A 2,8-DHA Urolitíase é uma doença resultante de uma desordem hereditária que leva a deficiência de atividade da enzima APRT do grupo das PRTases. Até o momento, foram encontradas 18 mutações em pacientes, das quais 7 são missense. O presente trabalho dedica-se ao estudo funcional e estrutural dessas 7 mutações e da deleção ΔF173. Construções dos mutantes D65V, L110P, M136T, R67Q, R89Q, I112F e F173G foram obtidas no vetor pET-29a(+) e clonados em E. coli. Os protocolos de expressão e purificação foram estabelecidos, onde as enzimas foram obtidas após uma etapa cromatográfica na coluna CHTTM Hidroxiapatita Cerâmica no grau de pureza necessário. A única exceção foi o mutante I112F que se mostrou insolúvel durante a expressão. Um ensaio cinético acoplado através de kit para detecção de PPi foi padronizado e permitiu a caracterização cinética da hAPRT nativa e de seu mutantes. Os mutantes apresentaram perdas de eficiência de uma ordem de magnitude, com exceção do F173G, cujos valores foram comparáveis aos da hAPRT nativa. Ensaios de cristalização foram realizados para todos os mutantes e resultaram em cristais para os mutantes F173G, R67Q e R89Q. Esses cristais foram coletados na linha de Cristalografia de Macromoléculas 2 no LNLS. Os conjuntos de dados estão sendo analisados e as estruturas estão em fase final de refinamento. / 2,8-DHA Urolithiasis is a disease resulting from an inherited disorder that leads to deficiency of APRT, an enzyme of the PRTases group. So far, 18 mutations were found in patients, 7 of which are missense. This work is dedicated to the functional and structural study of these 7 mutations and the deletion ΔF173. Mutants constructions D65V, L110P, M136T, R67Q, R89Q, I112F and F173G were obtained in the vector pET-29a (+) and cloned in E. coli. The expression and purification protocols were established and the enzymes were obtained after 1 chromatographic step using the CHTTM Hydroxyapatite Ceramics column in the required purity. The only exception was the mutant I112F that resulted insoluble during expression. A coupled kinetic assay using PPi detection kit was standardized and allowed the kinetic characterization of native hAPRT and its mutants. The mutants had an efficiency loss of an order of magnitude, with the exception of F173G, whose values were comparable to those of native hAPRT. Crystallization trials were performed for all mutants and resulted in crystals for mutants F173G, R67Q and R89Q. These crystals were collected on Macromolecules Crystallography 2 line at LNLS. The datasets are being analyzed and the structures are in the final stages of refinement.

A 2,8-DHA Urolitíase é uma doença resultante de uma desordem hereditária que leva a deficiência de atividade da enzima APRT do grupo das PRTases. Até o momento, foram encontradas 18 mutações em pacientes, das quais 7 são missense. O presente trabalho dedica-se ao estudo funcional e estrutural dessas 7 mutações e da deleção ΔF173. Construções dos mutantes D65V, L110P, M136T, R67Q, R89Q, I112F e F173G foram obtidas no vetor pET-29a(+) e clonados em E. coli. Os protocolos de expressão e purificação foram estabelecidos, onde as enzimas foram obtidas após uma etapa cromatográfica na coluna CHTTM Hidroxiapatita Cerâmica no grau de pureza necessário. A única exceção foi o mutante I112F que se mostrou insolúvel durante a expressão. Um ensaio cinético acoplado através de kit para detecção de PPi foi padronizado e permitiu a caracterização cinética da hAPRT nativa e de seu mutantes. Os mutantes apresentaram perdas de eficiência de uma ordem de magnitude, com exceção do F173G, cujos valores foram comparáveis aos da hAPRT nativa. Ensaios de cristalização foram realizados para todos os mutantes e resultaram em cristais para os mutantes F173G, R67Q e R89Q. Esses cristais foram coletados na linha de Cristalografia de Macromoléculas 2 no LNLS. Os conjuntos de dados estão sendo analisados e as estruturas estão em fase final de refinamento. / 2,8-DHA Urolithiasis is a disease resulting from an inherited disorder that leads to deficiency of APRT, an enzyme of the PRTases group. So far, 18 mutations were found in