Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr.: f. 174-206. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Cette thèse de doctorat présente quatre études portant sur la détection des agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme. Tout d’abord, un rappel historique des guerres biologiques et du bioterrorisme permettra de mieux comprendre cette menace. Pour cibler la problématique actuelle, les agents biologiques, les procédures d’intervention des organisations de sécurité et de santé publique ainsi que les méthodes de détection seront ensuite introduites. La capacité de détection rapide des agents biologiques est une des lacunes importantes des procédures d’intervention. La détection et l’identification de ces agents biologiques nécessitent plusieurs étapes critiques interreliées. Elles consistent en l’échantillonnage, la préparation des analytes contenues dans des matrices complexes et finalement l’identification du micro-organisme en décodant des macromolécules signatures, et ce, notamment par des méthodes génotypiques. Certaines particules peuvent potentiellement être employées pour la préparation d’armes biologiques aéroportées. De plus, des poudres inoffensives (p. ex., farine) peuvent être utilisées pour terroriser certains individus, des organisations ou la population. Ces composés peuvent toutefois interférer avec les méthodes de détection moléculaire. C’est pourquoi la première étude traite de l’interférence sur la détection par la PCR de 23 échantillons poudreux ou environnementaux autres. Cet article présente une méthode séparant des spores de Bacillus de matrices poudreuses afin d’enlever ces particules nuisibles à la détection. La procédure conceptualisée est simple d’exécution (10 étapes), rapide (≤ 10 minutes), peu coûteuse (~ 10 $) et permet de traiter une plus grande variété d’échantillons par rapport à l’art antérieur. En second lieu, une lyse de spores bactériennes basée sur la sonication rapide (45 secondes) a permis d’extraire l’ADN génomique avec des rendements comparables à une autre méthode de lyse commercialisée performante nécessitant cinq minutes. Le Module fluidique de lyse ultrasonique a été confectionné pour être décontaminé et transféré d’une zone contaminée à une zone sécurisée, ce qui est un avantage important dans le contexte du bioterrorisme. Le troisième projet concerne le développement d’un essai de détection basé sur l’amplification PCR de type large spectre du gène tuf et l’identification sur biopuce de séquences d’ADN signatures grâce à une hybridation en microfluidique. Cet essai a permis de détecter rapidement (75 minutes) 12 des 13 agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme listés par les CDC. Finalement, les analyses de séquences du gène cible, tuf, chez le genre Yersinia, ont montré un haut niveau de divergence entre les gènes dupliqués intragénomiques, tufA et tufB (8,3 à 16,2 %). Ce résultat inattendu pourrait montrer les circonstances particulières permettant à des gènes dupliqués d’acquérir de nouvelles fonctions. De plus, cette étude a permis de faire une analyse phylogénétique de 14 des 17 espèces décrites du genre Yersinia et d’apporter des informations sur leur classification taxonomique. Prochainement, il serait intéressant de juxtaposer les différentes étapes de détection des agents biologiques présentées ici dans un système intégré d’analyse totale. Par conséquent, l’automatisation pourrait faciliter leur utilisation sur le terrain pour détecter et identifier rapidement (~1 h) des agents biologiques associés au bioterrorisme permettant de prendre en charge les victimes plus efficacement et de contribuer à enrayer la propagation. / This doctoral thesis presents four studies regarding the detection of airborne bacterial biothreat agents. First of all, a historical review of biological warfare and bioterrorism will allow for better understanding of this threat. To focus on the current problematic, biological agents, intervention procedures of public security and health organisations, as well as detection methods will then be introduced. The lack of systems for the reliable and rapid detection of biological agents is an important limitation of intervention procedures. Many interrelated steps are required to detect and identify biological agents. They consist of sampling, sample matrix processing, and finally, microbial identification by decoding macromolecule signatures, notably using genotyping methods. Some particles potentially employed to produce airborne biological weapons could interfere with molecular detection methods. Moreover, inoffensive powders (e.g. flour) can be used as hoaxes to terrorise individuals, organisations, or the population. Therefore, the first article studied the interference on PCR detection of 23 powdery or other environmental samples. This study presents a method to separate Bacillus spores from powdery matrices to alleviate the impact of these interfering compounds. The developed procedure is fast (≤10 minutes), inexpensive (~ 10$), allows easy handling (10 steps) and treatment of a wider sample variety compared to prior art. Secondly, a bacterial spore lysis based on rapid sonication (45 seconds) allowed extraction of genomic DNA in yields comparable to a robust commercialised lysis procedure requiring 5 minutes. The Fluidic Ultrasonic Lysis Module can be decontaminated and transferred from a contaminated to a secured area, which is advantageous in the context of bioterrorism. The third project shows the development of a detection assay based on a bacterial broad-spectrum PCR amplification of the target gene tuf and the identification of signature DNA sequences using a microfluidic microarray system. This assay allowed the rapid (75 minutes) detection of 12 of the 13 airborne bacterial biothreat agents listed by the CDC. Finally, analyses of tuf gene sequences from the Yersinia genus showed a high level of divergence between intra-genomic tufA and tufB sequences (8.3 to 16.2 %). This unexpected result could reveal particular circumstances allowing duplicated genes to acquire new functions. Moreover, this study allowed a phylogenetic analysis of 14 of the 17 described Yersinia species and added information about their taxonomical classification. In the near future, it would be interesting to combine the different biothreat detection steps presented here into a total analysis system. Hence, automation could facilitate its utilisation in the field to detect and identify (~1 h) biothreat agents resulting in more efficient medical management of victims and contribute to stop propagation.

