Alternative splicing is a key mechanism by which eukaryotes generate phenotypic complexity without increasing genomic load. In vertebrate evolution, cassette exon alternative splicing is prominent with increasing phenotypic complexity and is specifically enriched in the brain. Apolipoprotein receptor 2 (Apoer2) is a neuronal alternatively spliced transmembrane receptor that binds critical extracellular ligands such as neuroprotective Reelin and Alzheimer’s disease (AD) related risk factor APOE4. Inclusion and exclusion of single exons in Apoer2 regulates isoform specific roles in neuronal processes, such as long-term potentiation (LTP) and neuronal survival. Alternative splicing of APOER2 exon 18, which encodes a functional domain critical for LTP, has been reported as dysregulated in AD. However, the full repertoire and function of APOER2 isoforms in physiological and AD conditions is not well understood. We hypothesize that combinatorial APOER2 alternative splicing events generate a diverse pool of isoforms in the human brain that can become dysregulated in AD and alter receptor function in neurons. Our overall goal is to define the APOER2 transcript pool and understand whether isoform proportions and functions are altered in AD, potentially contributing to synaptic dysfunction. In this work, we observed that Apoer2 has evolved over the course of vertebrate evolution, gaining new exons that alter function at the protein level and increasing the complexity of its alternative splicing events from zebrafish to humans. We generated the first APOER2 specific long-read RNA sequencing dataset in the human cerebral cortex, which identified 48 full-length APOER2 isoforms, some of which are unique compared to full-length murine Apoer2 isoforms and indicate that Apoer2 is spliced in a species specific manner. To determine whether splicing of APOER2 is dysregulated in AD, we generated full-length APOER2 isoform maps in Control and AD parietal cortex and hippocampus. We identified over 200 unique APOER2 isoforms in each brain region with 151 isoforms common between the two brain regions. We also identified region and disease specific APOER2 isoforms suggesting APOER2 splicing is spatially regulated and altered in AD. We found AD and Control-specific APOER2 isoforms exhibited alterations in receptor processing and cleavage patterns, indicating combinatorial splicing across APOER2 dictates protein function and is changed in AD. Sequential cleavage of Apoer2 in response to Reelin generates an intracellular domain (ICD) that translocates to the nucleus and affects transcription; however, whether APOE influences Apoer2 cleavage is unclear. We found Apoer2-ICD is generated in an APOE isoform specific manner and is generated regardless of exon 19 inclusion, which encodes part of the ICD. We generated four novel mouse lines to examine the effects of Apoer2 exon 19 inclusion and APOE isoforms (APOE3 and APOE4) on hippocampal gene expression. We found Apoer2 exon 19 inclusion modulates upregulation of genes such as Serpina3n known to be induced by APOE4 expression, which has strong implications for understanding molecular mechanisms underlying APOE4 as a risk factor in AD. Lastly, since Apoer2 exon 19 confers critical functions at the protein level, including adaptor protein binding and association with the NMDA receptor, as well as potentially modulating APOE4’s transcriptional effects, we were interested in how an RNA binding protein, Srsf1, may influence Apoer2 exon 19 splicing. We and others have found SRSF1 partially represses exon 19 inclusion in primary murine neurons. Because splicing is often modulated by neuronal activity, we examined whether Apoer2 exon 19 and Srsf1 are altered in response to activity stimulation. We found upregulation of exon 19 exclusion and no strong changes in SRSF1 expression or phosphorylation, suggesting modulation of SRSF1 is not a potent regulatory mechanism of activity induced changes in Apoer2 exon 19 splicing. Overall, we have examined the Apoer2 splicing landscape in the brain across multiple vertebrate species. We identified a rich diversity of alternatively spliced APOER2 isoforms in Control and AD brains providing novel APOER2 variants that are significantly changed in AD. These AD related APOER2 isoforms have differential functional impacts on APOER2 biology that may contribute to AD pathogenesis.

