Les Apicomplexes constituent une vaste famille de parasites protozoaires responsables de nombreuses maladies chez l’Homme et chez les animaux. C’est le cas de Toxoplasma gondii, agent de la toxoplasmose et de Cryptosporidium parvum, responsable de la cryptosporidiose. Ces pathogènes représentent un réel problème de santé publique et vétérinaire. A l’heure actuelle, les seuls moyens de lutte contre ces parasites demeurent la chimiothérapie car il n’existe aucune stratégie prophylactique efficace. L’identification de cibles vaccinales repose sur le décryptage des mécanismes de défense mis en jeux vis-à-vis de ces agents infectieux. Dans le cadre de cette thèse, nos recherches se sont tournées vers l’étude du bras inné de la réponse immunitaire et plus particulièrement vers les voies de signalisation intracellulaires conséquentes de la reconnaissance de ces parasites. / No summary available

Les modifications d'histones chez T. gondii représentent un des mécanismes majeurs pour contrôler la transcription des gènes et l'acétylation de certaines histones est impliquée dans le phénomène de différenciation parasitaire qu'est l'interconversion. Nous avons utilisé un inhibiteur d'histones déacétylases, FR235222, comme outil afin de clarifier l'implication de l'acétylation des histones chez T. gondii. Le séquençage d'un mutant résistant à la FR235222 a permis d'identifier TgHDAC3 comme cible préférentielle de cet iHDAC. Le domaine d'interaction est spécifique de la famille des Apicomplexa ce qui explique la sélectivité de cette molécule pour T. gondii et d'autres Apicomplexes dont Plasmodium sp. Sur tachyzoïtes traités, FR235222 augmente le taux d'acétylation des histones de certains gènes dont 1/3 est spécifique des stades sporozoïtes ou bradyzoïtes avec une surexpression de ces gènes après traitement par FR235222. L'activité antiparasitaire de différents iHDAC a été testée parallèlement sur les deux stades importants en pathologie humaine: le tachyzoïte et le kyste. Sur le tachyzoïte, seuls les tétrapeptides cycliques présentent une forte activité antiparasitaire avec des EC50 d'environ 10 nM. Les kystes ex-vivo traités avec FR235222, sont non infectants: absence de toxoplasmose chez la souris ré-inoculée avec ces kystes. En conclusion, FR235222 présente une activité dirigée contre l'HDAC3 de T. gondii et une spécificité envers les Apicomplexes. En interférant avec le cycle naturel du parasite, cette molécule induit la mort des tachyzoïtes in vitro et supprime le pouvoir infectant des kystes in vivo. Ce travail ouvre une voie prometteuse dans la stratégie thérapeutique des pathologies à Apicomplexes.

