Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-23Bitstream added on 2014-11-10T11:58:01Z : No. of bitstreams: 1 000786749_20150920.pdf: 227688 bytes, checksum: c800c0192a1f81b1c24ac20d93cf4f4c (MD5) Bitstreams deleted on 2015-09-21T13:18:45Z: 000786749_20150920.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-21T13:19:48Z : No. of bitstreams: 1 000786749.pdf: 1032630 bytes, checksum: 9ff7c0ae2515a60572247ae468fd531f (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Peptidases são enzimas responsáveis por realizar a clivagem de ligações peptídicas de outras proteínas e peptídeos. Essas enzimas apresentam grande importância, pois são utilizadas em vários segmentos industriais, desde a indústria alimentícia até mesmo no processamento de couro e pele e formulações de medicamentos. Uma das principais aplicações das peptidases é nos laticínios, na produção de queijo, que inicialmente envolve a coagulação das caseínas do leite pela ação de enzimas proteolíticas coagulantes, sendo a renina a principal delas. Enzimas microbianas coagulantes de leite são peptidases aspárticas que catalisam a coagulação do leite, substituindo o coalho de vitelo. Em trabalhos anteriores foi isolado o fungo termofílico Thermomucor indicae-seudaticae N31 que produziu em fermentação em estado sólido (FES), uma peptidase com capacidade de hidrolisar a κ-caseína do leite e produzir coágulo de boa qualidade. Entretanto, sua caracterização funcional e especificidade de ação ainda não estão claras. Assim, neste estudo, deu-se continuidade à investigação de estrutura e ação desta enzima coagulante. Foi realizado o monitoramento da hidrólise enzimática da caseína por cromatografia líquida de alta eficiência, foi feita análise da especificidade primária da peptidase utilizando substrato de fluorescência da série Abz-LSFMAIQ-EDDnp e foi determinada a sequência primária da proteína por espectrometria de massas. O monitoramento da hidrólise enzimática da caseína por cromatografia líquida de alta eficiência mostrou que o perfil do extrato bruto de Thermomucor indicae-seudaticae N31 apresenta alta similaridade com as enzimas comerciais das marcas Bela-Vista e Chr-Hansen obtidas dos fungos Rhizomucor miehei e Aspergillus niger, respectivamente. A análise de especificidade primária da peptidase demonstrou alta especificidade e afinidade pelo substrato sintético. A determinação do ... / Peptidase enzymes are responsible for catalyze the cleavage of peptide bonds of other proteins. These enzymes present great importance, therefore, are used in several industrial segments, since the food industry even in the processing of leather and formulations of medicinal products. One major application of peptidases is in the dairy industry for cheese production, which initially involves clotting of milk caseins by the action of coagulant proteolytic enzymes being rennin the main one. Microbial rennet-like milk-clotting enzymes are aspartic proteinases that catalyze milk coagulation, substituting calf rennet. In previous study it was isolated a thermophilic fungus Thermomucor indicae-seudaticae N31 that produced on Solid State Fermentation (SSF), a peptidase with capacity to hydrolyses the k-casein of milk and produce good quality curd. However its functional characterization and specificity of action is not clear yet. Thus, in this study we continued the investigation of structure and action of this enzyme coagulant. Was carried out the monitoring of enzymatic hydrolysis of casein by high performance liquid chromatography-reverse phase, was analyzed the specificity of primary peptidase using substrate of fluorescence resonance energy transfer (FRET) peptide series Abz-LSFMAIQ-EDDnp and determined the primary sequence of the protein by mass spectrometry. Monitoring the enzymatic hydrolysis of casein by high performance liquid chromatography-reverse phase showed that the crude extract Thermomucor indicae-seudaticae N31 shows high similarity with commercial enzymes brands Bela-Vista and Chr-Hansen obtained from fungi Rhizomucor miehei and Aspergillus niger, respectively. The analysis of primary peptidase specificity demonstrated high specificity and affinity for the synthetic substrate. The determination of the cleavage site showed 46% hydrolysis of the bond between the amino acids phenylalanine and methionine and 54% between alanine ...

