Vegetable oil is more difficult to degrade by microorganisms in comparison to carbohydrates and protein. Thus, it creates serious environmental and health concerns if oil-derived waste streams produced by restaurants and industries remain untreated. In this study, a strategy has been developed to grow filamentous fungi in pure olive oil so that it can be used as a bench-mark for growth in olive oil mill sidestreams. The growth of different strains (Aspergillus oryzae, Neurospora intermedia and Rhizopus oryzae) was tested in pure olive oil. A pre-germination stage using glucose as carbon and energy source, or the addition of yeast extract, were found necessary for successful fungal growth in olive oil. Here, A. oryzae showed a superior performance in comparison to N. intermedia and R. oryzae. Medium pH did not impact A. oryzae growth in olive oil, whereas a concentration higher than 40 g/L of the latter impaired the growth of the ascomycete. Obtained biomasses from A. oryzae and N. intermedia cultivations in olive oil were analyzed and compared for protein, fat, ash, and alkali-insoluble material (cell wall content), where the presence of olive oil had a steering effect. The fungal biomass of A. oryzae, obtained from cultivation in the absence of olive oil, contained 0.33% fat and 48% protein, whereas the respective values in the presence of olive oil were 31% and 14%. Similar trends on fat and protein contents were observed for the biomass of N. intermedia. Sudan black staining was also performed on fresh biomass which clearly indicated the presence of oil globules inside the fungal cells. This research can be a fundamental step towards treatment of oil-based waste streams, which entails high-energy and costs if treated, or environmental impacts during informal discharges. Moreover, the fact that the composition of fungal biomass can be steered through addition of olive oil increases the versatility of the originated biomass for various applications, namely in feed, food and biofuel production.

in English β-N-acetylhexosaminidase (EC 3.2.1.52) belongs to exoglycosidase, and is one of the most abundant enzymes found in organisms from bacteria to human. The fungal β-N-acetylhexosaminidase from Aspergillus oryzae is composed of propeptide and catalytic domain. The propeptide is noncovalently associated with the catalytic domain of the enzyme. Propeptide is essential for the enzyme activity. While the structure of the catalytic domain was desidned by homology modeling, the structure of the propeptide has not been resolved yet. In this study, the position where the propeptide is associated with the catalytic domain, was uncovered. Presented work consists of two parts. First part deals with optimization of production conditions, purification and crystallization of β-N-acetylhexosaminidase from the filamentous fungi Aspergillus oryzae. Second part is devoted to the study of interaction between propeptide and catalytic domain, which was characterized by chemical cross-linking and high-resolution mass spectrometry. It was found that the structural changes of the catalytic domain depend on the presence of the propeptide molecule. Moreover the region of propeptide-catalytic domain interaction was revealed.

Twenty-four early to midlactation Holstein cows were allocated to one of three treatments. Treatments consisted of: 1) basal ration plus 60 g wheat bran per day per head (control); 2) basal ration plus 57 g yeast culture per day per head; 3) basal ration plus 57 g yeast culture plus 3 g Aspergillus oryzae per day per head. Feed intake and milk yield were recoreded daily and milk composition and body weights were recorded weekly. Feed and fecal samples were recorded weekly. Feed and fecal samples were collected to determine apparent nutrient digestibility. No statistical difference was observed in milk yield among treatments. Percent fat, protein, and solid non fat of milk samples for the control fed group was significantly higher than the other treatment groups. Apparent crude protein, acid detergent fiber, and neutral detergent fiber digestibilities for cows fed the fungal culture treatments were significantly higher. Six rumen-fistulated Holstein cows were randomly assigned to one of three treatments in a 3x3 replicated Latin square design. Rumen pH was significantly lower for cows fed treatment two. Total volatile fatty acid and ammonia nitrogen concentration were higher for cows fed treatment two. Three rumen-fistulated Holstein cows were assigned one of three treatments in a 3x3 Latin square design for an in situ study. Approximately 15 g of grass hay, low quality alfalfa, and high quality alfalfa were sealed in nylon bags and put into the rumen. Samples were analyzed for dry matter, acid detergent fiber, neutral detergent fiber, and crude protein. Regardless of substrate used, dry matter disappearance was lower for control. Regardless of treatment ration fed, high quality alfalfa as a substrate was significantly higher in dry matter disappearance.