Les parasites du genre Eimeria sont des parasites apicomplexes provoquant des maladies graves, appelées coccidioses. Ce genre compte sept espèces qui envahissent spécifiquement les cellules épithéliales des intestins de poulet. L’espèce de choix étudiée dans notre laboratoire est Eimeria tenella. La prophylaxie repose sur les vaccins qui sont onéreux et les traitements anticoccidiens, qui sont administrés dans l’alimentation dès l’éclosion du poussin. Depuis 50 ans, l’utilisation massive de ces molécules s’accompagne de l’émergence de populations parasitaires résistantes. Les modes d’action des cibles parasitaires des anticcocidiens étant peu connus, il est difficile de mettre en place une stratégie de contournement de la résistance. Dans l’optique de répondre aux besoins des éleveurs, une collaboration entre le laboratoire de chimie organique et celui de parasitologie a été mise en place en utilisant la capacité de composés chimiques à inhiber l’invasion ou le développement des parasites. Notre stratégie repose sur la syntèse, le développement ainsi que l’évaluation de l’efficacité des composés pouvant potentiellement être utilisés en tant qu’inhibiteurs de la coccidiose aviaire. Un criblage de composés nous a permis d’identifier deux composés « chefs de files », inhibant le processus d’invasion et de développement des parasites au sein de la cellule hôte. Les pharmacomodulations entreprises ont engendrés la découverte de composés plus actifs avec des valeurs d’IC50 égales à 0,8 et 3,4 µM respectivement. / Intracellular developing parasites that belong to the apicomplexan phylum represent a great threat to both animal and human being health. Apicomplexan contains a genus of parasites called Eimeria. This genus is composed of seven species which cause avian coccidiosis such as E. tenella, the most virulent agent. Control of E. tenella is presently accomplished by a prophylaxis that uses vaccines and anticoccidial drugs. However, the rapid emergence of drug resisitant parasites coupled with the expense of most vaccines has led us to a search of new approaches to control coccidiosis via the synthesis of new compounds. In order to achieve that goal, collaboration between two laboratories has been established. Our strategy relies on the laboratories scientific knowledge in two complementary domains such as oraganic chemistry and parasitology. Our research is based on the effectiveness that synthesized compounds could have to inhibit parasites first steps of infection of the host cells. The screening of compounds has led us to the discovery of two lead compound inhibiting the invasion and development process of the parasites. Undertaken pharmacomodulations of these leads have allowed us to lower these concentrations values to 0,8 and 3,4 µM

Le parasite intracellulaire Toxoplasma gondii est l'agent pathogène de la toxoplasmose. Cette maladie est gravissime pour le fœtus et pour l'individu immunodéprimé. L'interconversion du parasite de la forme tachyzoïte virulente à la forme bradyzoïte quiescente est au centre de la pathogénèse de cette infection. Ce processus engage une régulation coordonnée des gènes du parasite qui se traduit par une cascade d'évènements moléculaires au niveau de l'ADN. Des études suggèrent un contrôle transcriptionnel de l'interconversion avec l'expression exclusive de certains gènes dans une forme donnée. Cependant, ce parasite et son phyllum se distinguent des autres eucaryotes par une quasi-pénurie des facteurs spécifiques de transcription. Nous avons émis l'hypothèse que le niveau d'expression des gènes du Toxoplasme est étroitement régulé par la structure physique et la nature chimique de la chromatine. Ce manuscrit illustre l'influence majeure du « code histone » sur la différenciation parasitaire. Nous avons identifié plusieurs enzymes en charge de l'écriture de ce code. L'exemple le plus frappant est la découverte d'une methyltransférase TgCARM1 qui méthyle l'arginine 17 de l'histone H3, une marque activatrice de la transcription. Nous avons également identifié le premier complexe co-repressor du Toxoplasme (TgCRC). TgCRC en opposition avec l'acétylase TgGCN5 régule en partie la balance acétylation/déacétylation, qui en retour influe sur la différenciation parasitaire. L'ensemble de nos résultats converge vers l'idée de l'existence d'un « code histone parasitaire » hautement sophistiqué, qui a co-évolué avec celui de la cellule hôte parasitée.