Orientador: José Geraldo Nery / Banca: Eleni Gomes / Banca: José Manoel Marconcini / Resumo: Os principais objetivos do presente trabalho de pesquisa são a síntese de novos catalisadores zeolíticos, a avaliação de seus usos como possíveis matrizes para imobilização enzimática, e o uso desse complexo zeólita/enzima como catalisador para produção de biodiesel. Inicialmente foram sintetizadas duas classes de zeólitas: faujasita (FAU) e gismondina (GIS), em suas formas sódicas, e estas zeólitas foram convertidas para as formas Cu2+, Ni2+ e Zn2+ por troca iônica. Na sequência foi avaliado o potencial desses materiais zeolíticos para imobilização e atividade lipolítica da enzima (Lipase de Rhizomucor miehei) na reação de hidrólise do p-nitrofenil palmitato (pNPP) a p-nitrofenol (pNP). Os estudos de imobilização foram feitos variando os parâmetros térmicos do pré-tratamento do suporte zeolítico e o meio catiônico dominante. Os resultados obtidos mostraram que dos 16 suportes avaliados para imobilização enzimática, todos se mostraram capazes de imobilizar a enzima em questão e produzir atividade catalítica, no entanto, o melhor compromisso entre imobilização e atividade enzimática foi obtido pelo complexo LIPASE/GIS/Ni2+ pré-tratada a 200ºC. Este complexo que imobilizou 11,2 ± 0,6% da quantidade de enzima da solução e obteve uma atividade de 13,278 U/mg-suporte. Para as reações de transesterificação foram usados como catalisadores as zeólitas puras (GIS/Ni2+ e GIS/Zn2+), enzimas livres (Lipases de Rhizomucor miehei) e enzimas imobilizadas sobre as zeólitas (LIPASE/GIS/Ni2+ e LIPASE/GIS/Zn2+) para a produção de biodiesel a partir do óleo vegetal (óleo de soja). Os resultados obtidos indicaram que os dois complexos produziram biodiesel, no entanto, o teor de ésteres metílicos de 56,2% produzidos pelo suporte LIPASE/GIS/Ni2+ mostrou que houve... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The main goals of this research work are the syntheses of new zeolitic catalysts and their use as possible solid matrices for enzyme immobilization, and the study this complex zeolite/enzyme as a catalyst for biodiesel production. Initially, two different zeolites were synthesized: faujasite (FAU) and gismondine (GIS). The two zeolites were first prepared in their sodic forms and thereafter they were submitted to an ion exchange process in order to the replace the extra-framework Na+ by Cu2+, Ni2+ and Zn2+. The potential of these zeolitic materials for immobilization and lipolytic activity of the enzyme (Lipase from Rhizomucor miehei) was evaluated through the hydrolysis reaction from p-nitrophenyl palmitate (pNPP) to p-nitrophenol (pNP). Several immobilization studies were performed and two main parameters were singled out for this study: the thermal parameters or thermal stability of the zeolitic support and the main dominant cationic medium. The results showed that all of the 16 prepared zeolitic supports were not only able to immobilize the enzyme, but also they were able to show significant catalytic activity. However, the best compromise between immobilization and enzymatic activity was obtained with the complex LIPASE/GIS/Ni2+ pre-treated at 200°C, since it was able to immobilize 11.2 ± 0.6% of the amount of enzymes in solution and an activity of 13.278 U/mg-support. The transesterification reactions for the production of biodiesel from vegetable oils (soybean oil) were performed with the following catalysts: zeolite pure (GIS/Zn2+ and GIS/Ni2+), free enzymes (Lipases from Rhizomucor miehei) and immobilized enzymes on zeolites (LIPASE/GIS/Zn2+ and LIPASE/GIS/Ni2+). The results indicated that two zeolite/enzyme complexes were able to produce biodiesel, but the content... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-11-16Bitstream added on 2014-06-13T19:14:40Z : No. of bitstreams: 1 silva_rr_me_sjrp.pdf: 961028 bytes, checksum: 0d7989443c42fd25745d208364a42a88 (MD5) / A produção de proteases de origem microbiana depende das condições de cultivo e da diversidade bioquímica de cada espécie. Estudos comparativos entre fermentação em estado sólido (FES) e fermentação submersa (FSm) usando farelo de trigo e meio sintético, respectivamente, foram realizados para a determinação dos parâmetros de produção de proteases pelo fungo Aspergillus fumigatus Fresenius. A melhor produção de protease foi em FES no período de 96 horas utilizando farelo de trigo, temperatura de 30 ºC e 1x106 esporos/5g de substrato com 1.517 U/mL. Em FSm o pico de produção foi em pH 6,0, a 30ºC, 5x105 esporos/mL de meio no período de 72 e 96 horas em meio contendo 0,5 e 0,25% de caseína, respectivamente, ambos com 40 U/mL. Conforme a produtividade dos processos fermentativos, o extrato enzimático da FES foi utilizado para estudos de purificação e caracterização bioquímica. Neste estudo, a protease purificada apresentou atividade ótima em pH 7,5 e 50ºC, sendo inibida por Fenil-metil-sulfonil-fluoreto (PMSF) e mais intensamente por antipaína (1,6 µM). Sobre efeito de íons, foi observado modulação da atividade proteolítica, principalmente com inibição por AlCl3, cuja atividade proteolítica residual foi de 18% após incubação com este íon. Na presença de Ditiotreitol (DTT) e uréia houve diminuição da atividade proteolítica, apresentando atividades residuais de 63% em 200 mM de DTT e 10% com 5 M de uréia. Comparativamente, na concentração de 0,1% de cada surfactante estudado, notou-se redução da atividade proteolítica, sendo 97% em presença de Brometo de cetil-trimetil amônio (CTAB), 79% para 4 - (1,1,3,3 - Tetrametilbutil) fenil- polietileno