Este trabalho teve o objetivo de avaliar a capacidade da bactéria Enterococcus faecalis em induzir periodontite apical no modelo experimental canino; verificar se o preparo químico-mecânico afeta a sobrevivência dessa bactéria no sistema de canais radiculares e avaliar o reparo desses dentes por meio de radiografia periapical e tomografia computadorizada cone beam. Dentes com e sem tratamento endodôntico foram avaliados por meio de microscopia confocal de varredura a laser. Para tal, foram utilizados 2 cães. A bactéria Enterococcus faecalis foi inoculada nos canais de 4 pré-molares superiores, 11 prémolares inferiores e 9 incisivos superiores. As câmaras pulpares foram seladas e, após 60 dias, os canais das raízes distais dos pré-molares e de 7 incisivos superiores foram submetidos a tratamento endodôntico em sessão única e os canais das raízes mesiais dos pré-molares e 2 incisivos superiores foram deixados sem tratamento (controle). Amostras microbiológicas foram feitas antes e após o preparo químico-mecânico. O reparo foi avaliado após 6 meses do tratamento mediante radiografias periapicais e por tomografia computadorizada cone beam. A comparação entre as imagens obtidas após o período experimental pelos 2 métodos foi feita por medições da área em mm2 de cada lesão encontrada, utilizando o software ImageTool Os resultados mostraram que a presença de periodontite apical crônica foi verificada em todos os dentes inoculados, independentemente da colonização pela bactéria Enterococcus faecalis ou pela flora mista. O preparo químico-mecânico reduziu significativamente o número de bactérias no interior dos canais radiculares (p<0.05). Os resultados radiográficos e tomográficos demonstraram lesões de menor diâmetro nos dentes tratados endodonticamente em comparação ao grupo controle (p<0.05). A comparação entre os métodos demonstrou diferença estatística entre eles sendo evidenciada áreas radiolúcidas maiores utilizando a tomografia cone beam em comparação com a radiografia periapical (p<0.05). Concluiu-se que a bactéria Enterococcus faecalis induziu periodontite apical crônica similarmente à flora mista; o tratamento endodôntico reduziu o número de bactérias cultiváveis significativamente embora sem relação com o reparo radiográfico. Os dentes tratados em sessão única apresentavam lesões menores em comparação aos não-tratados e as áreas das lesões observadas na TC cone beam foram maiores do que as áreas encontradas nas radiografias periapicais. A microscopia confocal e o método proposto neste estudo se mostraram eficazes para determinar, qualitativamente, a viabilidade bacteriana e a distribuição de ácidos nucléicos bacterianos dentro dos túbulos dentinários. Houve diferença entre a dentina infectada in vitro com o padrão de infecção in vivo, caracterizada pela presença de biofilmes aderidos à parede do canal radicular. / The aims of this study were to evaluate the Enterococcus faecalis ability to induce apical periodontitis in dogs root canals, to verify the bacterias ability to survive to the cleaning and shaping procedures and to assess the healing of the induced apical periodontitis by periapical radiograph and cone beam computed tomography. Also, endodontically treated and non-treated teeth were evaluated by confocal laser scanning microscope. Two mongrel dogs were used in the experiment. Enterococcus faecalis strain was inoculated into the root canals of 4 maxillary premolars, 11 mandibular premolars and 9 maxillary incisors. After 60 days the root canals of the distal roots of the mandibular and maxillary pre-molars and 7 maxillary incisors were endodontically treated. The premolars mesial root canal and 2 maxillary incisors were used as control (no treatment). Microbiologic samples were done after and before the cleaning and shaping procedure. The healing was evaluated after 6 months by periapical radiographs and cone beam computed tomography. The comparison between obtained images after the experimental period by the two methods was done using measures of the lesion area in mm2 with ImageTool software. The results showed the presence of chronic apical periodontitis in every inoculated teeth, with Enterococcus faecalis or mixed infection. The cleaning and shaping procedures reduced the number of bacteria of the root canals (p<0.05). The radiographic and tomographic results showed the lower diameter lesion in endodontically treated teeth than in the control group (p<0.05). The comparison between the methods showed statistical difference and greater radiolucent areas were evident in cone beam computed tomography images (p<0.05). It is possible to conclude that the bacteria Enterococcus faecalis induced chronic apical periodontitis as well as the mixed microflora; the endodontic treatment reduced the number of cultivable bacteria in a significant way, but with no relation to the radiographic healing. The treated teeth in only one session presented smaller lesions in comparison to the non-treated teeth and the lesions area in cone beam computed tomography were bigger than the areas found in periapical radiograph. The confocal microscopy and the proposed method of this study showed to be efficient to determine the bacterial ability and the distribution of bacterial nucleic acids inside the dentin tubules. There was difference between in vitro infected dentin with the in vivo infection pattern, which presents biofilm attached to the root canal walls.

