-oxo-5H-cromeno[3,4-c]piridina; 9- bromo-1-etoxicarbonil-2,4-dimetil-5-oxo-5H-cromeno[3,4-c]dihidropiridina y 9- bromo-1-etoxicarbonil-2,4-dimetil-5-oxo-5H-cromeno[3,4-c]piridina. Para la caracterización física de los compuestos se utilizó Espectroscopía 1 H RMN y 13C RMN, Espectroscopía IR, Análisis Elemental, determinación de punto de fusión. Para la caracterización electroquímica en medio aprótico (N,N-Dimetilformamida + 0,1 M tetrabutilamonio hexafluorofosfato) se empleó Voltamperometría de Pulso Diferencial (VPD), Voltamperometría Cíclica (VC) y Cronoamperometría (CA). Por VPD las dos dihidropiridinas sintetizadas exhibieron una señal anódica con un potencial de pico (Epa) de alrededor de 1 V en ambos casos. A potenciales negativos se observaron tres señales de reducción con potenciales de pico (Epc) de -1,304 V, -1,476 V y -2,344 V, respectivamente. En el caso del compuesto bromado éstos se desplazan notablemente hacia potenciales menos negativos respecto del producto no sustituido. Las cromeno-piridinas presentaron tres señales para la piridina no sustituida y cinco en el caso de la piridina bromada. En este último compuesto, las señales de reducción se desplazaron hacia potenciales menos catódicos. Los experimentos cronoamperométricos permitieron determinar el número de electrones correspondientes al primer pico de reducción de la cromeno-piridina no sustituida, obteniéndose un valor de 1-electrón. Para el primer y segundo pico, los electrones involucrados en la reducción de la cromeno-piridina bromada fueron 2-electrones y 1- electrón, respectivamente. 7 En conclusión, el bromo produjo un cambio significativo en los potenciales de reducción, esto es, el proceso de reducción resultó más fácil.

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Memoria para Optar al Título de Bioquímico / Los Análisis electroquímicos de nitrosos aril dihidropiridinas muestran que estos compuestos pueden modificar los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS). Los ROS son pro-oxidantes derivados del oxígeno que en concentraciones fisiológicas pueden estar involucrados en transducción de señales, que durante un estrés oxidativo se encuentran en exceso y pueden provocar daños a importantes funciones biológicas afectando la viabilidad celular. De hecho, el incremento en la producción de ROS ha sido implicado en muchos procesos fisiológicos y patológicos incluyendo envejecimiento y carcinogénesis. Dada la importancia de estas especies, tanto en procesos normales como patológicos, se estudió el potencial efecto antitumoral de estos nitrosocompuestos. Para ello, se evaluó el efecto de los nitrosoderivados sobre la viabilidad celular utilizando las líneas de células tumorales (RAW, U937, K562) y células mononucleares obtenidas desde sangre periféricas de donantes normales (PBMC), mediante ensayos con el reactivo 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2Htetrazolium (MTS). También se cuantificó el efecto sobre la generación de ROS en células tumorales y PBMC usando el marcador diclorodihidrofluoresceina diacetato (DCFH-DA). Además, debido a la importancia de la enzima COX-2 en el desarrollo de la tumorogénesis, se evaluó el efecto de los nitrosocompuestos sobre la actividad de esta enzima inducida in vitro por LPS. Finalmente, se midió el efecto sobre la actividad citotóxica de las células Natural Killer mediante el ensayo de liberación de 51Cr desde células blancos radiomarcadas, dado que las células NK representan una importante defensa del sistema inmune innato contra células tumorales. Nuestros resultados indicaron que los nitrosos aril dihidropiridinas generan un efecto citotóxico dosis dependiente sobre las células tumorales. Sorprendentemente las células PBMC muestran mayor resistencia al efecto de estos nitrosoderivados, lo cual, se refleja en los IC50 obtenidos de los análisis de viabilidad celular, donde los IC50 para células tumorales variaron entre 4-19 μM, en cambio, para células PBMC variaron entre 43-63 μM. Por otro lado, los resultados obtenidos de los experimentos de generación de ROS mostraron que los nitrosocompuestos aumentan los niveles de ROS en células K562, pero no en PBMC. También, se observó una inhibición de la expresión de COX-2 inducida por Lipopolisacárido (LPS) por efecto de los nitrosocompuestos. Además, la actividad de las células NK no varió por acción de estos compuestos en ninguna de las concentraciones analizadas. Estos resultados sugieren que los nitrosocompuestos presentan