The present thesis deals with the production of microbial enzymes and their subsequent stabilization through encapsulation. The theoretical part focuses on microbial enzymes, especially extracellular hydrolases, their producers and characteristics. Within the theory is also discussed the possibility of the application of enzymes in the field of pharmacy and medicine. Experimental work was focused on the actual production of microbial enzymes and methods for their to stabilization. The production of proteolytic and lipolytic enzymes in dependence on time and the used culture substrate were followed. The highest enzyme production was observed in Aspergillus oryzae when cultured on wheat bran at the third day of cultivation. In the experimental part was further carried out the identification, isolation and purification of enzymes. A substantial part of the experiment was to stabilize produced microbial enzymes by encapsulation. Enzymes were entrapped into alginate particles with encapsulation efficiency in the range of 55-70 %. The highest efficiency exhibited encapsulated enzymes from Aspergillus oryzae. Subsequently, long-term stability of the encapsulated enzyme in two environments (in water and gel) was followed during six weeks incomparison with free enzyme. During storage of free enzyme a significant decrease in enzyme activities occured, especially between the fourth and sixth week of storage. On the contrary, in encapsulated increased enzyme activities were observed. Empty particles exhibited higher stability during storage in the gel than in water. In this thesis potential use of enzymes in the pharmaceutical industry as agents promoting digestion was tested too. According to the results, particles with encapsulated microbial enzymes could be considered as suitable for some pharmaceutical applications.

Bread waste represents a significant portion of global food waste, necessitating innovative approaches for its valorization. This research project explores the utilization of bread waste through fermentation with Aspergillus oryzae to produce fungal film which could be used for textile applications. While previous studies have examined various applications of food waste, this project specifically targets the textile industry, aiming to mitigate pollution associated with conventional textile manufacturing. The objective of this project was to investigate the feasibility of creating fungal films derived from bread waste. Additionally, to analyze the material's properties through assessments of tensile strength, microscopic analysis, and the identification of an appropriate methodology for this investigation. The biomass suspension was prepared using an ultrafine grinder, and a kitchen blender was subsequently employed to minimize the presence of remaining solids from the grinding process. Additionally, a range of strategies for film casting and wet laying were implemented and evaluated. Wet laying involved combining fungal biomass with tannin to mimic the characteristics of leather. On the other hand, casting utilized pre-treated biomass suspension to assess the formation and quality of the films. As the research progressed and different tannins were used to treat the biomass, a methodology was developed, and glycerol was introduced as a plasticizer. Furthermore, nanocellulose was later incorporated exclusively for the casting of the films to serve as a binder. The films that were produced gave interesting results are observed in casted sheets containing nanocellulose and glycerol-infused biomass (3% BM + 2% Cellulose + 0.13 g Glycerol), exhibiting exceptional tensile strength (35.1 ± 3.42 MPa) and elongation (16.7 ± 5.98%). Wet laid biomass sheets treated with Tara and glycerol display tensile strength (19.9 ± 3.55 MPa) and elongation (6.66 ± 3.02%). These findings signify the potential for developing fungal films from bread waste, necessitating further research to refine methodologies. Overall, this research project paves the way for future advancements in fungal films derived from bread waste. By investigating the use of Aspergillus oryzae and employing wet laying and casting techniques, the project establishes a foundation for sustainable textile production. The successful utilization of bread waste not only addresses the issue of food waste but also contributes to reducing pollution in the textile industry.