Protocolos complementares de desinfecção estão sendo investigados com o objetivo de promover uma maior redução de bactérias viáveis após o preparo químico-cirúrgico dos canais radiculares. Este estudo clínico randomizado comparou o efeito da ativação ultrassônica da pasta de hidróxido de cálcio com o da pasta não ativada na redução da atividade metabólica de bactérias nos canais radiculares. Vinte pacientes com necrose pulpar e periodontite apical assintomática foram alocados de forma randomizada em dois grupos de acordo com o protocolo de medicação intracanal: Grupo UA - ativação ultrassônica da pasta de hidróxido de cálcio (n=10) e Grupo NA - não ativação da pasta (n=10). Amostras microbiológicas dos canais radiculares foram coletadas após os procedimentos de: cirurgia de acesso (S1), preparo químico-cirúrgico (S2), irrigação ultrassônica passiva (PUI) (S3) e medicação intracanal entre sessões com pasta de hidróxido de cálcio, com ou sem ativação ultrassônica (S4). As amostras endodônticas foram submetidas à extração de DNA e RNA. O RNA foi submetido à reação de transcrição reversa para confecção de DNA complementar (cDNA). O efeito dos procedimentos endodônticos na redução bacteriana foi determinado por qPCR baseada em rDNA, utilizando iniciadores universais para a região 16S rRNA do domínio Bacteria. A atividade metabólica das bactérias foi calculada pela razão rRNA/rDNA baseados nos dados dos ensaios de qPCR. Bactérias foram consideradas metabolicamente ativas quando a razão era maior ou igual a 1. A análise intragrupo foi realizada pelos testes de Wilcoxon e Q de Cochran; enquanto a análise entre os grupos foi realizada pelos testes de Mann-Whitney e Exato de Fisher (P < 0,05). As amostras S1 apresentaram uma mediana de 2,38 x 106 e 1,60 x 105 cópias de rDNA nos grupos UA e NA, respectivamente. Após o preparo químico-cirúrgico houve uma redução significativa de rDNA bacteriano nos dois grupos (UA: 2,14 x 103; NA: 7,48 x 103; P < 0,01 para ambos). Porém, 80% e 90% dos casos permaneceram com bactérias metabolicamente ativas após o preparo químico-cirúrgico nos grupos UA e NA, respectivamente. A PUI contribuiu para a redução do número de canais com bactérias ativas nos dois grupos (UA: 60%; NA: 50%). No grupo UA, esse número caiu para 30% após o protocolo da medicação intracanal com ativação ultrassônica, com uma diferença significativa entre S1 e S4 (P < 0,05). Por outro lado, no grupo NA, 60% dos canais continham bactérias metabolicamente ativas. A análise entre os grupos revelou uma diferença significativa entre os protocolos de medicação intracanal quanto ao metabolismo bacteriano em S4 (P < 0,05). Concluiu-se que a ativação ultrassônica da pasta de hidróxido de cálcio foi mais efetiva do que a pasta não ativada em reduzir o metabolismo bacteriano. / Complementary disinfection protocols have been investigated with the objective of promoting a greater reduction of viable bacteria after the chemical-surgical preparation of the root canals. This randomized clinical study compared the effect of the ultrasonic activation of the calcium hydroxide paste with an nonactivated paste in reducing the metabolic activity of bacteria in the root canals. Twenty patients with pulp necrosis and asymptomatic apical periodontitis were randomized into two groups according to the intracanal medication protocol: UA group - ultrasonic activation of calcium hydroxide paste (n = 10) and NA group - no activated paste (n = 10). Microbiological samples of the root canals were collected following the procedures of: access (S1), chemical-surgical preparation (S2), passive ultrasonic irrigation (PUI) (S3) and intracanal medication with calcium hydroxide paste, with or without activation (S4). The endodontic samples were submitted to DNA and RNA extraction. RNA was subjected to the reverse transcription reaction to make complementary DNA (cDNA). The effect of endodontic procedures on bacterial reduction was determined by rDNA-based qPCR using universal primers for the 16S rRNA region of the Bacteria domain. The metabolic activity of the bacteria was calculated by the rRNA/rDNA ratio based on qPCR assay data. Bacteria were considered to be metabolically active when the ratio was positive (greater than or equal to 1). Intragroup analysis was performed by the Wilcoxon and Cochran`s Q testes; while the analysis between the groups was performed by the Mann-Whitney test and Fisher\'s exact test (P <0.05). Samples S1 presented a median of 2.38 x 106 and 1.60 x 105 copies of rDNA in the UA and NA groups, respectively. After the chemical-surgical preparation, there was a significant reduction of bacterial rDNA in both groups (UA: 2.14 x 103, NA: 7.48 x 103, P <0.01 for both). However, 80% and 90% of the cases remained with metabolically active bacteria after the chemical-surgical preparation in the UA and NA groups, respectively. PUI contributed to the reduction of the number of canals with active bacteria in both groups (UA: 60%, NA: 50%). In the UA group, this number dropped to 30%, with a significant difference between S1 and S4 (P <0.05). Analysis between the groups revealed a significant difference between intracanal medication protocols for bacterial metabolism in S4 (P <0.05). It was concluded that the ultrasonic activation of the calcium hydroxide paste was more effective than the nonactivated paste in reducing the bacterial metabolism.

O objetivo deste estudo foi avaliar a taxa de detecção, quantidade e atividade metabólica de Propionibacterium acnes, antes e após os procedimentos endodônticos de desinfecção, utilizando métodos moleculares baseados em rRNA e rDNA. Foram selecionados 22 pacientes com necrose pulpar e periodontite apical assintomática. Amostras microbiológicas foram coletadas dos canais radiculares após a cirurgia de acesso (S1), após o preparo químico-cirúrgico realizado com Sistema Reciproc e NaClO- 2,5% (S2) e após medicação intracanal com Ca(OH)2 por 14 dias (S3). As amostras dos canais radiculares foram submetidas à extração de DNA e RNA. O RNA foi submetido à reação de transcrição reversa (RT) para confecção de DNA complementar (cDNA). DNA e cDNA foram submetidos a reações de qPCR utilizando iniciadores complementares à sequência de 16S rRNA de P. acnes. O efeito dos procedimentos endodônticos na redução bacteriana foi determinado por qPCR baseada em rDNA. A atividade metabólica bacteriana foi calculada pela razão rRNA/rDNA baseados nos dados dos ensaios de qPCR. Os dados foram analisados pelo teste de Wilcoxon para análise entre as amostras e teste de McNemar para comparação da taxa de detecção dos métodos baseados em rDNA e rRNA, com nível de significância de 5%. A taxa de detecção de P. acnes nas amostras endodônticas foi maior pelo método baseado em rRNA do que pelo método