patients, 7 of which are missense. This work is dedicated to the functional and structural study of these 7 mutations and the deletion ΔF173. Mutants constructions D65V, L110P, M136T, R67Q, R89Q, I112F and F173G were obtained in the vector pET-29a (+) and cloned in E. coli. The expression and purification protocols were established and the enzymes were obtained after 1 chromatographic step using the CHTTM Hydroxyapatite Ceramics column in the required purity. The only exception was the mutant I112F that resulted insoluble during expression. A coupled kinetic assay using PPi detection kit was standardized and allowed the kinetic characterization of native hAPRT and its mutants. The mutants had an efficiency loss of an order of magnitude, with the exception of F173G, whose values were comparable to those of native hAPRT. Crystallization trials were performed for all mutants and resulted in crystals for mutants F173G, R67Q and R89Q. These crystals were collected on Macromolecules Crystallography 2 line at LNLS. The datasets are being analyzed and the structures are in the final stages of refinement.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

A Adenina Fosforibosiltransferase (APRT E.C. 2.4.2.7) pertence à família de enzimas Fosforibosil Transferases (PRTase) do Tipo I , que catalisa a conversão reversível de Adenina e 5-fosfo-α-D-ribose-1-difosfato (PRPP) em difosfato e adenosina monofosfato, um importante precursor energético da célula. A APRT integra a via de salvação de purinas, única forma de suprir o balanço de purinas em Schistosoma mansoni. Este trabalho apresenta o isolamento, clonagem, expressão heteróloga e purificação da APRT de S. mansoni a fim de caracterizá-la quanto seus parâmetros físico-químicos. Não se obtendo cristais de proteína, foram elaborados modelos tridimensionais por homologia para estudos de dinâmica molecular e avaliação conformacional via tCONCOORD. A estrutura de APRT humana foi usada como controle nas simulações. Os dados computacionais e de biologia molecular foram comparados entre si para validação mútua e, verificou-se que a análise cuidadosa de dados computacionais é capaz de fornecer informações críticas sobre a APRT, auxiliando e guiando os estudos experimentais. Ainda, as simulações de dinâmica molecular foram capazes de evidenciar a abertura de loops do sítio ativo, explicitar a importância da análise de rotâmeros em modelos, permitindo, então, rearranjar da forma correta resíduos erroneamente modelados. Por fim, um estudo envolvendo mecanismo catalítico sugere a participação de uma molécula de água abstraindo o próton ligado ao N9 da adenina e, para efeito de comparação, um mecanismo alternativo independente desta participação também foi descrito. Ambas as observações expandem a corrente visão sobre o mecanismo catalítico de APRTs. / The Adenine Phoshoribosyltransferase (APRT E.C.2.4.2.7) belongs to the Phosphoribosyltransferase enzyme family (PRTase) of type I which catalyzes the reversible conversion of adenine and 5-phospho-α-D-ribose-1-diphosphate (PRPP) in diphosphate and adenosine monophosphate, an important source of this compound for the cell. APRT is involved in the purine salvage pathway, the only way that Schistosoma mansoni has to supply its purine demands. This work shows the isolation, cloning, heterologous expression and the purification of APRT from S. mansoni in order to establish its physical chemical and kinetics parameters. Since crystallographic structure was not obtained, we built homology models to perform molecular dynamics experiments and conformational evaluation via tCONCOORD. The human APRT structure was used as control in the simulation experiments. The computational and molecular biology data were compared for consistency and the detailed analysis of the former allowed us to improve experimental manipulation of APRT. The molecular dynamics experiments showed the opening of the loops of the catalytic binding site and the key function of rotamers. Finally, we were able to suggest that a water molecule may catch the proton of adenine N9. Both observations improve the current view of APRT catalytic mechanism.