Single cell proteins such as that of edible filamentous fungal biomass are considered as a promising sustainable source of animal feed supplementation. Filamentous fungi can be cultivated on different organic substrates including volatile fatty acids (VFAs) such as acetic, propionic, and butyric acids. These VFAs can be generated through the famous waste valorisation approach of anaerobic digestion (AD) as intermediate metabolites. This project investigates a sustainable approach for the production of animal feed supplementation through cultivation of fungal biomass on waste derived VFAs along with the in vitro analysis of fungal biomass digestibility as ruminant feed. In this regard, optimum conditions for the production of Aspergillus oryzae biomass on different VFAs effluents derived from anaerobic digestion process of food waste plus chicken manure (FWCKM) and potato protein liquor (PPL) at different pH, nitrogen sources, and feed mixture was studied. Accordingly, analyses showed that PPL has the highest biomass yield with 0.4 (g biomass/g consumed VFAs) based on the volatile solids (VS) by adjusting pH to 6.2. Furthermore, the digestibility of the produced fungal biomass is analysed by using three different in vitro digestion methods including Tilley and Terry (TT) method, Gas Production Method (GPM), and Nylon Bag Method (NBM) and the results are compared with the conventional feed (silage and rapeseed meal). Results obtained from different digestibility methods illustrate that different A. oryzae fungal biomass had approximately 10-15 % higher dry matter digestibility fraction compared to silage and rapeseed meal (reference feeds). Hence, these results revealed that A. oryzae fungal biomass can grow on VFAs effluents and produce protein-rich fungal biomass while this biomass has better digestibility compared to conventional feeds and confirmed the initial hypothesis of the study.

Die Entwicklung neuer humanmilchähnlicher, funktioneller und bioaktiver Lebensmittel (z. B. Trinkmilch oder Joghurt), die Oligosaccharide mit einer möglichen Gesundheitswirkung enthalten („Health Claim”), sind für die menschliche Ernährung von besonderem Interesse. Ziel dieser Arbeit war es daher, geeignete Verfahren zu entwickeln, um - unter Ausnutzung der Transferaseaktivität von β-Galactosidase - komplexe Galacto-Oligosaccharide aus Lactose zu synthetisieren und nicht-proteingebundene, komplexe milcheigene Oligosaccharide aus Kuhmilch aufzureinigen und zu charakterisieren. Zur Identifizierung und Quantifizierung der Oligosaccharide wurden zunächst hochempfindliche Analysenmethoden etabliert (siehe Kapitel 4.1). Da Oligosaccharide Minorkomponenten in der Milch sind, mussten diese von Fetten, Proteinen und Lactose abgetrennt werden. Die Entfettung erfolgte durch Zentrifugation in der Kälte. Die Proteinabtrennung war unter Verwendung einer 10kDa-Ultrafiltrations-Membran optimal (siehe Kapitel 4.1.1.1). Die Abtrennung der Lactose von den Oligosacchariden stellte die größte Herausforderung dar, da beide Stoffklassen zu den Kohlenhydraten gehören und sich nur geringfügig in ihren Molmassen unterscheiden. Des Weiteren liegt Lactose in Kuhmilch im ca. 1000-fachen Überschuss im Vergleich zu den Oligosacchariden vor. Beim Vergleich verschiedener Aufarbeitungsmethoden zur Lactoseabtrennung stellte sich die Festphasenextraktion an Aktivkohle (GCC-SPE) als am besten geeignet heraus. Mit dieser Methode wurde - im Gegensatz zur ebenfalls untersuchten Größenausschlusschromatographie - eine hohe Reproduzierbarkeit der Analyten erreicht. Während bei der Größenausschlusschromatographie das