citotoxicidad principalmente sobre células tumorales la que podría estar mediada por generación de ROS. La inhibición de la expresión de COX-2 potenciaría esta actividad antitumoral. Además, al no afectar la actividad de las células NK mantienen activa la respuesta antitumoral inmunológica innata. Los resultados obtenidos permiten concluir que los nitrosocompuestos presentaron una importante actividad antineoplásica sin afectar de manera significativa la viabilidad de las células mononucleares ni la Actividad citotóxica de células Natural Killer (ACNK). Esto, asociado al efecto sobre COX-2, refuerza el potencial antitumoral de estos compuestos lo cual apoya estudios adicionales para dilucidar su mecanismo de acción / Electrochemical analisys of dihidropyridines show that these compounds can modify intracellular levels of reactive oxygen species (ROS). ROS are pro-oxidating derivatives of oxygen, which at physiological concentrations can be involved in signals transduction. However, during oxidative stress, high levels of ROS have additional unfavorable effects upon crucial biological function which can dramatically affect cellular viability. In fact, increase in the production of ROS has been implicated in many human disease processes, including aging and carcinogenesis. Thus, due to the importance of nitrosocompounds, both in normal and pathological processes, we decided to study the potential antitumoural effects of these derivatives. For this reason we studied the in vitro effects of nitroso aril dihidropyridines on the cellular viability of several tumour cells lines (RAW, U937, K562) and also in PBMC using the reagent 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4- sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) assay. Besides, the intracellular generation of ROS in the presence of nitrosocompounds in tumor cells and PBMC was measured with the fluoroprobe CM-H2 DCFDA (5-(and -6)-chloromethyl-2`,7`-dichlorodihydrofluorescein diacetate). Because COX-2 plays an important role in carcinogenesis and its expression is modulated by ROS we evaluated the effect of Nitrosocompounds on the in vitro Lipopolisacarid (LPS)-induced expression of COX-2. An important defense of the innate immune response against tumor cells is due to NK cell function. Thus, we measured the effect of Nitrosocompounds on the natural killer citotoxic activity of PBMC using the Cr51 release assay. Our findings indicate that the dihidropyridines derivatives produce a dose response citotoxic effect on tumour cells. Surprinsingly, PBMC showed to be more resistance to the effect of these nitrosoderivates. In fact the IC50 values for tumour cells viability varies between 4-19 μM while for PBMC the IC50 values ranged between 43-63 μM. This result correlates with ROS generation were nitrosocopounds significantly raised ROS levels in K562 cells, but not in PBMC. Moreover, nitrocompounds induced an important inhibition of LPS induced-COX-2 expression in RAW cells. On the other side, NK cell activity of PBMC was not modified by these composed. These findings suggest that the nitrosoderivatives exerted a citotoxic effect mainly on the tumour cell lines studied and that correlates with and increased ROS levels and an inhibition of COX-2 expresion. In conclusion these results indicates that nitrosoderivatives have a potential antitumour activity

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Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Las 1,4-dihidropiridinas (DHPs) usadas en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, son antagonistas de canales de calcio y además son agentes antioxidantes. Estos fármacos, son metabolizados a través del sistema oxidativo del citocromo P450 localizado principalmente en el retículo endoplásmico hepático. Muchos fármacos lipofílicos generan estrés oxidativo al ser metabolizados por este sistema celular. Por lo tanto, las propiedades antioxidantes de las DHPs, podrían prevenir el estrés oxidativo asociado con la biotransformación hepática de fármacos. En este trabajo, se probó la capacidad antioxidante de varias nitro-fenil-DHPs sintéticas. Estos compuestos (I al IV) inhibieron la lipoperoxidación microsómica, la activación oxidativa de la UDPGT y la oxidación de los tioles microsómicos; todos estos fenómenos inducidos por el sistema generador de radicales libres del oxígeno, Fe3+/ascorbato. Asimismo, estos compuestos inhibieron el consumo de oxígeno inducido por el sistema Cu2+/ascorbato en