glicol (Triton X-100), 55% com Polyoxyethylenesorbitan monolaurato (Tween-20) e completa redução da atividade (0%) em... / The microbial protease production depends on growing conditions and the biochemical diversity of each species. Comparative studies between solid-state fermentation (SSF) and submerged fermentation (SmF) using wheat bran and synthetic medium, respectively, were performed to determine the optimum parameters for protease production by the fungus Aspergillus fumigatus Fresenius. The best protease production was in SSF within 96 hours using wheat bran, temperature 30°C and 1x106 spores/5g of substrate, with 1,517 U/mL. In SmF peak production was at pH 6.0 at 30°C, 5x105 spores/mL of media within 72 and 96 hours in medium containing 0.5 and 0.25% casein, respectively, with 40 U/mL. According to the productivity of the fermentative processes, enzymatic extract was used from SSF to study purification and biochemical characterization. In this study, purified protease showed optimum activity at pH 7.5 and 50°C, and inhibited by Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and more intensely for antipain (1,6 µM). Concerning to the effect of ions, we observed modulation of the proteolytic activity, especially with inhibition by AlCl3, which residual activity was of 18 % after incubation with this ion. In the presence of Dithiothreitol (DTT) and ureia, we observed progressive decrease in proteolytic activity, presenting residual activities of 63% with 200 mM DTT, and 10% with 5 M ureia. Comparatively, in the concentration of 0.1% of each surfactant studied, there was a reduction in the proteolytic activity in 97% in presence of Cetyl trimethylammonium bromide (CTAB), 79% with 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol (Triton X-100), 55% with Polyoxyethylenesorbitan monolaurate (Tween-20) and a complete inactivation in the presence of Sodium dodecyl sulfate... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-10-01Bitstream added on 2014-06-13T19:09:12Z : No. of bitstreams: 1 pinto_top_me_sjrp.pdf: 1417990 bytes, checksum: 1ff62a60751622fd662850c2a8565eba (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O aproveitamento de resíduos agrícolas e agro-industriais como fonte de energia pode se tornar uma alternativa viável. O alvo principal para esta empreitada, pela sua disponibilidade e proximidade das indústrias fermentativas é o bagaço de cana, que ainda retém 2/3 da energia presente na cana, é largamente disponível no Brasil e hoje é parcialmente rejeitado ou subaproveitado. Uma forma de aproveitamento que tem se mostrado bastante promissora refere-se ao uso dessa biomassa na produção do bioetanol. No presente trabalho, avaliou-se o perfil de produção enzimática dos fungos Thermoascus aurantiacus CBMAI 756, Thermomyces lanuginosus, Penicillium viridicatum RFC3 e Trichoderma reesei QM9414, através de fermentação em estado sólido em meio com bagaço de cana e farelo de trigo. Aplicou-se esses extratos enzimáticos na hidrólise de bagaço de cana submetido a diferentes pré-tratamentos térmicos: água quente, explosão a vapor, e água quente em combinação com HCl, H2SO4, H3PO4, H2O2 ou NaOH. Determinou-se os principais inibidores (furfural e 5-hidroximetilfurfural) e açúcares redutores (glicose, xilose, arabinose, galactose, xilobiose e celobiose) gerados no processo. O fungo T. aurantiacus foi o melhor produtor de enzimas celulolíticas (536,3 U/g de CMCase) e hemicelulolíticas (3419,2 U/g de xilanase), apresentando juntamente com o extrato enzimático de T. reesei os melhores rendimentos na sacarificação do bagaço. Os extratos enzimáticos foram mais eficientes na hidrólise do bagaço pré-tratado com NaOH e explosão a vapor com rendimentos de 3,87 e 1,21 mg/mL de açúcares redutores, respectivamente. A mistura dos extratos enzimáticos de T. aurantiacus e T. reesei aumentou em 31,4% a eficiência da hidrolise com o bagaço pré-tratado com explosão a vapor. A concentração dos extratos por precipitação por etanol foi eficiente para a maioria... / The utilization of agricultural and agro-industrial residues as energy source can become a viable alternative. The main target for this venture, for its availability and proximity to fermentation industries is the sugarcane bagasse, which still retains two thirds of the energy present in the cane, is widely available in Brazil and today is partly rejected or underused. One form of exploitation that has shown promising refers to the use of biomass in the production of bioethanol. In this study, we evaluated the profile of enzymatic production of fungi Thermoascus aurantiacus CBMAI 756, Thermomyces lanuginosus, Penicillium viridicatum RFC3 and Trichoderma reesei QM9414 through solid state fermentation in a medium with sugar cane bagasse and wheat bran. These enzymatic extracts were applied on the hydrolysis of sugarcane bagasse under different thermic pre-treatments: hot water, steam explosion, and hot water in combination with HCl, H2SO4, H3PO4, NaOH or H2O2. The main inhibitors (furfural and 5-hydroxymethylfurfural) and reducing sugars (glucose, xylose, arabinose, galactose, xilobiose and cellobiose) generated in the process were determined. The fungus T. aurantiacus was the best producer of cellulolytic (536.3 U/g CMCase) and hemicellulolytic enzymes (3419.2 U/g xylanase), exhibiting along the enzymatic extract from T. reesei the best yields in the saccharification of bagasse. The enzymatic extracts were more efficient in the hydrolysis of bagasse pretreated with NaOH and steam explosion with a yield of 3.87 and 1.21 mg/mL of reducing sugars, respectively. The mixture of enzyme extract of T. aurantiacus and T. reesei increased 31.4% the efficiency of hydrolysis with bagasse pre-treated with steam explosion. The concentration of the extracts by precipitation with ethanol was effective for most enzymatic activities and resulted in an increase of approximately 50% of hydrolysis... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-26Bitstream added on 2014-06-13T19:50:11Z : No. of bitstreams: 1 garcia_gac_me_sjrp.pdf: 1471575 bytes, checksum: 697e072c570bcfd7b45d96719c8b22e5 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O queijo Prato é fabricado por coagulação enzimática, adicionado de corante e complementado ou não pela ação de bactérias láticas específicas, podendo ser classificado como gordo e de média umidade. Atualmente, a procura por produtos lácteos com baixo teor de gordura vem aumentando, pois o consumo de gordura de origem animal apresenta relação com doenças coronárias e carcinogênicas. Além disso, para indivíduos que buscam a manutenção ou perda de peso corporal, o consumo de gordura deve ser restrito. Por outro lado, queijos com teor reduzido de gordura apresentam defeitos nas características sensoriais, no rendimento e na maturação, quando comparados aos queijos com teor integral. Para minimizar as alterações decorrentes da retirada da gordura, é necessário utilizar uma tecnologia que não altere a qualidade do produto final. Neste contexto, no presente trabalho estudou-se o uso da enzima proteolítica, fastuosaína, extraída do fruto verde do gravatá (Bromelia fastuosa) na maturação do queijo Prato com teor reduzido de gordura. Foram realizados 4 processamentos: um pelo método tradicional - sem adição de enzima fastuosaína (Processamento A, controle) e três pelo método modificado, nos quais se utilizaram diferentes concentrações de fastuosaína com diferentes atividades enzimáticas. O leite utilizado na fabricação dos queijos foi submetido a análises de densidade, gordura, extrato seco total, acidez, presença de antibiótico, Salmonella, contagem padrão em placas, coliformes totais e fecais, e os queijos foram submetidos a análises microbiológicas de bactérias aeróbias mesófilas, bolores e leveduras, Escherichia coli, coliformes totais e fecais, Estafilococos coagulase positiva, Salmonella e Listeria monocytogenes. Durante a maturação os queijos foram submetidos a análises de:... / Prato cheese is manufactured by enzymatic coagulation, with addition of colorings and complemented or not by the action of specific lactic bacteria, and it can be classified as semihard and fatty cheese. Currently, the demand for dairy products with low-fat content is increasing, therefore the consumption of animal fat is related to coronary and carcinogenic diseases. Moreover, for individuals that search for the maintenance or the loss of body weight, the intake of fat must be restricted. On the other hand, cheeses with reduced fat content present defects in sensory characteristics, both in the yield of low-fat cheese and in its ripening, when compared with full-fat product. To minimize the alterations due to the removal of fat, it is necessary to use a technology that does not modify the final quality of the product. In this context, in this work the addition of the proteolytic enzyme, fastuosain, extracted of the green fruit of gravatá (Bromelia fastuosa) on the ripening of the low fat Prato cheese was studied. Four batches of cheese were carried out. One of them was not modified - without addition of fastuosain enzyme (Process A, control) and three batches were added with different concentrations of fastuosain with different enzymatic activities. The milk used in the manufacture of the cheeses was submitted to the analyses of density, fat, total dry matter, acidity, presence of antibiotic, total and fecal coliforms, Salmonella, counting standard in plates and the cheeses were submitted to microbiological analyses of aerobic mesophilic bacteria, total and fecal coliforms, yeasts and molds, Escherichia coli, coagulase positive staphylococci, Salmonella and Listeria monocytogenes. During the ripening the cheeses were submitted to the analyses of: total dry matter, acidity, fat, fat in the dry matter, ashes, nitrogen and total protein, soluble nitrogen (NS)...(Complete abstract click eletronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-08-14Bitstream added on 2014-06-13T18:21:12Z : No. of bitstreams: 1 albuquerque_cm_me_sjrp.pdf: 2192673 bytes, checksum: 95c4d486da5e0308e967a8ea5475dd6c (MD5) / A recuperação dos sólidos solúveis presentes na membrana central da laranja, separada durante a etapa de extração industrial do suco, normalmente produz um suco contendo de 5 a 6ºBrix e uma série de outros compostos insolúveis (cerca de 9%), muitos dos quais contribuem para a baixa qualidade do suco, sendo responsáveis pelo amargor e adstringência. O presente trabalho propôs-se a clarificar esse suco contendo sólidos recuperados, empregando um pré-tratamento com enzimas pectinolíticas seguido por tratamento por flotação por injeção de ar comprimido auxiliada por agentes clarificantes: bentonita, sílica sol e colágeno hidrolisado. Constituíram-se os objetivos: (i) a determinação das melhores condições (tipo de enzima pectinolítica, duas hidrolases e duas pectinases, e tempo de incubação) para a degradação enzimática da pectina presente; (ii) a determinação da melhor combinação dos agentes clarificantes visando obter um subproduto clarificado através do monitoramento de parâmetros físico-químicos (capacidade floculante e transmitância) e (iii) a avaliação do processo de flotação com diferentes concentrações de bentonita (500, 1.000 e 1.500 mg L-suco-1 e pressões (490, 680 e 880 kPa) pela determinação do grau de clarificação através de monitoramento da transmitância do clarificado, pela determinação da velocidade de flotação/separação das fases, através da verificação das frações volumétricas das fases separadas (clarificado, sedimentado e flotado), em intervalos de tempos regulares durante o processo de flotação e pela análise do produto final clarificado. Os produtos clarificados foram analisados com relação ao conteúdo de sólidos solúveis e insolúveis, pH, acidez titulável, polpa, transmitância, cor (parâmetros L*, a*, b*) proteína, pectina total, sódio, hesperidina, polifenóis e bioflavonóides. Para o tratamento... / Core membrane of the orange fruit separated during the juice extraction step in the citrus processing industrial plant, is currently submitted to a soluble solids recovery process, normally producing a by product (secondary) juice containing about 5 to 6º Brix and other insoluble components (about 9%), which contribute to the juice’s low quality, since many are responsible for the bitterness and adstringency. This research aimed to clarify this by-product juice containing recovered solids, by enzyme pre-treatment with pectic enzymes, followed by a flotation treatment with compressed air injection using fining agents: bentonite, silica sol and hydrolyzed collagen. The objectives were (i) to determine the best conditions (enzyme type, two hydrolyses and two pectin-liases and incubation time) for the enzyme treatment for pectin degradation; (ii) to determine the best combination of the fining agents to obtain a clarified by-product through monitoring physical chemical parameters (flocculating ability and product transmittance); and (iii) to evaluate the flotation process and the effects of bentonite concentration (500, 1.000 and 1.500 mg L-juice-1) and saturation pressure (490, 680 and 880 kPa) by determining the degree of clarification through monitoring the product transmittance and by determining the flotation rate (and phase separation) through measurements of volumetric fractions of the separated phases (clarified, floated and sediment) over time during the flotation and phase separation processes. Both untreated and clarified juices were analyzed for soluble and insoluble solid contents, pH, total titratable acidity, pulp content, transmittance, color (parameters L*, a* and b*), protein and pectin contents, sodium, hesperidine, poliphenols and bioflavonoids. The results indicates a purified poligalacturonase as the adequate for the enzyme treatment in 1 hour, 45ºC, with 0,05 mL... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Roberto da Silva / Banca: Hamilton Cabral / Banca: Gustavo Orlando Bonilla Rodríguez / Resumo: Peptidases são enzimas responsáveis por realizar a clivagem de ligações peptídicas de outras proteínas e peptídeos. Essas enzimas apresentam grande importância, pois são utilizadas em vários segmentos industriais, desde a indústria alimentícia até mesmo no processamento de couro e pele e formulações de medicamentos. Uma das principais aplicações das peptidases é nos laticínios, na produção de queijo, que inicialmente envolve a coagulação das caseínas do leite pela ação de enzimas proteolíticas coagulantes, sendo a renina a principal delas. Enzimas microbianas coagulantes de leite são peptidases aspárticas que catalisam a coagulação do leite, substituindo o coalho de vitelo. Em trabalhos anteriores foi isolado o fungo termofílico Thermomucor indicae-seudaticae N31 que produziu em fermentação em estado sólido (FES), uma peptidase com capacidade de hidrolisar a κ-caseína do leite e produzir coágulo de boa qualidade. Entretanto, sua caracterização funcional e especificidade de ação ainda não estão claras. Assim, neste estudo, deu-se continuidade à investigação de estrutura e ação desta enzima coagulante. Foi realizado o monitoramento da hidrólise enzimática da caseína por cromatografia líquida de alta eficiência, foi feita análise da especificidade primária da peptidase utilizando substrato de fluorescência da série Abz-LSFMAIQ-EDDnp e foi determinada a sequência primária da proteína por espectrometria de massas. O monitoramento da hidrólise enzimática da caseína por cromatografia líquida de alta eficiência mostrou que o perfil do extrato bruto de Thermomucor indicae-seudaticae N31 apresenta alta similaridade com as enzimas comerciais das marcas Bela-Vista e Chr-Hansen obtidas dos fungos Rhizomucor miehei e Aspergillus niger, respectivamente. A análise de especificidade primária da peptidase demonstrou alta especificidade e afinidade pelo substrato sintético. A determinação do ... / Abstract: Peptidase enzymes are responsible for catalyze the cleavage of peptide bonds of other proteins. These enzymes present great importance, therefore, are used in several industrial segments, since the food industry even in the processing of leather and formulations of medicinal products. One major application of peptidases is in the dairy industry for cheese production, which initially involves clotting of milk caseins by the action of coagulant proteolytic enzymes being rennin the main one. Microbial rennet-like milk-clotting enzymes are aspartic proteinases that catalyze milk coagulation, substituting calf rennet. In previous study it was isolated a thermophilic fungus Thermomucor indicae-seudaticae N31 that produced on Solid State Fermentation (SSF), a peptidase