Les plastes sont des organites semi-autonomes qui dérivent d'un événement unique d'endosymbiose entre une cyanobactérie et une cellule eucaryote ancestrale. Le plaste le mieux caractérisé est le chloroplaste des cellules de plantes et d'algues vertes. À la différence des systèmes membranaires eucaryotes qui sont en général riches en phospholipides, les membranes des plastes végétaux se composent à plus de 70% de galactoglycérolipides (monogalactosyldiacylglycérol, MGDG ; digalactosyldiacylglycérol, DGDG). Leur synthèse est assurée par des galactosyltransférases, les MGDG synthases (EC 2.4.1.46) et les DGDG synthases (EC 2.4.1.241) localisées dans les membranes de l'enveloppe qui limitent l'organite. Chez les plantes, les galactolipides sont essentiels pour la biogenèse des plastes mais aussi à la synthèse de membranes extraplastidiales sous certaines conditions physiologiques telles qu'en carence de phosphate.La plupart des parasites Apicomplexes (protozoaires parasites à mode de vie intracellulaire) possèdent une structure plastidiale, non photosynthétique, contenant un ADN circulaire. Cet organite, baptisé apicoplaste, a pour origine phylogénétique une endosymbiose secondaire entre deux eucaryotes, avec ingestion d'une algue rouge unicellulaire par un protozoaire ancestral, suivie d'une disparition de la plupart des structures subcellulaires de l'algue. Des protéines codées par des gènes nucléaires sont importées dans l'apicoplaste et impliquées dans des voies métaboliques typiques des plantes telles que la biosynthèse d'acides gras par le système FASII.Des lipides aux propriétés chromatographiques proches de celles du MGDG et du DGDG ont pu être détectés dans des extraits de Plasmodium falciparum et Toxoplasma gondii, suggérant l'existence d'une voie de biosynthèse des galactolipides comparable à celle existant dans le chloroplaste. Au moyen d'une série d'anticorps dirigés contre le DGDG, un premier objectif de ce travail de thèse a été de caractériser la localisation d'un épitope de structure proche du digalactolipide chloroplastique (DGLE pour digalactolipid-like epitope) chez P. falciparum et déterminer l'évolution de la distribution subcellulaire de cet épitope au cours du cycle cellulaire du parasite. Ces études suggèrent qu'un lipide de structure proche du DGDG est associé à des systèmes membranaires en périphérie de la cellule, en particulier le complexe membranaire interne. Des parasites transgéniques exprimant une MGDG synthase exogène de plante ont été générés. L'accumulation remarquable à la fois de MGDG et de DGDG chez ces transformants démontre d'une part que l'enzyme de plante est fonctionnelle, catalysant la synthèse de MGDG, et d'autre part qu'une glycosyltransférase de P. falciparum est capable ensuite de catalyser de grandes quantités de DGDG. Le rôle possible de cette glycosyltransférase dans la synthèse du DGDG reste à établir. Un second objectif de cette thèse était d'évaluer le potentiel dans P. falciparum de composés inhibant la synthèse des galactolipides de plante dans une visée thérapeutique. Un criblage à haut débit robotisé d'une banque de 24.000 molécules nous a permis d'identifier des inhibiteurs de la MGDG synthase 1 d'Arabidopsis thaliana, parmi lesquels deux composés présentent un effet inhibiteur mesuré par une CI50 de l'ordre 10 µM sur l'activité MGDG synthase. Nous avons pu caractériser l'effet de ces molécules comme compétiteurs de la fixation du diacylglycérol. Une activité inhibitrice de la prolifération de P. falciparum a pu être mesurée in vitro bien qu'aucune enzyme homologue à la MGDG synthase n'ait pu être identifiée in silico sur les banques de données relatives aux Apicomplexes. Une diversification de la structure du châssis moléculaire a été conduite afin d'améliorer 1) l'effet herbicide et 2) l'inhibition de la croissance des parasites et de développer ainsi de nouvelles molécules antipaludiques, qui puissent être qualifiées de médicaments herbicides. L'étude de 250 analogues a permis de progresser de façon substantielle dans le sens d'une meilleure sélectivité avec des composés actifs à 200 nM.Il n'est pas exclu que les molécules sélectionnées pour leur capacité à inhiber une activité MGDG synthase exercent, chez P. falciparum, un effet sur une autre cible. Nous avons conduit une expérience visant à isoler la(les) protéine(s) cible(s) des molécules bioactives par chromatographie d'affinité, puis identifié ces protéines après digestion trypsique par spectrométrie de masse. Une perspective de ce travail consiste à caractériser certaines de ces cibles candidates.Le développement de candidats-médicaments est un processus long selon le schéma classique, depuis la validation d'une cible jusqu'aux essais cliniques. La nouvelle classe de compétiteurs du diacylglycérol caractérisée dans ce travail de thèse présente des propriétés intéressantes dans une visée thérapeutique, qu'il sera important d'optimiser dans l'avenir.