ausencia de microsomas. Además, el compuesto III (2,6 – dimetil - 3,5 – dialcoxicarbonil – etil – 4 - (p - nitrofenil) - 1,4 – dihidropiridina) y el compuesto V (2,6 – dimetil - 3,5 – dialcoxicarbonil – metil – 4 - (p - nitrofenil) – N – etil - 1,4 - dihidropiridina) inhibieron la lipoperoxidación microsómica inducida por Nitrofurantoína y naftaleno en presencia de NADPH. El estrés oxidativo inducido sobre el retículo endoplásmico, puede alterar la biotransformación de fármacos, modificando así, sus concentraciones plasmáticas y sus efectos terapéuticos. Así la administración de fármacos antioxidantes, como las DHPs, en forma conjunta con fármacos que son activados por biotransformación podría prevenir el estrés oxidativo inducido in situ / 1,4-Dihydropyridine (DHP) used in the treatment of cardiovascular diseases, are calcium channel antagonists and also antioxidant agents. These drugs are metabolized through cytochrome P450 oxidative system, majority localized in the hepatic endoplasmic reticulum. Several lipophilic drugs generate oxidative stress to be metabolized by this cellular system. Thus, DHP antioxidant properties could prevent the oxidative stress associated with hepatic biotransformation of drugs. In this work, the antioxidant capacity of several synthetic nitro-phenyl-DHPs was tested. These compounds (I–IV) inhibited the microsomal lipid peroxidation, UDPGT oxidative activation and microsomal thiols oxidation, all phenomena induced by Fe3+/ascorbate, a generator system of oxygen free radicals. As the same manner, these compounds inhibited the oxygen consumption induced by Cu2+/ascorbate in the absence of microsomes. Furthermore, compound III (2,6 - dimethyl - 4 - (4 - nitrophenyl) - 1,4 - dihydropyridin - 3,5 - ethyl - dicarboxylate) and compound V (N - ethyl - 2,6 - dimethyl - 4 - (4 - nitrophenyl) - 1,4 - dihydropyridin - 3,5 - methyl - dicarboxylate) inhibited the microsomal lipid peroxidation induced by Nitrofurantoin and naphthalene in the presence of NADPH. Oxidative stress induced on endoplasmic reticulum may alter the biotransformation of drugs, so, modifying their plasmatic concentrations and therapeutic effects. Therefore, oxidative stress by biotransformation may be prevented when drugs which are activated are administered together with antioxidant drugs, such as DHPs

En esta Memoria se estudió la reactividad de tres nuevas 1,4-dihidropiridinas (1,4-DHP) frente al anión radical superóxido (O2 .-), y se evaluó la influencia de los sustituyentes en posición 4 del anillo dihidropiridínico. Estas moléculas también se caracterizaron electroquímicamente mediante Voltamperometría de pulso diferencial (VPD), Voltamperometría cíclica (VC), electrólisis a potencial controlado (EPC) y Voltamperometría de barrido lineal con electrodo de disco rotatorio (DR). Los estudios electroquímicos demuestran que en medio acuoso las 1,4-dihidropiridinas son más fáciles de oxidar a pHs básicos, mostrando el siguiente orden en cuanto a la facilidad de oxidación: 4-HIDROXIFENIL-DHP (4-OH-DHP) > 3-HIDROXIFENIL-DHP (3-OH-DHP) > 4-FENIL-DHP (DHP). Este mismo orden se observó en medio no acuoso. La oxidación de las 1,4-DHPs en ambos medios correspondió a un proceso irreversible, en que la corriente fue controlada por difusión. La cinética de reacción fue seguida mediante espectroscopía UV-Visible con arreglo de diodos. Las constantes de formación del anión dihidropiridínico se calcularon usando un equipo de flujo retenido. El orden para la constante fue: NADH > 4-OH-DHP > 3-OH-DHP > DHP. Por otra parte, las constantes cinéticas para la reacción entre el anión radical superóxido y las DHPs fueron calculadas a través de cinética continua. Claramente, las DHPs que tienen un grupo hidroxifenilo en la posición 4 del anillo dihidropiridínico presentaron constantes cinéticas significativamente mayores que las 1,4-DHP comerciales estudiadas con el siguiente orden: 3-OH-DHP > 4-OHDHP > DHP > AMLODIPINO > NISOLDIPINO > NIMODIPINO. La reactividad entre el anión superóxido y las 1,4-DHPs ocurriría a través de un mecanismo que incluye en una primera etapa la rápida formación del anión dihidropiridínico, el que se forma como resultado de un equilibrio ácido-base entre anión radical superóxido que actúa como base de Brönsted, y la 1,4-dihidropiridina, posteriormente, el anión dihidropiridínico actuaría como reservorio para reponer la 1,4-dihidropiridina que se está oxidando a piridina en un proceso que duraría en total 6 horas aproximadamente.