Kuhmilch-Oligosaccharid GalNAc-α-(1→3)-Gal-β-(1→4)-Glc nahezu vollständigen verloren ging, konnten nach GCC-SPEAufarbeitung fast 100 % des Analyten wiedergefunden werden (siehe Kapitel 4.1.1.2). Zur Charakterisierung der Oligosaccharide wurde eine hochauflösende Anionenaustauscherchromatographie mit pulsierender amperometrischen Detektion (HPAEC-PAD) etabliert. Parallel zur hochempfindlichen Detektion mittels PAD wurde zur direkten Strukturaufklärung von underivatisierten Zuckern eine Online-Kopplung an einen Massendetektor (IT-MS) aufgebaut. Einzelne Analyten konnten mit Hilfe von kommerziell erhältlichen Oligosaccharidstandards identifiziert und quantifiziert werden (siehe Kapitel 4.1.1.3). Als weitere Möglichkeit zur Quantifizierung der Oligosaccharide wurden photometrische Schnelltests entwickelt (siehe Kapitel 4.1.2). Zur Absicherung der HPAEC-PAD-Analysendaten sollten zukünftig weitere Analysenmethoden etabliert werden (z. B. enzymatischer Verdau der Oligosaccharide, Analyse der Monosaccharide nach Hydrolyse der OS, HILIC-HPLC). Die entwickelte HPAEC-PAD-Methode wurde zur Identifizierung und Quantifizierung von Oligosacchariden in Milchproben verschiedener Nutztierarten (siehe Kapitel 4.2.1) und in Produktströmen der milch- und molkeverarbeitenden Industrie (siehe Kapitel 4.2.2) verwendet. Die Untersuchungen von Milchproben unterschiedlicher Nutztierarten zeigten, dass jede Milch hinsichtlich der MOS einzigartig ist. Dies konnte anhand der verschiedenen, identifizierten MOS mit unterschiedlichen Konzentrationen belegt werden. Der höchste MOS-Gehalt konnte in Humanmilch detektiert werden, gefolgt von Kamelmilch, Schafsmilch, Ziegenmilch, Kuhmilch und Stutenmilch (siehe Kapitel 4.2.1). Die Untersuchungen der Produktströme der milch- und molkeverarbeitenden Industrie zeigten, dass es während der Lactosekristallisation und der Aktivkohlebehandlung zu Verlusten an MOS kommt. Bei anderen Prozessschritten, wie Entfettung, Proteinabtrennung, Aufkonzentrierung oder Käseherstellung, war kein Einfluss auf die MOS-Konzentrationen ersichtlich (siehe Kapitel 4.2.2). Die entwickelte Methode zur OS-Bestimmung mittels HPAEC-PAD könnte zukünftig auf die Analysen proteingebundener Oligosaccharide ausgedehnt werden [[Grey, 2009] und [Weiß, 2001]]. Zur Herstellung eines Oligosaccharid-angereicherten Lebensmittels wurden Galacto-Oligosaccharide enzymatisch - unter Ausnutzung der Transferaseaktivität von β-Galactosidase - aus Lactose synthetisiert (siehe Kapitel 4.3). Für die Entwicklung des Verfahrens wurden verschiedene β-Galactosidasen (Enzyme aus Kluyveromyces lactis, Aspergillus oryzae und Bacillus circulans) bei unterschiedlichen Reaktionsbedingungen getestet. Die höchste GOS-Ausbeute (19,8 Flächenprozent der HPAEC an Haupt-Trisaccharid, 40,5 % GOS) konnte mit Hilfe der β-Galactosidase aus B. circulans bei pH 4, 40 °C und 12 U/g erreicht werden. Dabei wurden v. a. Tri- bis Pentasaccharide gebildet. Das Hauptreaktionsprodukt war das Trisaccharid 4'-Galactosyllactose (4'-GL). Mit Hilfe der β-Galactosidase aus A. oryzae konnte bei pH 4,5, 40 °C und 12 U/g die zweitgrößte GOS-Ausbeute (14,2 % Haupt-Trisaccharid, 19,7 % GOS) synthetisiert werden. Dabei wurden v. a. Tri- und Tetrasaccharide mit dem Hauptreaktionsprodukt 6'-Galactosyllactose (6'-GL) gebildet. Die geringste GOS-Ausbeute (10,5 % Haupt-Trisaccharid, 3,0 % GOS) wurde mit der β-Galactosidase aus K. lactis bei pH 7, 40 °C und 12 U/g erreicht. Di- und Trisaccharide sowie ein geringer Anteil an Tetrasacchariden konnten dabei synthetisiert werden. Das Hauptreaktionsprodukt war hierbei das Trisaccharid 6'-GL. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die milcheigenen Oligosaccharide während der Lactosehydrolyse mit den drei getesteten β-Galactosidasen weitgehend erhalten bleiben (siehe Kapitel 4.3.4). Neben den Galacto-Oligosacchariden, die nach enzymatischer Synthese direkt im Lebensmittel eingesetzt werden können, wurden milcheigene Oligosaccharide aus Kuhmilch aufgereinigt (siehe Kapitel 4.4.1). Zur Aufreinigung der MOS wurden Nanofiltrationsversuche in verschiedenen Maßstäben, mit unterschiedlichen Prozessparametern und diversen Membranen durchgeführt. Die im hohen Überschuss vorhandene Lactose wurde vor der Nanofiltration durch enzymatische Hydrolyse in ihre Monosaccharide gespalten, wodurch die Trennung von Monosacchariden und MOS verbessert wurde. Die Membran SR50/SR2 stellte sich für die MOS-Aufreinigung als am besten geeignet heraus. Mono- und Disaccharide konnten mit dieser Membran nahezu vollständig abgetrennt und MOS zu 42,1 % bis 52,4 % wiedergefunden werden. Das Verhältnis der Mono- und Disaccharide zu MOS konnte von ca. 1000:1 auf 18,5:1 zu Gunsten der MOS verändert werden. Der Anteil der Oligosaccharide am Gesamtzuckergehalt wurde von 0,1 % auf 5,1 % erhöht. Aus 40 kg hydrolysiertem Ultrafiltrations-Magermilchpermeat konnten 332,5 mg GalNAc-α-(1→3)-Gal-β-(1→4)-Glc, 414,1 mg 3'-SL und 91,5 mg 6'-SL gewonnen werden (Kapitel 4.4.1.4). Die durch Nanofiltration aufgereinigten, MOS-haltigen Proben sind für den Einsatz in einem potentiell funktionellen Lebensmittel geeignet. Da der Restlactosegehalt der synthetisierten, GOS-haltigen Proben und der aufgereinigten, MOS-haltigen Proben für weitere Analysen - wie orientierende Studien zur potentiell bifidogenen Wirkung - zu hoch war, erfolgte eine zweite Aufreinigung mittels präparativer Chromatographie an Aktivkohle (siehe Kapitel 4.4.2). Dadurch konnten bei den synthetisierten, GOS-haltigen Proben die Monosaccharide vollständig entfernt, der Restlactosegehalt auf unter 1 % am Gesamtzuckergehalt gesenkt und GOS aufgereinigt werden. Durch die Aktivkohle-Aufreinigung der durch Nanofiltration aufgereinigten, MOS-haltigen Proben konnten Mono- und Disaccharide von dem milcheigenen Oligosaccharid GalNAc-α-(1→3)-Gal-β-(1→4)-Glc sowie von den GOS - entstanden durch die vorherige Behandlung mit β-Galactosidase - abgetrennt werden. Die Sialyllactosen gingen dabei nahezu vollständig verloren. Auf Grund der vermuteten gesundheitsfördernden Wirkung der Sialyllactosen bedarf es weiterer Forschungsaktivitäten. Insbesondere ist eine Optimierung des Aufgabevolumens, der Konditionierung und der Wahl der stationären Phase wünschenswert. Mit den durch Aktivkohle aufgereinigten GOS-Lösungen, die weniger als 1 % Mono- und Disaccharide am Gesamtzuckergehalt enthielten, wurden orientierende Studien zur potentiell bifidogenen Wirkung durchgeführt (siehe Kapitel 4.5). Die orientierenden Studien mit Bifidobacterium longum ließen eine potentiell bifidogene Wirkung der untersuchten GOS-Lösungen erkennen. Diese GOS-Proben zeigten dabei eine stärkere bifidogene Wirkung als die bifidogene Referenzsubstanz Lactulose und der Vivinal®GOS-Sirup. Zukünftig sollten die Proben, die nach Beendigung der bakteriellen Reaktion gewonnen wurden, mittels HPAEC-PAD analysiert werden. Dadurch könnte der Kohlenhydratabbau bzw. die Bildung organischer Säuren untersucht werden. Der zeitliche Verlauf sowie der Einsatz anderer Mikroorganismen - wie Lactobazillen und Clostridien - könnten ebenfalls untersucht werden. Andere orientierende Studien, wie antiinflammatorische Tests, wären bei der weiteren Charakterisierung der Oligosaccharide hilfreich. Die Herstellung