L'introduction délibérée dans l'air de microorganismes pathogènes représente une menace. Parmi les armes bactériologiques les plus craintes, on retrouve les spores de Bacillus anthracis. La possibilité de faire face à des souches de B. anthracis, porteuses de résistances aux antibiotiques, est bien réelle. Le but du projet est de développer une méthode rapide de détection des résistances aux antibiotiques pour les spores de Bacillus sp. Cette méthode doit pouvoir être utilisée avec un système de détection permettant une analyse cellule par cellule. Les techniques de FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) et de PCR in situ sont appropriées dans cette situation. Présentement, le seul protocole de perméabilisation des spores de Bacillus sp. pour la détection in situ nécessite trois jours. Les objectifs spécifiques de cette thèse étaient de (i) développer un protocole de perméabilisation rapide des spores permettant de faire du FISH et (ii) développer des méthodes in situ afin de détecter des séquences de gènes de résistance aux antibiotiques d'origines plasmidique et chromosomique. Deux approches ont été utilisées pour perméabiliser les spores soit la germination rapide et la perméabilisation directe. Ensuite, les techniques d'amplification enzymatique du signal FISH et de PCR in situ ont été mises au point pour les spores. Des souches simulantes nonpathogènes de B. anthracis, soit B. aetropheus et B. cereus ATCC 14579 ont été utilisées comme modèle pour les expériences. La germination rapide des spores permet une détection par FISH en moins de deux heures comparativement à la perméabilisation directe des spores qui permet une détection en moins d'une heure. Les techniques d'amplification enzymatique du signal FISH et le PCR in situ ont permis la détection du gène de résistance au chloramphénicole présent sur le plasmide à haute copie pC 194. Le PCR in situ a permis la détection du gène de résistance à l'érythromycine porté par le plasmide à faible copie pMTL ainsi que d'une mutation, d'origine chromosomique, responsable de la résistance à la rifampicine. Cette thèse démontre qu'il est possible de détecter, directement dans la spore de Bacillus sp., des gènes de résistance aux antibiotiques, même s'ils sont présents en faible nombre de copies.