baseado em rDNA (P < 0,0001). P. acnes foi detectado em 36,4% (8/22) e 90,9% (20/22) das amostras S1 utilizando qPCR baseado em rDNA e rRNA, respectivamente. Nas amostras S2, P. acnes foi detectado em 36,4% (8/22) das amostras utilizando o método baseado em rDNA e em 86,4% (19/22) pelo método baseado em rRNA. Nas amostras S3, P. acnes persistiu em níveis detectáveis em todas as amostras positivas em S2. Na análise quantitativa, o nível médio de P. acnes foi 1,28 x 103 cópias de rDNA nas amostras S1. Não houve uma alteração significante dos níveis bacterianos nas amostras S2 e S3 quando comparadas às amostras S1 (P > 0,05). O número de cópias de rRNA foi maior do que o de rDNA em todas as amostras (P < 0,0001). Em S1, o valor mediano da razão rRNA/rDNA foi 7,93 (intervalo de 2,03 a 2,04 x 102). Essa razão permaneceu positiva em S2 (mediana 16,40, intervalo de 2,21 a 4,87 x 102) e S3 (mediana 25,34, intervalo de 0,58 a 1,05 x 103), sem diferença estatística na comparação entre as amostras S1-S2 e S2-S3 (ambos P > 0,05). Baseados nesses achados, concluiu-se que o ensaio de qPCR baseado em rRNA revelou uma alta prevalência de P. acnes nas infecções endodônticas primárias e que este permaneceu metabolicamente ativo nos canais radiculares após o preparo químico-cirúrgico e medicação intracanal. / This study aimed to evaluate the detection rate, quantity and metabolic activity of Propionibacterium acnes before and after endodontic disinfection procedures using RNA- and DNA-based molecular methods. Twenty-two patients with pulp necrosis and asymptomatic apical periodontitis were selected. The microbiological samples were collected from the root canals after access cavity (S1), after the chemo-mechanical preparation performed with the Reciproc System and NaClO- 2.5% (S2) and after intracanal medication with Ca(OH)2 for 14 days (S3). The root canal samples were submitted to DNA and RNA extraction. Complementary DNA (cDNA) was synthetized using the reverse transcription reaction. cDNA and genomic DNA were subjected to qPCR with primers complementary for P. acnes 16S rRNA sequence. The effect of endodontic procedures on bacterial reduction was determined by rDNA-based qPCR. The bacterial metabolic activity was calculate by the rRNA / rDNA ratio based on qPCR assays. Data were analysed by the Wilcoxon test for analysis between samples and McNemar test for detection rate of RNA- and DNA-based molecular methods, with a significance level of 5%. The detection rate of P. acnes in endodontic samples was higher by the rRNA-based method than by the rDNA-based method (P < 0.0001). P. acnes was detected in 36.4% (8/22) e 90.9% (20/22) of the S1 samples using on rDNA- and rRNA- based qPCR, respectively. In S2 samples, P. acnes was detected in 36.4% (8/22) of the samples using the rDNA based method and 86.4% (19/22) by the rRNA based method. In S3 samples, detectable levels of P. acnes persisted in all S2-positive samples. Quantitative analysis of S1 samples revealed that the mean level of P. acnes was 1.28 x 103 rDNA copies per sample. There was no significant change in bacterial levels in S2 and S3 samples when compared to S1 samples (P> 0.05). The number of rRNA copies was greater than the rDNA ones in all samples (P < 0.0001). In S1, the median value of the rRNA / rDNA ratio was 7.93 (range: 2.03 - 2,04 x 102). This ratio remained positive in S2 samples (median 16.40, range: 2.21 - 4.87 x 102) and in S3 (median 25.34, range: 0.58 - 1.05 x 103), with no statistical difference in the comparisons between S1-S2 and S2-S3 samples (both P> 0.05). Based on these findings, it was concluded that the rRNA-based qPCR assay revealed a high prevalence of P. acnes in primary endodontic infections and that it remained metabolically active in the root canals after chemical-surgical preparation and intracanal medication.

Micro-organismos persistentes que permanecem viáveis e em níveis elevados nos canais radiculares após os procedimentos endodônticos podem influenciar no sucesso do tratamento endodôntico. O objetivo deste estudo foi avaliar a quantidade e a atividade metabólica de bactérias persistentes utilizando métodos moleculares baseados em rDNA e rRNA. Foram selecionados 15 pacientes com infecções endodônticas primárias assintomáticas. Amostras microbiológicas foram coletadas dos canais radiculares após a cirurgia de acesso (S1), após o preparo químico-cirúrgico realizado com Sistema Reciproc e NaOCl 2.5% (S2) e após medicação intracanal com Ca(OH)2 por 14 dias (S3). As amostras dos canais radiculares foram submetidas à extração de DNA e RNA. O RNA foi submetido à reação de transcrição reversa para confecção de DNA complementar (cDNA). O efeito dos procedimentos endodônticos na redução bacteriana foi determinado por qPCR baseada em rDNA, utilizando iniciadores universais para a região 16S rRNA do domínio Bacteria e iniciadores espécie-específicos para Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272. A atividade metabólica de bactérias totais e Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272 foi calculada pela razão rRNA/rDNA baseados nos dados dos ensaios de qPCR. Os dados foram analisados pelo teste de Wilcoxon para análise quantitativa e teste de McNemar para comparação da taxa de detecção dos métodos, com nível de significância de 5%. Todas as amostras S1 foram positivas para bactérias totais, com uma mediana de 1,87 x 105 cópias de rDNA por amostra. Após o preparo químico-cirúrgico houve uma redução significativa de rDNA de bactérias totais (mediana 7,86 x 104, P = 0,01). Entretanto, não houve redução de rDNA bacteriano após a medicação intracanal quando comparada à etapa anterior (mediana 7,97 x 104, P > 0,05). Os resultados da razão rRNA/rDNA revelaram que houve uma redução do metabolismo de bactérias totais em S2 (mediana 1, P = 0,04) e um aumento do metabolismo bacteriano em S3 (mediana 2, P = 0,04). Na análise de Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272, o tratamento endodôntico não influenciou na redução nem no metabolismo bacteriano. Concluiu-se que o número total de bactérias foi drasticamente reduzido após o preparo químico-cirúrgico, assim como seu metabolismo. Entretanto, o metabolismo bacteriano aumentou após o uso da medicação intracanal com Ca(OH)2. Bacteroidaceae [G-1] sp. oral taxon 272 permaneceu metabolicamente ativo após o preparo químico-cirúrgico e medicação intracanal, participando, assim, da composição da microbiota persistente. / High levels of microorganisms that persist viable in root canals after endodontic procedures may influence endodontic treatment outcome. This study aimed to evaluate the amount and the metabolic activity of persistent bacteria using rRNA- and rDNA-based molecular methods. Fifteen patients with primary endodontic