Les parasites apicomplexes sont ubiquitaires et ont une forte incidence en médecine humaine et vétérinaire. Certains de ces parasites, comme Plasmodium falciparum, l’agent du paludisme, ou Toxoplasma gondii, l’agent de la toxoplasmose, posent des problèmes de santé publique. Les thérapies existantes montrent parfois une efficacité limitée, une forte toxicité et entraînent des résistances, d’où la nécessité de nouvelles approches plus spécifiques. Dans ce contexte, nous avons développé deux approches d’inhibition des apicomplexes : -la synthèse de biphénylimidazoazines à large spectre efficaces au micromolaire sur cinq parasites apicomplexes différents in vitro. -la synthèse d’imidazo[1,2-b]pyridazines ciblant spécifiquement une protéine kinase (CDPK1) de T. gondii et efficaces au submicromolaire sur le parasite in vitro. Une diminution de plus de 90 % de la charge parasitaire chez la souris et une innocuité à court terme font de ces imidazo[1,2-b]pyridazines de bons candidats thérapeutiques. / Apicomplexan parasites are ubiquitous and have a strong incidence in veterinary and human medicine. Some of them, like Plasmodium falciparum, causing malaria, or Toxoplasma gondii, causing toxoplasmosis, are matter of public health concern. The existing therapies may have limited efficiency, high toxicity, and may lead to resistance, highlighting the necessity of new more specific approaches. In this context, we have developed two approaches to inhibit Apicomplexa: -the synthesis of biphenylimidazoazines with broad-spectrum and efficient at the micromolar range on five different apicomplexan parasites in vitro. -the synthesis of imidazo[1,2-b]pyridazines specifically targeting a kinase protein (CDPK1) of T. gondii and efficient at the submicromolar range on the parasite in vitro. More than 90% diminution of parasite burden in mice and short term safety make these imidazo[1,2-b]pyridazines good therapeutic candidates.

Toxoplasma gondii est un protiste apicomplexe responsable de la toxoplasmose. Ce parasite intracellulaire obligatoire possède des organites sécrétoires apicaux dont les rhoptries qui contiennent des facteurs de virulence essentiels à l'invasion et à la modulation de la cellule hôte qu'il infecte. Au cours de la division cellulaire de T. gondii, les protéines de rhoptries sont synthétisées selon la même cinétique. Dans le but d'identifier de nouvelles protéines dont la fonction est potentiellement liée aux rhoptries, nous avons recherché à partir des bases de données du génome de T. gondii, les protéines présentant ce profil particulier d'expression. La localisation subcellulaire de 12 candidats a été réalisée puis une caractérisation phénotypique de quatre d'entre eux a été entreprise. Nous avons identifié une nouvelle protéase de rhoptries, DegP, essentielle à la virulence du parasite in vivo. Nous montrons que DegP contrôle la phase aigüe de l'infection en modulant la réponse immune de l'hôte contribuant ainsi à la dissémination du parasite in vivo. Nous identifions également deux protéines homologues, Claw1 et Claw2, présentant une localisation atypique à l'extrémité apicale du parasite. Notre incapacité à déléter ces gènes pourrait indiquer un rôle essentiel de ces protéines au niveau du complexe apical de T. gondii. Enfin, bien que n'étant pas reliée aux rhoptries, ce crible a permis d'identifier la première protéine associée aux jonctions des vésicules constituant le complexe membranaire interne de Toxoplasma. La délétion de cette protéine, SIP, affecte la forme du parasite, entrainant un défaut de motilité, d'invasion et de virulence in vivo. / Toxoplasma gondii is an apicomplexan protist and the causative agent of toxoplasmosis. This obligate intracellular parasite harbors apical secretory organelles such as rhoptries that contain essential virulence factors responsible of the invasion and the modulation of the infected host cell. Along the cell cycle of T. gondii, rhoptry proteins share the same timing of expression. In order to identify new proteins involve in rhoptry content, biogenesis or secretion, we screened the genome database of T. gondii to isolate proteins that present this particular profile. We obtained the subcellular localization of 12 candidates and we investigated the biological functions for 4 of them. We showed that DegP, a rhoptry protease is essential for the in vivo virulence of T. gondii. DegP controls the acute phase during infection and modulate the host immune response leading to better parasite dissemination in vivo. Also, we identified Claw1 and its paralog Claw2 that present an atypical localization at the apical end of the parasite. To date, we were unable to disrupt the genes encoding these proteins suggesting that they may have an essential function related to the apical complex in T. gondii. Finally, we also examined a ‘hit' of this screening that was not related to rhoptries and we identified SIP, the first protein associated with the transversal junctions of the inner membrane complex in T. gondii. The disruption of SIP affects the shape of the parasite leading to an aberrant motility, defect in invasion and impaired parasite virulence in mice.

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