En la presente memoria se reporta la caracterización electroquímica y la reactividad con radicales libres, alquilo y alquilperoxilo ABAP-derivados de tres nuevas 1,4 dihidropiridinas C4-substituidas (3,4,5-trihidroxifenil-DHP, 3,4- dihidroxifenil-DHP, 3,5-dihidroxifenil-DHP). La caracterización electroquímica fue realizada usando un electrodo de carbón vítreo en medio acuoso (Tampón 0.01 M Britton-Robinson) en todo el rango de pH (pH2-pH12). En la zona ácida (pH2-pH6) las 1,4-dihidropiridinas substituidas en la posición-4 con el grupo dihidroxifenil exhibieron dos señales anódicas bien definidas, las que corresponden a la oxidación de un grupo hidroxilo del anillo aromático y la segunda señal a la oxidación del anillo 1,4-dihidropiridina. En el caso del 3,4,5-trihidroxifenil-DHP se encontraron tres señales de oxidación, las que corresponden a la oxidación de dos grupos hidroxilo del anillo aromático y la tercera señal correspondería a la oxidación del anillo 1,4-dihidropiridina. A partir de los gráficos log ip versus log v se puede concluir que los procesos de oxidación son controlados por difusión (pendientes gráficos > 0.5). A pH >8, las señales de oxidación comienzan a perder resolución y la intensidad de corriente disminuye paulatinamente con el incremento de pH, en todos los compuestos. Estudios por voltamperometría cíclica a diferentes velocidades de barrido (0,1-10 V/seg) a pH3 demostraron que tanto para el compuesto 3,4,5-trihidroxifenil-DHP como para el 3,4-dihidroxifenil-DHP, la señal anódica registrada a valores de potencial menos positivos es de carácter cuasi-reversible. Sin embargo, para el compuesto 3,5-dihidroxifenil-DHP se encontró que en todo el rango de velocidades de barrido esta señal era de carácter irreversible. Finalmente, los tres compuestos mostraron una reactividad significativa con los radicales libres ensayados (alquilo y alquilperoxilo ABAP-derivados). 3,4,5- trihidroxifenil-DHP fue el derivado más potente, incluso exhibiendo un potencia 16.5 veces mayor que nisoldipino, una conocida 1,4-dihidropiridina comercial.

Memoria para optar al título de Químico / En el presente estudio se investigó mediante técnicas electroquímicas tres derivados 4-(m-nitrosofenil)-1,4-dihidropiridina (m-NO-DHP) en medio acuoso. Las m-NO-DHP estudiadas: 2,6-dimetil-3,5-dimetoxicarbonil-4-(meta-nitrosofenil)- 1,4-dihidropiridina (m-NO-Me), 2,6-dimetil-3,5-dietoxicarbonil-4-(meta-nitrosofenil)-1,4- dihidropiridina (m-NO-Et) y 2,6-dimetil-3,5-diisopropoxicarbonil-4-(meta-nitrosofenil)- 1,4-dihidropiridina (m-NO-iPr) presentaron un solo par redox de tipo difusivo bajo las condiciones empleadas, correspondiente a la educción cuasireversible del grupo nitroso a hidroxilamina mediante la transferencia de dos protones y dos electrones. Los tres compuestos exhibieron un comportamiento electroquímico muy similar. Mediante voltametría cíclica sobre electrodo de mercurio se calculó la constante de transferencia heterogénea para las tres m-NO-DHP empleando los datos de diferencia de potenciales de pico a distintas velocidades de barrido y el método descrito por Nicholson. Se fabricaron y caracterizaron microelectrodos de fibra de carbono para ser empleados como tipo en microscopía de barrido electroquímico (scanning electrochemical microscopy, SECM). Mediante SECM se calculó la constante de transferencia heterogénea y el coeficiente de transferencia para m-NO-Et y m-NO-iPr. La dependencia de la constante de transferencia heterogénea con el pH resultó ser similar en electrodo de mercurio y carbón vítreo, sin embargo, el valor de esta constante sobre electrodo de mercurio es dos órdenes de magnitud mayor. El mecanismo de reducción encontrado para las m-NO-DHP es EP-PE bajo pH 8,3 y EP-EP sobre este valor, siendo E la transferencia de un electrón y P la transferencia de un protón, con la segunda transferencia electrónica como etapa determinante de la velocidad