infections were selected. Microbiological samples were taken from root canals after access cavity (S1), after chemomechanical preparation with Reciproc System and 2.5% NaOCl (S2) and after intracanal medication with calcium hydroxide for 14 days (S3). DNA and RNA were extracted from root canal samples, and cDNA was synthetized using reverse transcription reaction. The effect of endodontic procedures on bacterial reduction was determined by rDNA-based qPCR using universal primers for 16S rRNA Bacteria domain and species-specific primers to Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272. The metabolic activity of total bacteria and Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272 was calculated by rRNA/ rDNA ratio estimated by qPCR. The data was analyzed by the Wilcoxon test for quantitative analysis and McNemar test for comparison of the detection rate of the methods, with 5% significance level. All S1 samples were positive for total bacteria, with a median value of 1.87 x 105 bacterial cells. After chemomechanical preparation a significant reduction of bacterial rDNA was observed (median 7.86 x 104, P = 0.01). Nevertheless, there was no bacterial rDNA reduction after intracanal medication when compared to S2 samples (median 7.97 x 104, P > 0.05). The rRNA/ rDNA ratio showed a reduction of total bacteria metabolism in S2 (median 1, P = 0,04), and an increase of bacterial metabolism in S3 (median 2, P = 0,04). Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272 analysis showed that endodontic treatment did not impact the amount and the metabolic activity of this taxon. In conclusion, the number and metabolism of total bacteria were severely reduced after chemomechanical preparation. On the other hand, the bacterial metabolism increased after intracanal dressing with Ca(OH)2. Bacteroidaceae [G-1] sp. oral taxon 272 remained metabolically active after chemomechanical preparation and intracanal dressing thus participating in the composition of the persistent microbiota.

Como a clorexidina (CHX) tem sido recomendada como solução irrigadora de canais radiculares e como curativo de demora, o objetivo do presente estudo foi caracterizar in vivo a lesão induzida pela injeção de CHX a 0,125, 0,25, 0,5 e 1,0% na pata de camundongos em intervalos de tempo selecionados (24 e 48 horas e 7 e 14 dias) e in vitro o modo e a causa morte celular (necrose e/ou apoptose) e o estresse causado pela exposição de fibroblastos L929 em cultura a concentrações crescentes da droga (0,000125, 0,00025, 0,0005, 0,001, 0,002, 0,004, 0,008 e 0,016%) por 24 horas. A proliferação celular foi avaliada por meio da incorporação de metil-3H-timidina ao DNA das células e imunomarcação para PCNA. A ultraestrutura foi analisada em microscópio eletrônico de transmissão e de varredura e o citoesqueleto das células por meio de marcação para actina e &#945;-tubulina. Citometria de fluxo (Anexina-V FITC/iodeto de propídeo) foi empregada para diferenciar células necróticas de apoptóticas. Também, foi efetuada marcação para retículo endoplasmático, Bcl-2 (B-célula CLL/linfoma 2), Hsp70 (proteína de choque térmico 70) e Grp78 (glucose-regulated protein 78). Quando injetada no espaço subplantar da pata traseira de camundongos, a CHX induziu alterações necróticas na epiderme, derme e tecido subcutâneo em associação com uma resposta inflamatória reacional, particularmente nas concentrações mais elevadas. Em cultura de fibroblastos, a CHX induziu a diminuição da proliferação celular, causou morte celular por apoptose e necrose, desestruturação do citoesqueleto, alteração da morfologia celular, aumento da área das células, dilatação do retículo endoplasmático rugoso e acúmulo de proteínas nas cisternas. Além disso, a CHX causou aumento da expressão de Hsp70, de Grp78 (indicadores de estresse celular) e de Bcl-2 (proteína anti-apoptótica). Em conclusão, a CHX injetada no espaço subplantar da pata traseira de camundongos induz efeitos tóxicos severos. Além disso, a CHX adicionada em cultura de fibroblastos causou estresse do retículo endoplasmático como consequência do acúmulo de proteínas nas cisternas e induziu a morte celular por necrose e apoptose via estresse do retículo endoplasmático, além de causar estresse celular. Os resultados sugerem que a CHX poderia ter um efeito desfavorável na resolução de lesões periapicais em decorrência de sua ação tóxica sobre as células do tecido em torno do ápice dentário. / Because chlorhexidine (CHX) has been recommended as either endodontic irrigant or root canal dressing, this study aimed to characterize in vivo the lesion induced by injection of CHX at concentrations of 0.125, 0.25, 0.5 and 1.0% in the paw of mice at selected time intervals (24 and 48 hours and 7 and 14 days) and in vitro the mode and the cause of cell death (necrosis and /or apoptosis), and the cellular stress caused by exposition of cultured L929 fibroblasts to ascending concentrations of the drug ( 0.000125, 0.00025, 0.0005, 0.001, 0.002, 0.004, 0.008 and 0.016%) for 24 hours. The cell proliferation assay was performed by measuring incorporation of metil-3H-thymidine to cell DNA and immunocytochemical staining analysis of PCNA. The cell ultrastructure was analyzed in transmission and scanning electron microscopes and the cell cytoskeleton by florescence analysis of actin and &#945;- tubulin. Apoptosis and necrosis were discriminated by flow cytometry with annexin V-FITC and PI. In addition endoplasmic reticulum, Bcl-2 (B-cell CLL/lymphoma 2), Hsp70 (heat shock protein 70) and Grp78 (glucoseregulated protein 78) were detected by fluorescence. CHX injected in the sub plantar space of the hind paw of mice induced necrotic changes in the epidermis, dermis and subcutaneous tissue in association with reactive inflammatory response, particularly at higher concentrations. In cultured fibroblasts, CHX decreased cellular proliferation, caused cell death by apoptosis and necrosis, disruption of the cytoskeleton, morphological cellular alterations, increased cells size (area), rough endoplasmic reticulum dilatation with accumulation of cysternal protein. In addition, CHX induced increased expression of Hsp 70, Grp78 (indicators of cellular stress) and Bcl-2 (anti-apoptotic protein). It was concluded that CHX injected in the sub plantar space of the hind paw of mice could induce severe toxic effect. In addition CHX caused endoplasmic reticulum stress as a consequence of accumulation of proteins in the endoplasmic reticulum cysterns and induced cell death by apoptosis and necrosis via endoplasmic reticulum stress and caused cellular stress. Taken together, these findings suggest that CHX may have an unfavorable effect on the resolution of apical periodontitis, due a toxic effect on the periapical tissue cells.