with capacity to hydrolyses the k-casein of milk and produce good quality curd. However its functional characterization and specificity of action is not clear yet. Thus, in this study we continued the investigation of structure and action of this enzyme coagulant. Was carried out the monitoring of enzymatic hydrolysis of casein by high performance liquid chromatography-reverse phase, was analyzed the specificity of primary peptidase using substrate of fluorescence resonance energy transfer (FRET) peptide series Abz-LSFMAIQ-EDDnp and determined the primary sequence of the protein by mass spectrometry. Monitoring the enzymatic hydrolysis of casein by high performance liquid chromatography-reverse phase showed that the crude extract Thermomucor indicae-seudaticae N31 shows high similarity with commercial enzymes brands Bela-Vista and Chr-Hansen obtained from fungi Rhizomucor miehei and Aspergillus niger, respectively. The analysis of primary peptidase specificity demonstrated high specificity and affinity for the synthetic substrate. The determination of the cleavage site showed 46% hydrolysis of the bond between the amino acids phenylalanine and methionine and 54% between alanine ... / Mestre

CAPES; CNPq / O presente trabalho teve como objetivo caracterizar o efluente da Indústria de Compensado e avaliar a utilização do fungo filamentoso Pleurotus ostreatus no tratamento deste resíduo em reator air lift, além de verificar a potencialidade da complementação do tratamento do efluente utilizando um POA do tipo Fenton, a fim de ajustar valores em concordância com os padrões legais estabelecidos pelos órgãos regulamentadores. O efluente bruto apresentou 12.192 ± 100 mgO2L-1 de DQO, 8.849 ± 60 mgO2L-1 de DBO5,20(Demanda Bioquímica de Oxigênio), 8.333 ± 30 unidades de cor, 1.220 ± 5 mgL-1 de fenóis totais e pH 4,63. O teor de sólidos totais no efluente foi de 18,45 ± 0,15 gL-1, sendo que desse total 2,73 ± 0,04 gL-1 correspondia a cinzas, 1,36 ± 0,03 gL-1 a lignina klason solúvel, 49 ± 3 mgL-1 de lignina klason insolúvel e aproximadamente 71% de toxicidade aguda expressa em inibição de E. coli. A espectrometria por FTIR dos sólidos do efluente indicou bandas em 3430–3440 cm-1, 2938 cm-1, 1603 cm-1, que puderam ser atribuídas aos grupos O-H, C-H e C=C, respectivamente. O tratamento biológico utilizando o fungo Pleurotus ostreatus inicialmente foi otimizado em incubadora orbital (shaker) por meio de delineamento fatorial(23) obtendo-se as melhores condições reacionais para a redução da DQO (pH 5,7, concentração de sacarose 7,5 gL-1 e concentração de nitrato de amônio igual a 4,0 gL-1). O tratamento biológico após 40 dias em reator air lift foi capaz de remover 87 % da DQO, 92 % da DBO5, 73 % de fenóis totais, 36 % de cor e ainda 99 % da toxicidade aguda. A análise espectrométrica por FTIR confirmou a degradação por meio da redução de picos característicos. Apesar dos resultados do tratamento fúngico terem se apresentados bastante significativos, houve necessidade de complementação com processo Fenton, o que resultou numa redução de 99 % da DQO, 92 % do teor de fenóis e 96 % da cor do efluente. Desta forma, a biorremediação utilizando o fungo Pleurotus ostreatus e a combinação com o processo Fenton, apresentou resultados promissores, para enquadramento dentro da maioria dos parâmetros exigidos pela legislação. / The present work had the objective of characterizing the effluent from the Plywood Industry and evaluate the use of filamentous fungus Pleurotus ostreatus in the treatment in an air lift reactor, besides verifying the potentiality of the complementation of effluent treatment using a POA, Fenton type, in order to adjust it to the legal parameters to release it into water bodies in accord to the regulatory authorities. The brute effluent present 12.192 ± 100 mgO2L-1 of COD (Chemical Oxygen Demand), 8.849 ± 60 mgO2L-1 of BOD5,20 (Biochemical Oxygen Demand), 8.333 ± 30 color units, 1.220 ± 5 mgL-1 of total phenols and pH 4,63. The total solids content in the effluent was 18, 45 ± 0, 15 gL-1, in this total 2,73 ± 0,04 gL-1 corresponds to ashes, 1,36 ± 0,03 gL-1 soluble klason lignin and 49 ± 3 mgL-1 of insoluble klason lignin and approximately 71% toxicity expressed as inhibition to E.coli. The FTIR spectrometry of the solids of the effluent, indicated bands in 3430-3440 cm-1, 2938 cm-1, 1603 cm-1, that could be attributed to groups O-H, C-H, C=C. The biological treatment using the fungus Pleurotus ostreatus was initially optimized in an orbital incubator (shaker) by factorial design (2³) that getting the best reactional conditions to COD reduction (pH 5,7 and sucrose concentration of 7,5 gL-1 and nitrate concentration of 4,0 gL-1), being estimated a reduction of 64% of COD of effluent in 10 days. The biological treatment after 40 days in optimized conditions in air lift was capable of remove 87 % of COD of the effluent, 92 % of the BOD5,20, 72 % of reduction of total phenols, 36 % of color removal and acute toxicity reduced. The spectrometric analysis by FTIR confirmed the biological degradation by the correspondent peak reduction in relation to the characteristic peaks. Despite the results of fungal treatment being quite significant, there was a need of a complementation of treatment using AOP Fenton type, showing a reduction of 99 % of COD, 92 % of phenols content and 96 % effluents color. In this way, the bioremediation using the Pleurotus ostreatus combined with the Fenton process, presented promising results, in order to fit the majority of the parameters required by the legislation.