A Adenina Fosforibosiltransferase (APRT E.C. 2.4.2.7) pertence à família de enzimas Fosforibosil Transferases (PRTase) do Tipo I , que catalisa a conversão reversível de Adenina e 5-fosfo-α-D-ribose-1-difosfato (PRPP) em difosfato e adenosina monofosfato, um importante precursor energético da célula. A APRT integra a via de salvação de purinas, única forma de suprir o balanço de purinas em Schistosoma mansoni. Este trabalho apresenta o isolamento, clonagem, expressão heteróloga e purificação da APRT de S. mansoni a fim de caracterizá-la quanto seus parâmetros físico-químicos. Não se obtendo cristais de proteína, foram elaborados modelos tridimensionais por homologia para estudos de dinâmica molecular e avaliação conformacional via tCONCOORD. A estrutura de APRT humana foi usada como controle nas simulações. Os dados computacionais e de biologia molecular foram comparados entre si para validação mútua e, verificou-se que a análise cuidadosa de dados computacionais é capaz de fornecer informações críticas sobre a APRT, auxiliando e guiando os estudos experimentais. Ainda, as simulações de dinâmica molecular foram capazes de evidenciar a abertura de loops do sítio ativo, explicitar a importância da análise de rotâmeros em modelos, permitindo, então, rearranjar da forma correta resíduos erroneamente modelados. Por fim, um estudo envolvendo mecanismo catalítico sugere a participação de uma molécula de água abstraindo o próton ligado ao N9 da adenina e, para efeito de comparação, um mecanismo alternativo independente desta participação também foi descrito. Ambas as observações expandem a corrente visão sobre o mecanismo catalítico de APRTs. / The Adenine Phoshoribosyltransferase (APRT E.C.2.4.2.7) belongs to the Phosphoribosyltransferase enzyme family (PRTase) of type I which catalyzes the reversible conversion of adenine and 5-phospho-α-D-ribose-1-diphosphate (PRPP) in diphosphate and adenosine monophosphate, an important source of this compound for the cell. APRT is involved in the purine salvage pathway, the only way that Schistosoma mansoni has to supply its purine demands. This work shows the isolation, cloning, heterologous expression and the purification of APRT from S. mansoni in order to establish its physical chemical and kinetics parameters. Since crystallographic structure was not obtained, we built homology models to perform molecular dynamics experiments and conformational evaluation via tCONCOORD. The human APRT structure was used as control in the simulation experiments. The computational and molecular biology data were compared for consistency and the detailed analysis of the former allowed us to improve experimental manipulation of APRT. The molecular dynamics experiments showed the opening of the loops of the catalytic binding site and the key function of rotamers. Finally, we were able to suggest that a water molecule may catch the proton of adenine N9. Both observations improve the current view of APRT catalytic mechanism.