Apolipoprotein E (APOE) is one of the most important genetic risk factors for late-onset sporadic Alzheimer’s disease (LOAD). APOE is a 35 kDa glycoprotein and ligand known to bind to members of the low-density lipoprotein receptor (LDLR) family, including APOE receptor 2 (apoER2; official gene name LRP8). ApoER2 is a type I transmembrane protein with a large extracellular domain (ECD) and a short cytoplasmic tail that can be proteolytic cleaved. In addition, apoER2 is enriched in the brain and plays an important role in synaptic function and plasticity. Interestingly, the ECD of apoER2 contains several ligand binding repeats that are organized into exons with aligning phase junctions, which allows exon skipping during alternative splicing to retain protein fidelity. The amount of alternative spliced isoforms distinguishes apoER2 from the rest of the LDLR family members. In fact, mouse Apoer2 has been identified as one of the top ten neuronal genes related to cell-type exon skipping events. Regarding human APOER2, we have identified over 40 different APOER2 isoforms from human brain using gene-specific primers and amplifying the N- and C-terminal open reading frame of APOER2. The majority of APOER2 variants consist of a diverse array of exon skipping events within the ligand binding domain (LBD). We therefore, hypothesized that human APOER2 splice variants act as functionally divergent isoforms that can influence ligand binding properties, receptor proteolysis and changes to synaptic function. ApoER2 undergoes sequential proteolytic cleavage in response to ligand binding, resulting in the release of C-terminal fragments (CTFs) and transcriptionally active intracellular domain (ICD). We therefore, systematically tested whether the diversity of human N-terminal APOER2 splice variants lacking various LBDs affects APOER2 cleavage and signaling events. We found that alternative splicing of certain APOER2 exons generated different amounts of CTFs compared to full-length APOER2 (APOER2-FL). The pattern was not simply based on the number of ligand binding domains suggesting that excision of certain exons may alter the tertiary structure of the receptor sufficiently to make the receptor more or less accessible to cleavage and generation of CTFs. To further characterize APOER2 splice variants, we specifically examined APOER2 splice variants that generated the highest and lowest amounts of CTF generation compared to APOER2-FL and focused on APOER2 splice variant lacking exons 5-8 (Δ5-8) and lacking exons 4-6 (Δ4-6), respectively. The differential CTF generation of APOER2 Δ5-8 and Δ4-6 reflects the proteolytic release of the APOER2-ICD. This APOER2-ICD mediates transcriptional activation, facilitated by the Mint1 adaptor protein. To investigate whether human N-terminal APOER2 splice variants influence APOE binding and receptor cleavage properties, we used microscale thermophoresis and tested the well-validated human APOE mimetic peptide. We found that specific exons or ligand-binding cassettes differentially affect APOE peptide binding to APOER2 splice variants. In addition, APOE peptide induces generation of APOER2-CTF acutely within one hour. Functionally, we demonstrated that APOER2 is required for spontaneous neurotransmitter release in mature neurons. Loss of mouse Apoer2 robustly decreased miniature event frequency in excitatory synapses compared to heterozygous Apoer2 neurons. We found APOER2-FL fully restored the miniature event frequency in excitatory synapses but not APOER2 Δ5-8. APOER2 Δ4-6 restored the miniature event frequency similar to heterozygous Apoer2 neurons. These results suggest that different human N-terminal APOER2 splice variants have distinct and differential synaptic properties signifying a role of APOER2 splice variants as regulators of synaptic function.