Les Apicomplexa sont des parasites intracellulaires obligatoires. Ils peuvent être responsables d’importantes maladies infectieuses. Toxoplasma gondii par exemple, se développe au sein de la cellule hôte, dans une niche protectrice « la vacuole parasitophore » jusqu’à épuisement des ressources de la cellule hôte ou il provoque sa sortie pour ré envahir à nouveau, c’est la phase aigüe de la toxoplasmose. Afin de répondre à leur besoins nutritifs nécessaires à cette expansion rapide, le parasite combine de manière intéressante et très complexe les voies de synthèse de novo et d’import des nutriments depuis la cellule hôte. Dans le cas des lipides, le parasite en a besoin en une importante quantité pour assurer la ségrégation des organites, la formation des nouvelles membranes filles et l’expansion de la membrane de la vacuole parasitophore pendant la division. La synthèse de novo des lipides a été reportée essentielles pour le parasite tout comme la synthèse de novo des acides gras via la voie procaryote de synthèse des acides gras FASII dans l’apicoplaste.Dans cette étude nous apportant des éléments intéressants qui relient la voie de synthèse FASII et la synthèse des lipides. Nous avons pu démontrer que l’apicoplaste possède une voie de synthèse des précurseurs important voire essentielles à la synthèse de tous les lipides membranaires, qui est principalement le LPA dans le cas de T. gondii. Les enzymes acyltransférase impliquées dans la synthèse de ces précurseurs sont TgATS1 et TgATS2 pour former le LPA et le PA respectivement. Elles sont ortologues aux enzymes précédemment caractérisées chez les bactéries et le chloroplaste des plantes et algues. Les modifications de ces enzymes et les analyses de lipidique et de spectrométrie de masse, ont révélé le rôle l’implication de ces enzymes dans la synthèse des phospholipides membranaires à partir des acides gras néo synthétisés de novo (le C14:0). Cette étude présente aussi des résultats préliminaires sur une voie de synthèse du PA dans le réticulum endoplasmique. La être de TgATS2 n’est pas létale et elle est compensée par augmentation de l’abondance des acides gras C16 :0 et C18 :0 dans la fraction des phospholipides extraits. Ces informations suggèrent une importante collaboration entre l’apicoplaste et le réticulum endoplasmique pour la synthèse des lipides nécessaires pour le développement intracellulaire du parasite. / Apicomplexa phylum includes a large number of obligate intracellular parasites responsible for important human and animal diseases, especially malaria and toxoplasmosis. There is current no efficient vaccine against these parasites. Severe toxoplasmosis caused by Toxoplasma gondii, occurs in immunocompromised individuals and during congenital infection. T. gondii is dependent on large amounts of lipids for its intracellular development within the host cell. These lipids are acquired by a combination of host lipid scavenging and de novo biosynthetic pathways. T. gondii is able to de novo synthesis of fatty acid via a prokaryotic FASII pathway in the apicoplast, a relict non-photosynthetic plastid. Genome mining suggests that the apicoplast can generate phosphatidic acid, central phospholipid precursor. Our recent work confirmed that the apicoplast harbors the first step of PA synthesis via a glycerol-3-phosphate acyltransferase enzyme called ATS1 by homology to chloroplast enzyme, which generates lysophosphatidic acid (LPA). This essential LPA can be exported from the apicoplast for the de novo bulk synthesis of phospholipids sustaining parasite membrane biogenesis (Amiar et al. Plos Path. 2016). T. gondii genome encodes for two other acyltransferases named sn-acylglycerol 3-Phosphate acyltransferases (AGPAT). AGPATs ensure the second step of PA synthesis using LPA. In this work we showed that these enzymes are localized in the Endoplasmic Reticulum and the apicoplast (named AGPAT and ATS2, respectively). A genetic disruption of ATS2 using CRISPR-Cas9 strategy affects parasite growth and normal cytokinesis. Lipidomic analysis using mass spectrometry combined to stable isotope labelling of ATS2-KO reveals an important reduction of lipids containing apicoplast-generated fatty acid C14:0. However, an increase of lipids containing C16 and C18 fatty acids was observed, suggesting a compensation of ATS2 loss by AGPAT activity in ER. These data indicated an important collaboration between apicoplast and ER for lipid synthesis that involves massive lipid trafficking between the two organelles.