Como a clorexidina (CHX) tem sido recomendada como solução irrigadora de canais radiculares e como curativo de demora, o objetivo do presente estudo foi caracterizar in vivo a lesão induzida pela injeção de CHX a 0,125, 0,25, 0,5 e 1,0% na pata de camundongos em intervalos de tempo selecionados (24 e 48 horas e 7 e 14 dias) e in vitro o modo e a causa morte celular (necrose e/ou apoptose) e o estresse causado pela exposição de fibroblastos L929 em cultura a concentrações crescentes da droga (0,000125, 0,00025, 0,0005, 0,001, 0,002, 0,004, 0,008 e 0,016%) por 24 horas. A proliferação celular foi avaliada por meio da incorporação de metil-3H-timidina ao DNA das células e imunomarcação para PCNA. A ultraestrutura foi analisada em microscópio eletrônico de transmissão e de varredura e o citoesqueleto das células por meio de marcação para actina e &#945;-tubulina. Citometria de fluxo (Anexina-V FITC/iodeto de propídeo) foi empregada para diferenciar células necróticas de apoptóticas. Também, foi efetuada marcação para retículo endoplasmático, Bcl-2 (B-célula CLL/linfoma 2), Hsp70 (proteína de choque térmico 70) e Grp78 (glucose-regulated protein 78). Quando injetada no espaço subplantar da pata traseira de camundongos, a CHX induziu alterações necróticas na epiderme, derme e tecido subcutâneo em associação com uma resposta inflamatória reacional, particularmente nas concentrações mais elevadas. Em cultura de fibroblastos, a CHX induziu a diminuição da proliferação celular, causou morte celular por apoptose e necrose, desestruturação do citoesqueleto, alteração da morfologia celular, aumento da área das células, dilatação do retículo endoplasmático rugoso e acúmulo de proteínas nas cisternas. Além disso, a CHX causou aumento da expressão de Hsp70, de Grp78 (indicadores de estresse celular) e de Bcl-2 (proteína anti-apoptótica). Em conclusão, a CHX injetada no espaço subplantar da pata traseira de camundongos induz efeitos tóxicos severos. Além disso, a CHX adicionada em cultura de fibroblastos causou estresse do retículo endoplasmático como consequência do acúmulo de proteínas nas cisternas e induziu a morte celular por necrose e apoptose via estresse do retículo endoplasmático, além de causar estresse celular. Os resultados sugerem que a CHX poderia ter um efeito desfavorável na resolução de lesões periapicais em decorrência de sua ação tóxica sobre as células do tecido em torno do ápice dentário. / Because chlorhexidine (CHX) has been recommended as either endodontic irrigant or root canal dressing, this study aimed to characterize in vivo the lesion induced by injection of CHX at concentrations of 0.125, 0.25, 0.5 and 1.0% in the paw of mice at selected time intervals (24 and 48 hours and 7 and 14 days) and in vitro the mode and the cause of cell death (necrosis and /or apoptosis), and the cellular stress caused by exposition of cultured L929 fibroblasts to ascending concentrations of the drug ( 0.000125, 0.00025, 0.0005, 0.001, 0.002, 0.004, 0.008 and 0.016%) for 24 hours. The cell proliferation assay was performed by measuring incorporation of metil-3H-thymidine to cell DNA and immunocytochemical staining analysis of PCNA. The cell ultrastructure was analyzed in transmission and scanning electron microscopes and the cell cytoskeleton by florescence analysis of actin and &#945;- tubulin. Apoptosis and necrosis were discriminated by flow cytometry with annexin V-FITC and PI. In addition endoplasmic reticulum, Bcl-2 (B-cell CLL/lymphoma 2), Hsp70 (heat shock protein 70) and Grp78 (glucoseregulated protein 78) were detected by fluorescence. CHX injected in the sub plantar space of the hind paw of mice induced necrotic changes in the epidermis, dermis and subcutaneous tissue in association with reactive inflammatory response, particularly at higher concentrations. In cultured fibroblasts, CHX decreased cellular proliferation, caused cell death by apoptosis and necrosis, disruption of the cytoskeleton, morphological cellular alterations, increased cells size (area), rough endoplasmic reticulum dilatation with accumulation of cysternal protein. In addition, CHX induced increased expression of Hsp 70, Grp78 (indicators of cellular stress) and Bcl-2 (anti-apoptotic protein). It was concluded that CHX injected in the sub plantar space of the hind paw of mice could induce severe toxic effect. In addition CHX caused endoplasmic reticulum stress as a consequence of accumulation of proteins in the endoplasmic reticulum cysterns and induced cell death by apoptosis and necrosis via endoplasmic reticulum stress and caused cellular stress. Taken together, these findings suggest that CHX may have an unfavorable effect on the resolution of apical periodontitis, due a toxic effect on the periapical tissue cells.