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Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont les principales causes de mortalité et de morbidité à travers le monde. En Amérique du Nord, on estime à 90 millions le nombre d’individus ayant une ou plusieurs MCV, à près de 1 million le nombre de décès reliés par année et à 525 milliards de dollars les coûts directs et indirects en 2010. En collaboration avec l’équipe du Dre. Boileau, notre laboratoire a récemment identifié, le troisième locus impliqué dans l’hypercholestérolémie familiale. Une étude publiée dans le New Engl J Med a révélé que l’absence de la convertase PCSK9 réduit de 88% le risque de MCV, corrélé à une forte réduction du taux de cholestérol plasmatique (LDL-C). Il fut démontré que PCSK9 lie directement le récepteur aux lipoprotéines de faible densité (LDLR) et, par un mécanisme méconnu, favorise sa dégradation dans les endosomes/lysosomes provoquant ainsi une accumulation des particules LDL-C dans le plasma. Dans cet ouvrage, nous nous sommes intéressés à trois aspects bien distincts : [1] Quels sont les cibles de PCSK9 ? [2] Quelle voie du trafic cellulaire est impliquée dans la dégradation du LDLR par PCSK9 ? [3] Comment peut-on inhiber la fonction de PCSK9 ? [1] Nous avons démontré que PCSK9 induit la dégradation du LDLR de même que les récepteurs ApoER2 et VLDLR. Ces deux membres de la famille du LDLR (fortes homologies) sont impliqués notamment dans le métabolisme des lipides et de la mise en place de structures neuronales. De plus, nous avons remarqué que la présence de ces récepteurs favorise l’attachement cellulaire de PCSK9 et ce, indépendamment de la présence du LDLR. Cette étude a ouvert pour la première fois le spectre d’action de PCSK9 sur d’autres protéines membranaires. [2] PCSK9 étant une protéine de la voie sécrétoire, nous avons ensuite évalué l’apport des différentes voies du trafic cellulaire, soit extra- ou intracellulaire, impliquées dans la dégradation du LDLR. À l’aide de milieux conditionnées dérivés d’hépatocytes primaires, nous avons d’abord démontré que le niveau extracellulaire de PCSK9 endogène n’a pas une grande influence sur la dégradation intracellulaire du LDLR, lorsqu’incubés sur des hépatocytes provenant de souris déficientes en PCSK9 (Pcsk9-/-). Par analyses de tri cellulaire (FACS), nous avons ensuite remarqué que la surexpression de PCSK9 diminue localement les niveaux de LDLR avec peu d’effet sur les cellules voisines. Lorsque nous avons bloqué l’endocytose du LDLR dans les cellules HepG2 (lignée de cellules hépatiques pour l’étude endogène de PCSK9), nous n’avons dénoté aucun changement des niveaux protéiques du récepteur. Par contre, nous avons pu démontrer que PCSK9 favorise la dégradation du LDLR par l’intermédiaire d’une voie intracellulaire. En effet l’interruption du trafic vésiculaire entre le réseau trans-Golgien (RTG) et les endosomes (interférence à l’ARN contre les chaînes légères de clathrine ; siCLCs) prévient la dégradation du LDLR de manière PCSK9-dépendante. [3] Par immunobuvardage d’affinité, nous avons identifié que la protéine Annexine A2 (AnxA2) interagit spécifiquement avec le domaine C-terminal de PCSK9, important pour son action sur le LDLR. Plus spécifiquement, nous avons cartographié le domaine R1 (acides aminés 34 à 108) comme étant responsable de l’interaction PCSK9AnxA2 qui, jusqu’à présent, n’avait aucune fonction propre. Finalement, nous avons démontré que l’ajout d’AnxA2 prévient la dégradation du LDLR induite par PCSK9. En somme, nos travaux ont pu identifier que d’autres membres de la famille du LDLR, soit ApoER2 et VLDLR, sont sensibles à la présence de PCSK9. De plus, nous avons mis en évidence que l’intégrité du trafic intracellulaire est critique à l’action de PCSK9 sur le LDLR et ce, de manière endogène. Finalement, nous avons identifié l’Annexine A2 comme unique inhibiteur naturel pouvant interférer avec la dégradation du LDLR par PCSK9. Il est indéniable que PCSK9 soit une cible de premier choix pour contrer