Resumo: As β-glucanas fúngicas apresentam uma série de respostas biológicas. Estas glucanas apresentam baixa solubilidade em meio aquoso, sendo necessário fragmentá-las em moléculas de menor peso molecular. O Botryosphaeria rhodina MAMB-05 é um ascomiceto ligninolítico produtor de uma β-(1→3)(1→6)-glucana denominada botriosferana (EPS). Estudos preliminares demonstraram que o fungo Trichoderma harzianum Rifai é capaz de crescer em EPS como única fonte de carbono e de produzir β-glucanases específicas. As condições para a produção de -1,3-glucanases pelo T. harzianum Rifai em fermentador de bancada utilizando EPS como única fonte de carbono foram otimizadas através do uso de um planejamento fatorial e análise por superfície de resposta, o qual mostrou que a produção máxima de -1,3-glucanases ocorreu em 5 dias de cultivo, com pH inicial igual a 5,5 e com aeração de 1,5 vvm. As enzimas do complexo -glucanolítico extracelular foi parcialmente purificado e utilizado para a hidrólise de botriosferana, laminarina, paramilo e pustulana. Duas frações com atividade para -glucanase (F-I e F-II) foram obtidas a partir da cromatografia de filtração em gel, as quais apresentaram diferentes modos de ação sobre o botriosferana e a laminarina. O botriosferana foi hidrolisado em cerca de 66 % pela fração F-I e em 98 % pela fração F-II, em 30 min. Os produtos de hidrólise foram principalmente constituídos por gluco-oligossacarídeos (GP ≥ 4), e menor quantidade de glucose, di- e trissacarídeos. A ação enzimática das frações F-I e F-II sobre a laminarina resultaram em 15 % de conversão do polímero em glucose, enquanto a porcentagem de sacarificação foi totalmente diferente (70 % para F-I e 25 % para F-II). Em paramilo, ambas as frações promoveram a degradação de aproximadamente 20 % do polissacarídeo após 30 min, onde somente... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Fungal β-D-glucans presents a variety of biological response. These glucans presents low solubility in water and being necessary to obtain fragments with small molecular weight. A ligninolytic ascomyceteous Botryosphaeria rhodina MAMB-05 produces a (1→3)(1→6)-β-D-glucan named botryosphaeran (EPS). Preliminary studies verified that Trichoderma harzianum Rifai is able to grown on EPS as sole carbon source and secrete specific β-glucanases to act on this subtract. Conditions for -1,3-glucanase production by T. harzianum Rifai in bench-fermenter using EPS as sole carbon source were developed using a statistical factorial design, and analysis by response surface method, which showed maximal enzyme production at 5 days growth in a minimum Vogel salts medium, with initial pH 5.5 under 1.5 vvm aeration. A -glucanolytic extracellular complex was partially-purified and used to hydrolyze fungal botryosphaeran, algal laminarin, algal paramylon and the liquen pustulan. Two -glucanase fractions (F-I and F-II) were obtained by gel permeation chromatography, which presented different modes of attack on botryosphaeran and laminarin. Botryosphaeran was 66 % hydrolyzed by the F-I fraction, and 98 % by fraction F-II, within 30 min. The main products of hydrolysis were gluco-oligosaccharides (DP ≥ 4), and lower amounts of glucose, di- and tri-saccharides. The action of enzyme fractions I and II on laminarin resulted 15 % of conversion to glucose, while the percentage of saccharification was radically different (70 % for F-I and 25 % for F-II). On paramylon, both fractions promoted approximately 20 % degradation after 30 min, and only 0.5 % corresponded to gluco-oligosaccharides (DP ≥ 4). Only F-I fraction could acted on pustulan resulting 25 % of glucose, gentiobiose and oligosaccharides (not identified), within 30 min. The difference in the hydrolysis... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Roberto da Silva / Coorientador: Aneli de Melo Barbosa / Banca: Maria de Lourdes Corradi Custódio da Silva / Banca: João Ruggiero Neto / Banca: Rubens Monti / Banca: Inês Conceição Roberto / Doutor

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Immobilized enzymes provide many advantages when compared to the usage of their free forms. Among these ones, remarkable advantages are the possibility of the biocatalyst reusability, easy separation at the end of the process, its usage in continuous way and the enhancement of its stability. This work was performed aiming the immobilization of the α-galactosidase enzyme from Aspergillus niger in ion exchange resin and the evaluation of its catalytic activity. Firstly, tests were performed in five different resins: Amberlite 252-Na, Dowex Marathon A, Dowex Marathon C, Duolite A-568 e Duolite S-761. According to the results, Duolite A-568 was chosen as the best support. Therefore, studies were done aiming the optimization of the