Micro-organismos persistentes que permanecem viáveis e em níveis elevados nos canais radiculares após os procedimentos endodônticos podem influenciar no sucesso do tratamento endodôntico. O objetivo deste estudo foi avaliar a quantidade e a atividade metabólica de bactérias persistentes utilizando métodos moleculares baseados em rDNA e rRNA. Foram selecionados 15 pacientes com infecções endodônticas primárias assintomáticas. Amostras microbiológicas foram coletadas dos canais radiculares após a cirurgia de acesso (S1), após o preparo químico-cirúrgico realizado com Sistema Reciproc e NaOCl 2.5% (S2) e após medicação intracanal com Ca(OH)2 por 14 dias (S3). As amostras dos canais radiculares foram submetidas à extração de DNA e RNA. O RNA foi submetido à reação de transcrição reversa para confecção de DNA complementar (cDNA). O efeito dos procedimentos endodônticos na redução bacteriana foi determinado por qPCR baseada em rDNA, utilizando iniciadores universais para a região 16S rRNA do domínio Bacteria e iniciadores espécie-específicos para Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272. A atividade metabólica de bactérias totais e Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272 foi calculada pela razão rRNA/rDNA baseados nos dados dos ensaios de qPCR. Os dados foram analisados pelo teste de Wilcoxon para análise quantitativa e teste de McNemar para comparação da taxa de detecção dos métodos, com nível de significância de 5%. Todas as amostras S1 foram positivas para bactérias totais, com uma mediana de 1,87 x 105 cópias de rDNA por amostra. Após o preparo químico-cirúrgico houve uma redução significativa de rDNA de bactérias totais (mediana 7,86 x 104, P = 0,01). Entretanto, não houve redução de rDNA bacteriano após a medicação intracanal quando comparada à etapa anterior (mediana 7,97 x 104, P > 0,05). Os resultados da razão rRNA/rDNA revelaram que houve uma redução do metabolismo de bactérias totais em S2 (mediana 1, P = 0,04) e um aumento do metabolismo bacteriano em S3 (mediana 2, P = 0,04). Na análise de Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272, o tratamento endodôntico não influenciou na redução nem no metabolismo bacteriano. Concluiu-se que o número total de bactérias foi drasticamente reduzido após o preparo químico-cirúrgico, assim como seu metabolismo. Entretanto, o metabolismo bacteriano aumentou após o uso da medicação intracanal com Ca(OH)2. Bacteroidaceae [G-1] sp. oral taxon 272 permaneceu metabolicamente ativo após o preparo químico-cirúrgico e medicação intracanal, participando, assim, da composição da microbiota persistente. / High levels of microorganisms that persist viable in root canals after endodontic procedures may influence endodontic treatment outcome. This study aimed to evaluate the amount and the metabolic activity of persistent bacteria using rRNA- and rDNA-based molecular methods. Fifteen patients with primary endodontic infections were selected. Microbiological samples were taken from root canals after access cavity (S1), after chemomechanical preparation with Reciproc System and 2.5% NaOCl (S2) and after intracanal medication with calcium hydroxide for 14 days (S3). DNA and RNA were extracted from root canal samples, and cDNA was synthetized using reverse transcription reaction. The effect of endodontic procedures on bacterial reduction was determined by rDNA-based qPCR using universal primers for 16S rRNA Bacteria domain and species-specific primers to Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272. The metabolic activity of total bacteria and Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272 was calculated by rRNA/ rDNA ratio estimated by qPCR. The data was analyzed by the Wilcoxon test for quantitative analysis and McNemar test for comparison of the detection rate of the methods, with 5% significance level. All S1 samples were positive for total bacteria, with a median value of 1.87 x 105 bacterial cells. After chemomechanical preparation a significant reduction of bacterial rDNA was observed (median 7.86 x 104, P = 0.01). Nevertheless, there was no bacterial rDNA reduction after intracanal medication when compared to S2 samples (median 7.97 x 104, P > 0.05). The rRNA/ rDNA ratio showed a reduction of total bacteria metabolism in S2 (median 1, P = 0,04), and an increase of bacterial metabolism in S3 (median 2, P = 0,04). Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272 analysis showed that endodontic treatment did not impact the amount and the metabolic activity of this taxon. In conclusion, the number and metabolism of total bacteria were severely reduced after chemomechanical preparation. On the other hand, the bacterial metabolism increased after intracanal dressing with Ca(OH)2. Bacteroidaceae [G-1] sp. oral taxon 272 remained metabolically active after chemomechanical preparation and intracanal dressing thus participating in the composition of the persistent microbiota.