L'autophagie est un processus d'auto-dégradation conservé chez la plupart des eucaryotes. Généralement induit par un stress nutritif, il requiert la formation d'un compartiment à double membrane appelé l’autophagosome qui séquestre et transporte des composants intracellulaires dégradés et recyclés dans le lysosome. La protéine ATG8, qui occupe une position centrale dans ce processus, est recrutée aux membranes de l’autophagosome par un système de conjugaison très régulé. Toxoplasma gondii est un protozoaire parasite appartenant au phylum des Apicomplexes, qui contient une machinerie d'autophagie réduite. Suite à un stress nutritif, ce parasite intracellulaire obligatoire est néanmoins capable de générer des autophagosomes décorés par TgATG8. De façon surprenante, en condition normale de croissance intracellulaire, cette protéine se localise principalement à l’apicoplaste, un plaste non photosynthétique acquis par endosymbiose secondaire qui contient des voies métaboliques essentielles à la survie du parasite. Le but de ma thèse a été d’élucider les fonctions canoniques et non canoniques d‘ATG8 chez Toxoplasma. La première partie de cette étude porte sur la caractérisation fonctionnelle et spatio-temporelle de l'association de TgATG8 avec l’apicoplaste. Nous avons montré que TgATG8 est recrutée aux extrémités de l’apicoplaste en élongation, ce qui permet le maintien de l’organelle à travers les générations en le connectant aux centrosomes pour une répartition dans les deux cellules filles. La deuxième partie de ce travail vise à isoler et identifier par spectrométrie de masse des partenaires putatifs de TgATG8 qui seraient impliqués dans l’autophagie ou dans le rôle non-canonique à l’apicoplaste. Nous avons analysé la localisation subcellulaire de neuf candidats et des caractérisations fonctionnelles ont été entreprises pour trois protéines. Bien que nous n’ayons pas pu confirmer leurs interactions avec TgATG8, cela a permis l'identification de nouvelles protéines parasitaires: une phospholipase à l’apicoplaste essentielle à la survie du parasite, un régulateur potentiel du cycle cellulaire et un composant du cytosquelette du parasite. / Autophagy is a self-degradative process evolutionary conserved among eukaryotes. Typically induced by starvation, it involves the formation of a double membrane compartment called the autophagosome to sequester and deliver intracellular components for lysosomal degradation and recycling. The protein ATG8 occupies a central position in this process and is recruited to autophagosomal membranes by a highly regulated conjugation system. Toxoplasma gondii is a parasitic protist belonging to the Apicomplexa phylum, which possesses a reduced autophagy machinery. This obligate intracellular parasite is nevertheless able to generate TgATG8-decorated autophagosomes upon nutrient stress. Surprisingly, during normal intracellular parasite growth, TgATG8 mainly localizes to the apicoplast, a non-photosynthetic plastid acquired by secondary endosymbiosis which hosts essential metabolic pathways. My thesis aimed to elucidate the canonical and non-canonical roles of ATG8 in Toxoplasma. The first part of this study is the functional and spatio-temporal characterization of TgATG8 association with the apicoplast. We showed TgATG8 is recruited to both ends of the elongating plastid during parasite division, and allows the maintenance of the organelle across generations by permitting its centrosome-driven distribution into the two daughter cells. The second part of this work is the isolation and mass spectrometry-based identification of putative TgATG8-interacting proteins that would be involved in autophagy-related or non-canonical functions. We analyzed the subcellular localization of nine candidates and functional studies were conducted for three proteins. Although we were unable to confirm their interactions with TgATG8, this approach allowed the identification of novel and important parasite proteins: an essential apicoplast phospholipase, a potential regulator of the cell cycle, and a component of the parasite cytoskeleton.