Esta tese apresenta em sua introdução uma revisão bibliografia sobre a importância das enzimas Fosforribosil-transferases (PRTases) para a homeostase tanto em células de mamíferos como em células de protozoários Kinetoplastidas. É ressaltada a estreita relação entre mutações pontuais encontradas no gene da enzima Adenina Fosforribosiltransferase (APRT) e a doença humana Dihidroxiadenina Urolitiase. A doença leishmaniose, causada por Kinetoplastidas do gênero Leishmania, é descrita indicando a possível utilização das enzimas da via de recuperação de purinas como alvos para o desenvolvimento de novos medicamentos contra leishmaniose. Os experimentos descritos nesta tese, visam a produção heteróloga da enzima (APRT) de Homo sapiens, elucidação da estrutura cristalográfica e análise estrutural das mutações encontradas em pacientes com Dihidroxiadenina Urolitiase. A proteína homóloga de Leishmania terentolae também foi objetivo de estudo. Com essa APRT, os experimentos descritos nesta tese visam a elucidação da estrutura tridimensional e a utilização da enzima na busca de novos inibidores de PRTases. Os resultados apresentados nesta tese mostram que os objetivos do estudo foram alcançados. A elucidação da estrutura da APRT de H. sapiens possibilitou discutir as prováveis alterações estruturais provocadas pelas mutações pontuais do gene da APRT. Novos inibidores de PRTases de Leishmania foram obtidos. Adicionalmente, os inibidores das enzimas foram testados em culturas de Leishmania major promastigota e promoveram inibição do crescimento do parasita. / This thesis in its introduction presents a brief bibliografic revision about the importance of the phosphoribosyltransferase enzyme (PRTases) to cellular homeostasis, both in mammalian cell as in the protozoa Kinetoplastida. It is emphasized the close relation between point mutatons found in the gene coding for Adenine phosphoribosyltransferase (APRT) and disease Dihidroxiadenine Urolitiasis. The deseases leishmaniasis, caused by Kinetoplastidae beloing to the Leishmania genera, is described indicating the possible use of the purine salvage pathway (PRTases) as targets for the future development of novel drugs against leishmaniasis. The experience described in this thesis aims at the heterologous production of the enzyme APRT of Homo sapiens, its crystallographic structure elucidation and structural analysis of mutations found in patient with Dihidroxiadenine Urolitiasis. The Leishmania tarentolae homologue was also the aim of this work. With this APRT the experiments describes in this thesis aim at the structural resolution of the enzyme and its use in the screening for novel PRTases inhibitors. The results presented in this thesis show that the objectives of the work have been achieved. The structural elucidation of the human APRT allowed the discussion of the potential modifications caused bu the point mutations in the APRT gene. Novel inhibitors of PRTases of Leishmania major promastigote cultures and promoted the growth inhibition of this parasite.

Submitted by Luciana Sebin (lusebin@ufscar.br) on 2016-09-27T12:08:38Z No. of bitstreams: 1 DissLP.pdf: 10003873 bytes, checksum: 89fb02c36205a1922829c70d0aa75ff4 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-27T19:56:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissLP.pdf: 10003873 bytes, checksum: 89fb02c36205a1922829c70d0aa75ff4 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-27T19:56:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissLP.pdf: 10003873 bytes, checksum: 89fb02c36205a1922829c70d0aa75ff4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-27T19:56:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissLP.pdf: 10003873 bytes, checksum: 89fb02c36205a1922829c70d0aa75ff4 (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Schistosomiasis mansoni is a disease caused by Schistosoma mansoni, it affects about 8 million people in Brazil and it is a neglected disease. Moreover, it is necessary to develop new tools for its control, since for over 40 years the same drug has been used to treat it. Thus, the search for vaccines is of great value for the control of schistosomiasis. In this study, we evaluated two recombinant enzymes of S. mansoni, the MTAP and APRT as immunogens, and checked the antiparasitic and anti-inflammatory effects in the schistosomiasis murine model. By means of prior immunization with MTAP and/or APRT, we analyzed, after the infection with S. mansoni, the host response to parasite board determination, immunological cytokines and histopathological changes in the liver of these animals. Our data showed that the MTAP enzyme was able to decrease the number of adult worms in previously immunized animals; APRT enzyme and/or the mix of the two enzymes induced reduction of inflammation in the liver of animals and promoted collagen deposition control; and MTAP enzyme and the mix stimulated a humoral immune response with production of IgG1 and IgE antibodies. Hence we suggest that the enzymes have potential for new studies that would seek a future vaccine target for the control of schistosomiasis. / A esquistossomose mansônica é uma doença causada pelo agente etiológico Schistosoma mansoni, acomete cerca de 8 milhões de brasileiros, sendo considerada uma doença negligenciada. Assim, faz-se necessário o desenvolvimento de novas ferramentas para o seu controle, visto que há mais de 40 anos usa-se o mesmo fármaco para o seu tratamento. Dessa forma, a busca por vacinas é de grande valia para o controle da esquistossomose mansônica. Neste estudo, avaliamos duas enzimas recombinantes de S. mansoni, a MTAP e a APRT, como imunógenos e verificamos o efeito antiparasitário e anti-inflamatório no modelo murino da esquistossomose mansônica. Por meio da imunização prévia com MTAP e/ou APRT e após a infecção com S. mansoni, analisamos a resposta do hospedeiro com determinação da carga parasitária, as citocinas imunológicas e as alterações histopatológicas no fígado desses animais. Dessa forma, nossos dados mostraram que a enzima MTAP foi capaz diminuir o número de vermes adultos nos animais previamente imunizados. A imunização com a enzima APRT e/ou com o mix das duas enzimas induziu redução do processo inflamatório no fígado dos animais e promoveu controle do depósito de colágeno. E durante a avaliação da resposta humoral a imunização com a enzima MTAP e o mix estimulou uma resposta específica com produção de anticorpos IgG1 e IgE. Assim, sugerimos que, as enzimas apresentam potencial para novos estudos que buscam um futuro alvo vacinal para o controle da esquistossomose mansônica.