l’hypercholestérolémie afin de prévenir le développement de MCV. Cet ouvrage apporte donc des apports considérables dans notre compréhension des voies cellulaires impliquées, des cibles affectées et ouvre directement la porte à une approche thérapeutique à fort potentiel. / Cardiovascular disease (CVD) is the primary cause of death and morbidity worldwide, claiming about 900 000 lives yearly in North America alone. A high level of circulating LDL-cholesterol is a major risk factor positively correlated with premature development of complex CVD mainly due to a rapid buildup of lipid deposition in the arteries. In collaboration with Dre Boileau, we recently discovered that the convertase PCSK9 is the third locus of familial hypercholesterolemia. A study published in the New Eng J Med revealed that the absence of PCSK9 reduces the risk of CVD by ~88%, resulting from a strong reduction of cholesterol in the bloodstream (LDL-C). It has been shown that PCSK9 directly binds the low-density lipoprotein receptor (LDLR) and by an unknown mechanism, reroutes it towards degradation in late endosomes/lysosomes, resulting in the accumulation of LDL-C particles in plasma. In this thesis, we addressed three different aspects of PCSK9 biology: [1] What are the targets of PCSK9? [2] Which cellular trafficking components are involved in PCSK9-induced LDLR degradation? [3] How can we inhibit the function of PCSK9? [1] We first demonstrated that PCSK9 induces the degradation of the LDLR and two of its closest family members. These include the very-low-density-lipoprotein receptor (VLDLR) and apolipoprotein E receptor 2 (ApoER2) implicated in neuronal development and lipid metabolism. In addition, we demonstrated that these receptors enhance the cellular association of PCSK9 independently of the presence of the LDLR. This study represents the first evidence that PCSK9 could target other proteins for degradation, reinforcing its role as a key regulator of some members of the LDLR family. [2] Since PCSK9 is a secreted protein, we decided to investigate the contributions of both the intra- and extracellular trafficking pathways in LDLR degradation. Using conditioned media derived from mice primary hepatocytes, we showed that endogenously secreted PCSK9 was not able to influence LDLR levels of PCSK9-deficient primary hepatocytes (Pcsk9-/-). By flow cytometry (FACS), we observed that overexpression of the gain-of-function PCSK9-D374Y, but not wild type PCSK9, decreases cell surface LDLR on adjacent cells suggesting that its spectrum of action is local. We also noticed that blockade of endocytosis in HepG2 cells (commonly used to study endogenous LDLR degradation by PCSK9) does not affect total LDLR protein levels. In contrast, disruption of the intracellular trafficking between the trans-Golgi network (TGN) and endosomes (siRNAs against clathrin light chains; CLCs) prevented LDLR degradation in a PCSK9-specific manner. [3] By Far Western blotting, we identified that Annexin A2 (AnxA2) specifically interacts with the C-terminal domain of PCSK9, which is crucial for its function in LDLR degradation. Moreover, we determined that the R1 domain (amino acids 34 to 108) is responsible for the PCSK9AnxA2 interaction, which confers a new function for this protein. Finally, we showed that addition of AnxA2 prevents PCSK9-induced LDLR degradation. In summary, this work allowed us to identify that PCSK9 induces the degradation of the LDLR and its closest family members, ApoER2 and VLDLR. We also highlighted that the integrity of the intracellular trafficking pathway is crucial for endogenous PCSK9-induced LDLR degradation. Furthermore, we discovered that AnxA2 is a unique, natural inhibitor capable of interfering with the action of PCSK9 in LDLR degradation. It is undeniable that PCSK9 is a genetically validated target to reduce circulating LDL-cholesterol and prevent CVD. This thesis brings forth important contributions in our understanding of the cellular pathways involved and opens the door for novel therapeutic approaches.