immobilization process in this resin. Glutaraldehyde 1% (v/v) was used before the enzyme adsorption process and it enhanced the operational stability of the immobilized enzyme. Preliminary tests did not showed difference for the immobilization process at the temperatures of 25 and 40°C. A full factorial design and a central composite design were performed to study the best immobilization conditions varying the pH, the α-galactosidase concentration and the immobilization time. The results led to use the following immobilization conditions: pH 4.5; 15 g/L of α-galactosidase and 3 hours of immobilization. The temperature of maximum activity occurred at 60°C for both free and immobilized enzyme. The activation energy calculated by linear adjustment of Arrhenius equation was 5.66 kcal/mol for soluble α-galactosidase and 4.48 kcal/mol for immobilized α-galactosidase. The optimum pH range obtained for free enzyme was 4.0-5.0 and for immobilized enzyme it was 3.0-6.0. The immobilization process improved the α-galactosidase activity in alkaline pHs. Analysis of pH stability showed that both forms of enzyme were resistant for the pH ranges studied (3.5 to 7.5 for free and 3.0 to 8.0 for immobilized). However, the thermal stability of the biocatalyst immobilized in the support decreased. The kinetic studies without inhibition showed closed values of maximum speed (Vmax) for both enzyme forms (194.5 U for free and 187.7 U for immobilized). Although, the Michaelis-Menten constant (Km) of immobilized enzyme was higher than the free one (18.8 and 12.5 g/L, respectively). The hydrolysis reaction of raffinose was inhibited by the addition of the reaction products, sucrose and galactose, and the results of inhibition by galactose pointed for the competitive inhibition type. Then, storage tests of immobilized α-galactosidase showed that the enzyme maintained its activity even after 145 days when kept at the temperature of 4°C. / O uso de enzimas imobilizadas proporciona muitas vantagens em relação ao seu uso na forma livre. Dentre estas vantagens se destacam a possibilidade de reutilização do biocatalisador, a sua fácil separação ao final do processo, a utilização em modo contínuo e o aumento de sua estabilidade. Este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de imobilizar a enzima α-galactosidase de Aspergillus niger em resina de troca iônica e avaliar a sua atividade catalítica. Inicialmente, foram feitos testes preliminares de imobilização em 5 tipos de resinas: Amberlite 252-Na, Dowex Marathon A, Dowex Marathon C, Duolite A-568 e Duolite S-761. Pelos resultados obtidos, Duolite A-568 foi selecionada como melhor suporte e, portanto, estudos foram feitos para a otimização do processo de imobilização nesta resina. Glutaraldeído na concentração de 1% (v/v) foi utilizado anteriormente ao processo de adsorção da enzima e melhorou a estabilidade operacional da α-galactosidase imobilizada. Testes preliminares não indicaram diferença do processo de imobilização para temperaturas de 25 e 40°C. Realizou-se um planejamento fatorial completo e um planejamento composto central para estudar as melhores condições de imobilização variando-se o pH, concentração de α-galactosidase e tempo de imobilização. Os resultados obtidos levaram a utilizar as seguintes condições de imobilização: pH 4,5, concentração de α-galactosidase de 15 g/L e tempo de imobilização de 3 horas. A temperatura de máxima atividade enzimática foi 60°C tanto para a enzima livre quanto imobilizada. O valor da energia de ativação encontrado pelo ajuste linear da equação de Arrhenius foi de 5,66 kcal/mol para α-galactosidase solúvel e 4,48 kcal/mol para α-galactosidase imobilizada. A faixa de pH ótimo obtido para a enzima livre foi 4,0-6,0 e para a enzima imobilizada foi 3,0-6,0. O processo de imobilização melhorou a atividade da α-galactosidase para pHs mais alcalinos. A análise de resistência ao pH mostrou que ambas as formas da enzima foram resistentes para as faixas estudadas (3,5 a 7,5 para livre e 3,0 a 8,0 para imobilizada). No entanto, a resistência térmica do biocatalisador retido no suporte foi menor. O estudo cinético sem inibição apresentou valores de velocidade máxima (Vmáx) próximos para as duas formas da α-galactosidase (194,5 U para livre e 187,7 U para imobilizada), porém o Km da forma imobilizada foi maior que o da livre (18,8 g/L e 12, 5 g/L de rafinose, respectivamente). A reação de hidrólise da rafinose foi inibida pela adição dos produtos da reação, sacarose e galactose, sendo que os resultados de inibição por galactose apontam para o tipo de inibição competitiva Por fim, testes de estocagem da α-galactosidase imobilizada mostraram que a enzima manteve sua atividade mesmo após 145 dias mantida a temperatura de 4°C. / Mestre em Engenharia Química