Este trabalho teve o objetivo de avaliar a capacidade da bactéria Enterococcus faecalis em induzir periodontite apical no modelo experimental canino; verificar se o preparo químico-mecânico afeta a sobrevivência dessa bactéria no sistema de canais radiculares e avaliar o reparo desses dentes por meio de radiografia periapical e tomografia computadorizada cone beam. Dentes com e sem tratamento endodôntico foram avaliados por meio de microscopia confocal de varredura a laser. Para tal, foram utilizados 2 cães. A bactéria Enterococcus faecalis foi inoculada nos canais de 4 pré-molares superiores, 11 prémolares inferiores e 9 incisivos superiores. As câmaras pulpares foram seladas e, após 60 dias, os canais das raízes distais dos pré-molares e de 7 incisivos superiores foram submetidos a tratamento endodôntico em sessão única e os canais das raízes mesiais dos pré-molares e 2 incisivos superiores foram deixados sem tratamento (controle). Amostras microbiológicas foram feitas antes e após o preparo químico-mecânico. O reparo foi avaliado após 6 meses do tratamento mediante radiografias periapicais e por tomografia computadorizada cone beam. A comparação entre as imagens obtidas após o período experimental pelos 2 métodos foi feita por medições da área em mm2 de cada lesão encontrada, utilizando o software ImageTool Os resultados mostraram que a presença de periodontite apical crônica foi verificada em todos os dentes inoculados, independentemente da colonização pela bactéria Enterococcus faecalis ou pela flora mista. O preparo químico-mecânico reduziu significativamente o número de bactérias no interior dos canais radiculares (p<0.05). Os resultados radiográficos e tomográficos demonstraram lesões de menor diâmetro nos dentes tratados endodonticamente em comparação ao grupo controle (p<0.05). A comparação entre os métodos demonstrou diferença estatística entre eles sendo evidenciada áreas radiolúcidas maiores utilizando a tomografia cone beam em comparação com a radiografia periapical (p<0.05). Concluiu-se que a bactéria Enterococcus faecalis induziu periodontite apical crônica similarmente à flora mista; o tratamento endodôntico reduziu o número de bactérias cultiváveis significativamente embora sem relação com o reparo radiográfico. Os dentes tratados em sessão única apresentavam lesões menores em comparação aos não-tratados e as áreas das lesões observadas na TC cone beam foram maiores do que as áreas encontradas nas radiografias periapicais. A microscopia confocal e o método proposto neste estudo se mostraram eficazes para determinar, qualitativamente, a viabilidade bacteriana e a distribuição de ácidos nucléicos bacterianos dentro dos túbulos dentinários. Houve diferença entre a dentina infectada in vitro com o padrão de infecção in vivo, caracterizada pela presença de biofilmes aderidos à parede do canal radicular. / The aims of this study were to evaluate the Enterococcus faecalis ability to induce apical periodontitis in dogs root canals, to verify the bacterias ability to survive to the cleaning and shaping procedures and to assess the healing of the induced apical periodontitis by periapical radiograph and cone beam computed tomography. Also, endodontically treated and non-treated teeth were evaluated by confocal laser scanning microscope. Two mongrel dogs were used in the experiment. Enterococcus faecalis strain was inoculated into the root canals of 4 maxillary premolars, 11 mandibular premolars and 9 maxillary incisors. After 60 days the root canals of the distal roots of the mandibular and maxillary pre-molars and 7 maxillary incisors were endodontically treated. The premolars mesial root canal and 2 maxillary incisors were used as control (no treatment). Microbiologic samples were done after and before the cleaning and shaping procedure. The healing was evaluated after 6 months by periapical radiographs and cone beam computed tomography. The comparison between obtained images after the experimental period by the two methods was done using measures of the lesion area in mm2 with ImageTool software. The results showed the presence of chronic apical periodontitis in every inoculated teeth, with Enterococcus faecalis or mixed infection. The cleaning and shaping procedures reduced the number of bacteria of the root canals (p<0.05). The radiographic and tomographic results showed the lower diameter lesion in endodontically treated teeth than in the control group (p<0.05). The comparison between the methods showed statistical difference and greater radiolucent areas were evident in cone beam computed tomography images (p<0.05). It is possible to conclude that the bacteria Enterococcus faecalis induced chronic apical periodontitis as well as the mixed microflora; the endodontic treatment reduced the number of cultivable bacteria in a significant way, but with no relation to the radiographic healing. The treated teeth in only one session presented smaller lesions in comparison to the non-treated teeth and the lesions area in cone beam computed tomography were bigger than the areas found in periapical radiograph. The confocal microscopy and the proposed method of this study showed to be efficient to determine the bacterial ability and the distribution of bacterial nucleic acids inside the dentin tubules. There was difference between in vitro infected dentin with the in vivo infection pattern, which presents biofilm attached to the root canal walls.

A lesão periapical é uma doença causada por micro-organismos presentes no sistema de canais radiculares, assim como por seus produtos e subprodutos e pelas reações desencadeadas no organismo. A base para a obtenção do sucesso pós-tratamento endodôntico é o controle da infecção. Com essa finalidade, novos sistemas de irrigação dos canais radiculares têm sido desenvolvidos, no qual a irrigação por Pressão Apical Negativa (EndoVac®) tem se destacado. O objetivo desse estudo in vivo foi efetuar uma avaliação histopatológica, histoenzimológica e histomicrobiológica, comparando o sistema EndoVac® com a irrigação convencional, em dentes de cães com rizogênese incompleta e lesão periapical crônica induzida experimentalmente. Um total de 52 canais radiculares de pré-molares com rizogênese incompleta foram aleatoriamente divididos em 4 grupos: Grupo I - Irrigação com EndoVac® (n=15); Grupo II - Irrigação Convencional (n=17); Grupo III - Dente hígido (controle negativo) (n=10) e Grupo IV - Dente com lesão e sem tratamento (controle positivo) (n=10). Após indução de lesões periapicais nos dentes dos Grupos I, II e IV, os dentes dos grupos I e II foram instrumentados com limas manuais, empregando o EndoVac® e a irrigação convencional, respectivamente. Decorridos 90 dias, os animais foram eutanasiados e os espécimes submetidos ao processamento histotécnico para a análise histopatológica morfológica e morfométrica em cortes corados com HE, sob microscopia convencional e de fluorescência. Foi realizada também a histoenzimologia para a Fosfatase Ácida Resistente ao Tartarato (TRAP), para a marcação de osteoclastos, e a coloração de Brown e Brenn, para avaliar a presença de bactérias, sua localização e concentração/intensidade. Os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística por meio dos testes de qui-quadrado, Fisher, Anova e pós-teste de Tukey. O nível de significância