Esta tese apresenta em sua introdução uma revisão bibliografia sobre a importância das enzimas Fosforribosil-transferases (PRTases) para a homeostase tanto em células de mamíferos como em células de protozoários Kinetoplastidas. É ressaltada a estreita relação entre mutações pontuais encontradas no gene da enzima Adenina Fosforribosiltransferase (APRT) e a doença humana Dihidroxiadenina Urolitiase. A doença leishmaniose, causada por Kinetoplastidas do gênero Leishmania, é descrita indicando a possível utilização das enzimas da via de recuperação de purinas como alvos para o desenvolvimento de novos medicamentos contra leishmaniose. Os experimentos descritos nesta tese, visam a produção heteróloga da enzima (APRT) de Homo sapiens, elucidação da estrutura cristalográfica e análise estrutural das mutações encontradas em pacientes com Dihidroxiadenina Urolitiase. A proteína homóloga de Leishmania terentolae também foi objetivo de estudo. Com essa APRT, os experimentos descritos nesta tese visam a elucidação da estrutura tridimensional e a utilização da enzima na busca de novos inibidores de PRTases. Os resultados apresentados nesta tese mostram que os objetivos do estudo foram alcançados. A elucidação da estrutura da APRT de H. sapiens possibilitou discutir as prováveis alterações estruturais provocadas pelas mutações pontuais do gene da APRT. Novos inibidores de PRTases de Leishmania foram obtidos. Adicionalmente, os inibidores das enzimas foram testados em culturas de Leishmania major promastigota e promoveram inibição do crescimento do parasita. / This thesis in its introduction presents a brief bibliografic revision about the importance of the phosphoribosyltransferase enzyme (PRTases) to cellular homeostasis, both in mammalian cell as in the protozoa Kinetoplastida. It is emphasized the close relation between point mutatons found in the gene coding for Adenine phosphoribosyltransferase (APRT) and disease Dihidroxiadenine Urolitiasis. The deseases leishmaniasis, caused by Kinetoplastidae beloing to the Leishmania genera, is described indicating the possible use of the purine salvage pathway (PRTases) as targets for the future development of novel drugs against leishmaniasis. The experience described in this thesis aims at the heterologous production of the enzyme APRT of Homo sapiens, its crystallographic structure elucidation and structural analysis of mutations found in patient with Dihidroxiadenine Urolitiasis. The Leishmania tarentolae homologue was also the aim of this work. With this APRT the experiments describes in this thesis aim at the structural resolution of the enzyme and its use in the screening for novel PRTases inhibitors. The results presented in this thesis show that the objectives of the work have been achieved. The structural elucidation of the human APRT allowed the discussion of the potential modifications caused bu the point mutations in the APRT gene. Novel inhibitors of PRTases of Leishmania major promastigote cultures and promoted the growth inhibition of this parasite.

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