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont les principales causes de mortalité et de morbidité à travers le monde. En Amérique du Nord, on estime à 90 millions le nombre d’individus ayant une ou plusieurs MCV, à près de 1 million le nombre de décès reliés par année et à 525 milliards de dollars les coûts directs et indirects en 2010. En collaboration avec l’équipe du Dre. Boileau, notre laboratoire a récemment identifié, le troisième locus impliqué dans l’hypercholestérolémie familiale. Une étude publiée dans le New Engl J Med a révélé que l’absence de la convertase PCSK9 réduit de 88% le risque de MCV, corrélé à une forte réduction du taux de cholestérol plasmatique (LDL-C). Il fut démontré que PCSK9 lie directement le récepteur aux lipoprotéines de faible densité (LDLR) et, par un mécanisme méconnu, favorise sa dégradation dans les endosomes/lysosomes provoquant ainsi une accumulation des particules LDL-C dans le plasma. Dans cet ouvrage, nous nous sommes intéressés à trois aspects bien distincts : [1] Quels sont les cibles de PCSK9 ? [2] Quelle voie du trafic cellulaire est impliquée dans la dégradation du LDLR par PCSK9 ? [3] Comment peut-on inhiber la fonction de PCSK9 ? [1] Nous avons démontré que PCSK9 induit la dégradation du LDLR de même que les récepteurs ApoER2 et VLDLR. Ces deux membres de la famille du LDLR (fortes homologies) sont impliqués notamment dans le métabolisme des lipides et de la mise en place de structures neuronales. De plus, nous avons remarqué que la présence de ces récepteurs favorise l’attachement cellulaire de PCSK9 et ce, indépendamment de la présence du LDLR. Cette étude a ouvert pour la première fois le spectre d’action de PCSK9 sur d’autres protéines membranaires. [2] PCSK9 étant une protéine de la voie sécrétoire, nous avons ensuite évalué l’apport des différentes voies du trafic cellulaire, soit extra- ou intracellulaire, impliquées dans la dégradation du LDLR. À l’aide de milieux conditionnées dérivés d’hépatocytes primaires, nous avons d’abord démontré que le niveau extracellulaire de PCSK9 endogène n’a pas une grande influence sur la dégradation intracellulaire du LDLR, lorsqu’incubés sur des hépatocytes provenant de souris déficientes en PCSK9 (Pcsk9-/-). Par analyses de tri cellulaire (FACS), nous avons ensuite remarqué que la surexpression de PCSK9 diminue localement les niveaux de LDLR avec peu d’effet sur les cellules voisines. Lorsque nous avons bloqué l’endocytose du LDLR dans les cellules HepG2 (lignée de cellules hépatiques pour l’étude endogène de PCSK9), nous n’avons dénoté aucun changement des niveaux protéiques du récepteur. Par contre, nous avons pu démontrer que PCSK9 favorise la dégradation du LDLR par l’intermédiaire d’une voie intracellulaire. En effet l’interruption du trafic vésiculaire entre le réseau trans-Golgien (RTG) et les endosomes (interférence à l’ARN contre les chaînes légères de clathrine ; siCLCs) prévient la dégradation du LDLR de manière PCSK9-dépendante. [3] Par immunobuvardage d’affinité, nous avons identifié que la protéine Annexine A2 (AnxA2) interagit spécifiquement avec le domaine C-terminal de PCSK9, important pour son action sur le LDLR. Plus spécifiquement, nous avons cartographié le domaine R1 (acides aminés 34 à 108) comme étant responsable de l’interaction PCSK9AnxA2 qui, jusqu’à présent, n’avait aucune fonction propre. Finalement, nous avons démontré que l’ajout d’AnxA2 prévient la dégradation du LDLR induite par PCSK9. En somme, nos travaux ont pu identifier que d’autres membres de la famille du LDLR, soit ApoER2 et VLDLR, sont sensibles à la présence de PCSK9. De plus, nous avons mis en évidence que l’intégrité du trafic intracellulaire est critique à l’action de PCSK9 sur le LDLR et ce, de manière endogène. Finalement, nous avons identifié l’Annexine A2 comme unique inhibiteur naturel pouvant interférer avec la dégradation du LDLR par PCSK9. Il est indéniable que PCSK9 soit une cible de premier choix pour contrer l’hypercholestérolémie afin de prévenir