adotado foi de 5%. Os resultados obtidos na avaliação dos parâmetros histopatológicos evidenciaram diferença significante entre os Grupos I e II (p<0,05), observando-se no Grupo I predomínio de infiltrado inflamatório de menor magnitude, menor espessura do ligamento periodontal e menor reabsorção dos tecidos mineralizados. Embora não tenha sido verificada diferença significante entre esses grupos com relação à extensão das lesões periapicais em microscopia de fluorescência, e com relação à presença, localização e intensidade da contaminação bacteriana, foi observado menor número de osteoclastos no Grupo I (p<0,05). Os resultados do presente estudo in vivo permitiram concluir que a irrigação por pressão apical negativa (EndoVac®) apresentou melhores resultados biológicos, quando comparada à irrigação convencional, favorecendo a ocorrência do processo de reparo, em dentes com rizogênese incompleta e lesão periapical. / The apical periodontitis is a disease caused by microorganisms from the root canal system, as well as their products, by-products and the reactions triggered in the host. The postendodontic treatment success is based in the control of the infection. For this purpose, new irrigation systems of root canals have been developed, in which apical Negative Pressure (EndoVac®) have been highlighted. The objective of this in vivo study was to perform a histopathological, histoenzymology and histomicrobiologic evaluation, comparing the EndoVac® system with the conventional irrigation, in immature teeth of dogs with apical periodontitis experimentally induced. A total of 52 root canals of immature pre-molars were randomly assigned into 4 groups: Group I - EndoVac® Irrigation (n= 15); Group II - Conventional Irrigation (n= 17); Group III - Sound Tooth (negative control) (n= 10) and Group IV - Tooth with apical periodontitis without treatment (positive control) (n= 10). After induction of apical periodontitis in teeth of the Groups I, II and IV, in the groups I and II, the teeth were instrumented with manuals files, using EndoVac® and conventional irrigation, respectively. After 90 days, the animals were euthanized and the specimens subjected to histotechnic for histopathological, morphologic and morphometric analysis in HE-stained sections, under conventional and fluorescence microscopy. The histoenzymology for the phosphatase-Resistant Acid tartrate (TRAP), for the identification of osteoclasts, and the Brown and Brenn staining method to assess the presence of bacteria, their location and concentration/intensity were also performed. The results obtained were subjected to statistical analysis using the chi-square test, Fisher exact test, ANOVA and Tukey post-test. The level of significance was set at 5%. The results obtained in the evaluation of histopathological parameters demonstrated a significant difference between groups I and II (p< 0.05). In the Group I, the predominance was inflammatory infiltrate of low magnitude, small thickness of the periodontal ligament and less resorption of mineralized tissues. Although the periapical lesions extension in fluorescence microscopy, and the presence, location, and intensity of bacterial contamination was not significant different between these groups, a lower number of osteoclasts in Group I (p< 0.05) was observed. The results of this in vivo study allowed us to conclude that the irrigation with EndoVac® presents best biological results in relation to conventional irrigation, favored the occurrence of the repair process, in immature teeth with apical periodontitis.

Abstract Microbial infection in dental root canal induces an inflammatory reaction called apical periodontitis. In post-treament disease, Enterococcus faecalis is the most commonly found organism, which may survive well in root canal despite calcium hydroxide paste medication. In these cases, effective irrigation or repeated chlorhexidine medication are recommended. New medications with long-lasting antimicrobial activity are needed for the treatment of persistent root canal infections. 2-hydroxyisocaproic acid (HICA) is a protein fermentation product of lactobacilli and few other bacterial or fungal species express enzymes required for its metabolism. However, mammalian cells can metabolise it and use it for protein production. It is known to be well-tolerated by humans and have anti-inflammatory properties as well. Therefore, the hypothesis was that it affects microbe-specific metabolic pathways and have potential as a novel antimicrobial agent. The aim of this study was to evaluate the antibacterial and antifungal spectrum of HICA using in vitro microdilution methods for susceptibility testing and an ex vivo extracted tooth root canal infection-model. The impact of dentine on the antimicrobial activity of HICA was also evaluated. The results showed that HICA has broad-spectrum bactericidal activity for gram-positive and gram-negative organisms. It is also fungicidal for several fungal species and it is only marginally inactivated by clinically-relevant concentrations of dentine. It is at least as active against E. faecalis as presently-used interappointment medications in infected root canals after a seven-day incubation ex vivo. Since HICA has a broad-spectrum and long-term antimicrobial activity as well as an anti-inflammatory effect, it may be a useful new agent for clinical endodontology. However, controlled clinical studies are needed for evaluation of the efficacy of HICA in clinical conditions. / Tiivistelmä Hampaan juurikanavan mikrobi-infektio aiheuttaa apikaalisen parodontiitin eli tulehdusreaktion juuren kärjen läheisyydessä oleviin kudoksiin. Silloin, kun infektio ei parane hoidon jälkeen, Enterococcus faecalis on yleisin löydös. Jos kalsiumhydroksidilääkitys ei ole tehokas, hoitoon suositellaan huolellista desinfektiohuuhtelua ja uusittavaa lyhytkestoista klooriheksidiinilääkitystä. Juurikanavainfektioiden hoitoon tarvitaan uusia antimikrobiaineita, joilla on pitkäaikainen vaikutus. Lactobacillus-bakteerit tuottavat proteiiniaineenvaihdunnassa 2-hydroksi-isokapronihappoa eli HICAa, jonka metaboloimiseen tarvittavia entsyymejä tunnetaan vain muutamilla muilla bakteereilla. Ihmissolut metaboloivat ja käyttävät sitä proteiinituotantoon. Se on hyvin siedetty aine ja se lieventää tulehdusreaktiota. Tutkimuksen hypoteesina oli, että HICA vaikuttaa mikrobien aineenvaihduntaan ja se voisi olla mahdollinen uusi antimikrobiaine. Tässä tutkimuksessa HICAn antimikrobitehoa tutkittiin bakteereita ja sienilajeja vastaan pienerälaimennusmenetelmällä tehdyissä herkkyystesteissä. Sen soveltuvuutta hampaiden juurikanavainfektioiden hoitoon arvioitiin dentiinin läsnäollessa sekä potilailta poistetuissa ja kokeellisesti infektoiduissa hampaissa. Tulokset osoittavat, että HICA tappaa laajakirjoisesti gram-positiivisia ja gram-negatiivisia bakteereita sekä hiivoja ja muita sienilajeja. Dentiinin vaikutus HICAn antimikrobitehoon on vähäinen. Sen vaikutus E. faecalista vastaan poistettujen hampaiden juurikanavissa on viikon jälkeen yhtä hyvä tai parempi kuin nykyisten lääkeaineiden vaikutus. Laajakirjoisen, pitkäkestoisen antimikrobitehon ja anti-inflammatorisuuden vuoksi HICA voisi olla uusi vaihtoehto juurikanavainfektioiden hoitoon. HICAn kliinisen tehokkuuden arviointiin tarvitaan kontrolloituja kliinisiä tutkimuksia.