Avec l'augmentation des menaces asymétriques partout sur la planète depuis le début des années 1990s impliquant des armes produisant de forts dommages par rapport à leurs coûts, plusieurs types d'armes biologiques sont devenus une menace d'importance croissante dans le théâtre militaire ainsi que dans le monde civil. Les armes biologiques peuvent êtres facilement dissimulées sur une personne. Elles sont difficilement détectables et leurs déploiements peuvent causer des dommages psychologiques incommensurables sur les populations affectées, assmant un ravage souvent loin au delà de leur emplacement physique. Pour essayer de diminuer l'efficacité de ces armes, des méthodes pour détecter et distinguer en retrait les agents biologiques parmi les autres aérosols naturels présents dans l'atmosphère sont actuellement en développement. Recherche et Développement pour la Défense Canada (RDDC) et le gouvernement du Canada explorent actuellement les LIDARs comme la technologie principale visant la détection à distance d'organismes biologiques. Toutes informations pouvant êtres récoltées à propos des armes biologiques en utilisant cette technologie sont utiles à l'avancement de la cause de la biodétection à distance. Ce rapport présente les résultats d'un projet ayant pom but de décrire les effets de l'âge des bactéries sur leurs propriétés spectrales de fluorescence en utilisant la technologie LIDAR. Les expériences ont été exécutées dans une chambre hermétique LIDAR de laboratoire sur des simulants d'agents biologiques connues, trois desquelles (2 souches de Bacillus subtilis var. niger identifiées comme BGnew et BGold et une souche de Bacillus thuringiensis identifié comme BT) étant des simulants de la bactérie Bacillus anthracis (l'anthrax), sans doute l'agent biologique le plus probable à être utilisé, et l'autre (Erwinia herbicola identifié comme EH) étant un simulant de Yersinia pestis (la peste). Les bactéries étaient mélangées avec leur milieu de culture, soit le ± Tryptic soy broth ¿ (TSB). Bien que plus de tests soient nécessaires afin de pouvoir finaliser des conclusions plus robustes, certaines tendances ont été observées. Le mélange de Erwinia herbicola a montré une fluorescence induite ayant une tendance vers les courtes longueurs d'ondes lorsque la culture était plus âgée. Le mélange de Bacillus thuringiensis (BT) a démontré une petite tendance vers les longues longueurs d'ondes avec l'âge. Les deux différentes souches de Bacillus globigii ont montrées des fluorescences induites ayant des tendances vers les courtes longueurs d'ondes après un mois et vers les longues longueurs d'ondes après trois mois. En bref, la signature de fluorescence semble dépendre de l'âge du mélange bactérie-bouillon de culture bien que cet effet varie en fonction du type mélange. Certains mélanges étaient plus efficaces à produire de la fluorescence que d'autres. Le mélange de BGnew-ljour a démontré la plus haute efficacité de fluorescence tandis que BG_old-3mois, BGold-ljour et EH-ljour ont démontrés les plus faibles. Nos résultats démontrent que la signature spectrale d'une bactérie est influencée par le temps d'incubation dans son milieu de culture. Cette information est très importante lors de l'élaboration de banques de signatures standardisées servant à la classification bactérienne à distance dans le cadre d'intervention sur le terrain. Dans des contextes militaires et de sécurité publique, cette information serait aussi un outil important pour retrouver l'origine des agents biologiques (ex: s'ils parviennent d'un labo ou d'un lieu d'entreposage).

La notion d'« armes de destruction massive » (ADM) est insaisissable : au lieu d'avoir pour but de mieux définir un type d'arme, elle agit à l'inverse, en créant une confusion entre l'arme et les conséquences de son emploi. Cette nature inconsistante se poursuit au niveau juridique. En effet, bien que l'expression fasse très tôt son entrée au sein des Nations unies, aucun traité ni organe officiel n'a, jusqu'alors, réussi à en donner une définition probante. À défaut de définition incontestable, et en l'absence d'un critère vérifiable d'identification de ce qu'est une « arme de destruction massive », cette notion s'est avérée préjudiciable. L'écart entre la réalité de la menace existante en matière d'« armes de destruction massive » et la façon dont elle fut perçue, puis gérée par la communauté internationale, c'est-à-dire à la fois par les États de façon individuelle et par les organisations internationales et les traités de façon collective, a conduit à de multiples dérives. Par conséquent, s'agissant là d'une notion plus politique que juridique, il apparaît nécessaire qu'elle soit précisée ou abandonnée / The term « weapons of mass destruction » (WMD) is ambiguous: instead of aiming to clearly define a certain type of weapon, it does the opposite by creating confusion between the weapon itself and the consequences of its use. This confusion is also reflected at in the legal definition. Indeed, even though the term has been used by the United Nations from an early stage, no treaty or official entity has succeeded in providing a clear definition to this day. The lack of a clear definition, and the absence of defined criteria to determine what constitutes a « weapon of mass destruction », has turned out to be damaging. The dichotomy between the existing threat from « weapons of mass destruction » and the way it is perceived and handled by the international community, including individual states, international organisations, as well as collective treaties, has resulted in several instances of inappropriate use. As a consequence, the term has become a political rather than legal notion. A clearer legal definition is needed, or otherwise the term should be abandoned