le développement de MCV. Cet ouvrage apporte donc des apports considérables dans notre compréhension des voies cellulaires impliquées, des cibles affectées et ouvre directement la porte à une approche thérapeutique à fort potentiel. / Cardiovascular disease (CVD) is the primary cause of death and morbidity worldwide, claiming about 900 000 lives yearly in North America alone. A high level of circulating LDL-cholesterol is a major risk factor positively correlated with premature development of complex CVD mainly due to a rapid buildup of lipid deposition in the arteries. In collaboration with Dre Boileau, we recently discovered that the convertase PCSK9 is the third locus of familial hypercholesterolemia. A study published in the New Eng J Med revealed that the absence of PCSK9 reduces the risk of CVD by ~88%, resulting from a strong reduction of cholesterol in the bloodstream (LDL-C). It has been shown that PCSK9 directly binds the low-density lipoprotein receptor (LDLR) and by an unknown mechanism, reroutes it towards degradation in late endosomes/lysosomes, resulting in the accumulation of LDL-C particles in plasma. In this thesis, we addressed three different aspects of PCSK9 biology: [1] What are the targets of PCSK9? [2] Which cellular trafficking components are involved in PCSK9-induced LDLR degradation? [3] How can we inhibit the function of PCSK9? [1] We first demonstrated that PCSK9 induces the degradation of the LDLR and two of its closest family members. These include the very-low-density-lipoprotein receptor (VLDLR) and apolipoprotein E receptor 2 (ApoER2) implicated in neuronal development and lipid metabolism. In addition, we demonstrated that these receptors enhance the cellular association of PCSK9 independently of the presence of the LDLR. This study represents the first evidence that PCSK9 could target other proteins for degradation, reinforcing its role as a key regulator of some members of the LDLR family. [2] Since PCSK9 is a secreted protein, we decided to investigate the contributions of both the intra- and extracellular trafficking pathways in LDLR degradation. Using conditioned media derived from mice primary hepatocytes, we showed that endogenously secreted PCSK9 was not able to influence LDLR levels of PCSK9-deficient primary hepatocytes (Pcsk9-/-). By flow cytometry (FACS), we observed that overexpression of the gain-of-function PCSK9-D374Y, but not wild type PCSK9, decreases cell surface LDLR on adjacent cells suggesting that its spectrum of action is local. We also noticed that blockade of endocytosis in HepG2 cells (commonly used to study endogenous LDLR degradation by PCSK9) does not affect total LDLR protein levels. In contrast, disruption of the intracellular trafficking between the trans-Golgi network (TGN) and endosomes (siRNAs against clathrin light chains; CLCs) prevented LDLR degradation in a PCSK9-specific manner. [3] By Far Western blotting, we identified that Annexin A2 (AnxA2) specifically interacts with the C-terminal domain of PCSK9, which is crucial for its function in LDLR degradation. Moreover, we determined that the R1 domain (amino acids 34 to 108) is responsible for the PCSK9AnxA2 interaction, which confers a new function for this protein. Finally, we showed that addition of AnxA2 prevents PCSK9-induced LDLR degradation. In summary, this work allowed us to identify that PCSK9 induces the degradation of the LDLR and its closest family members, ApoER2 and VLDLR. We also highlighted that the integrity of the intracellular trafficking pathway is crucial for endogenous PCSK9-induced LDLR degradation. Furthermore, we discovered that AnxA2 is a unique, natural inhibitor capable of interfering with the action of PCSK9 in LDLR degradation. It is undeniable that PCSK9 is a genetically validated target to reduce circulating LDL-cholesterol and prevent CVD. This thesis brings forth important contributions in our understanding of the cellular pathways involved and opens the door for novel therapeutic approaches.