eines Oligosaccharid-angereicherten Lebensmittels erfolgte im Labormaßstab unter Zusatz der potentiell bifidogenen GOS-Lösung, die mit Hilfe von β-Galactosidase aus K. lactis synthetisiert wurde. Die Art der Erhitzung des Lebensmittels - Pasteurisierung vs. Hocherhitzung - hatte keinen Einfluss auf die Zuckerzusammensetzung und die Zuckergehalte. Während einer anschließenden sechswöchigen Lagerung in der Kälte konnte kein Abbau der Kohlenhydrate detektiert werden. Als Ausblick für weitere Forschungen ist die Bestätigung der potentiell bifidogenen Wirkung der MOS-haltigen Proben von primärer Bedeutung. Anschließend könnten Studien mit funktionellen, MOS-haltigen Lebensmitteln durchgeführt werden. Dabei sollte versucht werden, ein humanmilchähnliches Lebensmittel mit ca. 20 % sauren und ca. 80 % neutralen Oligosacchariden herzustellen. Die mittels Nanofiltration aufgereinigten, MOS-haltigen Proben könnten als saurer Zusatz und die enzymatisch synthetisierten, GOS-haltigen Proben als neutraler Zusatz verwendet werden. Des Weiteren sollte eine Überprüfung der potentiell bifidogenen Wirkung sowie eine sensorische Prüfung des hergestellten Lebensmittels durchgeführt werden. Sobald MOS durch Nanofiltration bzw. GOS mittels enzymatischer Synthese im großtechnischen Maßstab aufgereinigt bzw. hergestellt werden können, sind Humanstudien zur Bestätigung der Wirksamkeit von milcheigenen Oligosaccharide bzw. der Galacto-Oligosaccharide möglich. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten potentiell funktionelle Lebensmittelinhaltsstoffe (enzymatisch synthetisierte, GOS-haltige Lösungen) und Lebensmittelinhaltsstoffe, deren vermutete Funktionalität noch nicht bestätigt wurde (durch Nanofiltration aufgereinigte, MOS-haltige Lösungen), hergestellt werden. Unter Verwendung der in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse und der Erfüllung der im Ausblick geschilderten Bedingungen, ist eine großtechnische Produktion eines funktionellen, Oligosaccharid-angereicherten Lebensmittels möglich.

Die Entwicklung neuer humanmilchähnlicher, funktioneller und bioaktiver Lebensmittel (z. B. Trinkmilch oder Joghurt), die Oligosaccharide mit einer möglichen Gesundheitswirkung enthalten („Health Claim”), sind für die menschliche Ernährung von besonderem Interesse. Ziel dieser Arbeit war es daher, geeignete Verfahren zu entwickeln, um - unter Ausnutzung der Transferaseaktivität von β-Galactosidase - komplexe Galacto-Oligosaccharide aus Lactose zu synthetisieren und nicht-proteingebundene, komplexe milcheigene Oligosaccharide aus Kuhmilch aufzureinigen und zu charakterisieren. Zur Identifizierung und Quantifizierung der Oligosaccharide wurden zunächst hochempfindliche Analysenmethoden etabliert (siehe Kapitel 4.1). Da Oligosaccharide Minorkomponenten in der Milch sind, mussten diese von Fetten, Proteinen und Lactose abgetrennt werden. Die Entfettung erfolgte durch Zentrifugation in der Kälte. Die Proteinabtrennung war unter Verwendung einer 10kDa-Ultrafiltrations-Membran optimal (siehe Kapitel 4.1.1.1). Die Abtrennung der Lactose von den Oligosacchariden stellte die größte Herausforderung dar, da beide Stoffklassen zu den Kohlenhydraten gehören und sich nur geringfügig in ihren Molmassen unterscheiden. Des Weiteren liegt Lactose in Kuhmilch im ca. 1000-fachen Überschuss im Vergleich zu den Oligosacchariden vor. Beim Vergleich verschiedener Aufarbeitungsmethoden zur Lactoseabtrennung stellte sich die Festphasenextraktion an Aktivkohle (GCC-SPE) als am besten geeignet heraus. Mit dieser Methode wurde - im Gegensatz zur ebenfalls untersuchten Größenausschlusschromatographie - eine hohe Reproduzierbarkeit der Analyten erreicht. Während bei der Größenausschlusschromatographie das Kuhmilch-Oligosaccharid GalNAc-α-(1→3)-Gal-β-(1→4)-Glc nahezu vollständigen verloren ging, konnten nach GCC-SPEAufarbeitung fast 100 % des Analyten wiedergefunden werden (siehe Kapitel 4.1.1.2). Zur Charakterisierung der Oligosaccharide wurde eine hochauflösende Anionenaustauscherchromatographie mit pulsierender amperometrischen Detektion (HPAEC-PAD) etabliert. Parallel zur hochempfindlichen Detektion mittels PAD wurde zur direkten Strukturaufklärung von underivatisierten Zuckern eine Online-Kopplung an einen Massendetektor (IT-MS) aufgebaut. Einzelne Analyten konnten mit Hilfe von kommerziell erhältlichen Oligosaccharidstandards identifiziert und quantifiziert werden (siehe Kapitel 4.1.1.3). Als weitere Möglichkeit zur Quantifizierung der Oligosaccharide wurden photometrische Schnelltests entwickelt (siehe Kapitel 4.1.2). Zur Absicherung der HPAEC-PAD-Analysendaten sollten zukünftig weitere Analysenmethoden etabliert werden (z. B. enzymatischer Verdau der Oligosaccharide, Analyse der Monosaccharide nach Hydrolyse der OS, HILIC-HPLC). Die entwickelte HPAEC-PAD-Methode wurde zur Identifizierung und Quantifizierung von Oligosacchariden in Milchproben verschiedener Nutztierarten (siehe Kapitel 4.2.1) und in Produktströmen der milch- und molkeverarbeitenden Industrie (siehe Kapitel 4.2.2) verwendet. Die Untersuchungen von Milchproben unterschiedlicher Nutztierarten zeigten, dass jede Milch hinsichtlich der MOS einzigartig ist. Dies konnte anhand der verschiedenen, identifizierten MOS mit unterschiedlichen Konzentrationen belegt werden. Der höchste MOS-Gehalt konnte in Humanmilch detektiert werden, gefolgt von Kamelmilch, Schafsmilch, Ziegenmilch, Kuhmilch und Stutenmilch (siehe Kapitel 4.2.1). Die Untersuchungen der Produktströme der milch- und molkeverarbeitenden Industrie zeigten, dass es während der Lactosekristallisation und der Aktivkohlebehandlung zu Verlusten an MOS kommt. Bei anderen Prozessschritten, wie Entfettung, Proteinabtrennung, Aufkonzentrierung oder Käseherstellung, war kein Einfluss auf die MOS-Konzentrationen ersichtlich (siehe Kapitel 4.2.2). Die entwickelte Methode zur OS-Bestimmung mittels HPAEC-PAD könnte zukünftig auf die Analysen proteingebundener Oligosaccharide ausgedehnt werden [[Grey, 2009] und [Weiß, 2001]]. Zur Herstellung eines Oligosaccharid-angereicherten Lebensmittels wurden Galacto-Oligosaccharide enzymatisch - unter Ausnutzung der Transferaseaktivität von β-Galactosidase - aus Lactose synthetisiert (siehe Kapitel 4.3). Für die Entwicklung des Verfahrens wurden verschiedene β-Galactosidasen (Enzyme aus Kluyveromyces lactis, Aspergillus oryzae und Bacillus circulans) bei unterschiedlichen Reaktionsbedingungen getestet. Die höchste GOS-Ausbeute (19,8 Flächenprozent der HPAEC an Haupt-Trisaccharid, 40,5 % GOS) konnte mit Hilfe der β-Galactosidase aus B. circulans bei pH 4, 40 °C und 12 U/g erreicht werden. Dabei wurden v. a. Tri- bis Pentasaccharide gebildet. Das Hauptreaktionsprodukt war das Trisaccharid 4'-Galactosyllactose (4'-GL). Mit Hilfe der β-Galactosidase aus A. oryzae konnte bei pH 4,5, 40 °C und 12 U/g die zweitgrößte GOS-Ausbeute (14,2 % Haupt-Trisaccharid, 19,7 % GOS) synthetisiert werden. Dabei wurden v. a. Tri- und Tetrasaccharide mit dem Hauptreaktionsprodukt 6'-Galactosyllactose (6'-GL) gebildet. Die geringste GOS-Ausbeute (10,5 % Haupt-Trisaccharid, 3,0 % GOS) wurde mit der β-Galactosidase aus K. lactis bei pH 7, 40 °C und 12 U/g erreicht. Di- und Trisaccharide sowie ein geringer Anteil an Tetrasacchariden konnten dabei synthetisiert werden. Das Hauptreaktionsprodukt war hierbei das Trisaccharid 6'-GL. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die milcheigenen Oligosaccharide während der Lactosehydrolyse mit den drei getesteten β-Galactosidasen weitgehend erhalten bleiben (siehe Kapitel 4.3.4). Neben den Galacto-Oligosacchariden, die nach enzymatischer Synthese direkt im Lebensmittel eingesetzt werden können, wurden milcheigene Oligosaccharide aus Kuhmilch aufgereinigt (siehe Kapitel 4.4.1). Zur Aufreinigung der MOS wurden Nanofiltrationsversuche in verschiedenen Maßstäben, mit unterschiedlichen Prozessparametern und diversen Membranen durchgeführt. Die im hohen Überschuss vorhandene Lactose wurde vor der Nanofiltration durch enzymatische Hydrolyse in ihre Monosaccharide gespalten, wodurch die Trennung von Monosacchariden und MOS verbessert wurde. Die Membran SR50/SR2 stellte sich für die MOS-Aufreinigung als am besten geeignet heraus. Mono- und Disaccharide konnten mit dieser Membran nahezu vollständig abgetrennt und MOS zu 42,1 % bis 52,4 % wiedergefunden werden. Das Verhältnis der Mono- und Disaccharide zu MOS konnte von ca. 1000:1 auf 18,5:1 zu Gunsten der MOS verändert werden. Der Anteil der Oligosaccharide am Gesamtzuckergehalt wurde von 0,1 % auf 5,1 % erhöht. Aus 40 kg hydrolysiertem Ultrafiltrations-Magermilchpermeat konnten 332,5 mg GalNAc-α-(1→3)-Gal-β-(1→4)-Glc, 414,1 mg 3'-SL und 91,5 mg 6'-SL gewonnen werden (Kapitel 4.4.1.4). Die durch Nanofiltration aufgereinigten, MOS-haltigen Proben sind für den Einsatz in einem potentiell funktionellen Lebensmittel geeignet. Da der Restlactosegehalt der synthetisierten, GOS-haltigen Proben und der aufgereinigten, MOS-haltigen Proben für weitere Analysen - wie orientierende Studien zur potentiell bifidogenen Wirkung - zu hoch war, erfolgte eine zweite Aufreinigung mittels präparativer Chromatographie an Aktivkohle (siehe Kapitel 4.4.2). Dadurch konnten bei den synthetisierten, GOS-haltigen Proben die Monosaccharide vollständig entfernt, der Restlactosegehalt auf unter 1 % am Gesamtzuckergehalt gesenkt und GOS aufgereinigt werden. Durch die Aktivkohle-Aufreinigung der durch Nanofiltration aufgereinigten, MOS-haltigen Proben konnten Mono- und Disaccharide von dem milcheigenen Oligosaccharid GalNAc-α-(1→3)-Gal-β-(1→4)-Glc sowie von den GOS - entstanden durch die vorherige Behandlung mit β-Galactosidase - abgetrennt werden. Die Sialyllactosen gingen dabei nahezu vollständig verloren. Auf Grund der vermuteten gesundheitsfördernden Wirkung der Sialyllactosen bedarf es weiterer Forschungsaktivitäten. Insbesondere ist eine Optimierung des Aufgabevolumens, der Konditionierung und der Wahl der stationären Phase wünschenswert. Mit den durch Aktivkohle aufgereinigten GOS-Lösungen, die weniger als 1 % Mono- und Disaccharide am Gesamtzuckergehalt enthielten, wurden orientierende Studien zur potentiell bifidogenen Wirkung durchgeführt (siehe Kapitel 4.5). Die orientierenden Studien mit Bifidobacterium longum ließen eine potentiell bifidogene Wirkung der untersuchten GOS-Lösungen erkennen. Diese GOS-Proben zeigten dabei eine stärkere bifidogene Wirkung als die bifidogene Referenzsubstanz Lactulose und der Vivinal®GOS-Sirup. Zukünftig sollten die Proben, die nach Beendigung der bakteriellen Reaktion gewonnen wurden, mittels HPAEC-PAD analysiert werden. Dadurch könnte der Kohlenhydratabbau bzw. die Bildung organischer Säuren untersucht werden. Der zeitliche Verlauf sowie der Einsatz anderer Mikroorganismen - wie Lactobazillen und Clostridien - könnten ebenfalls untersucht werden. Andere orientierende Studien, wie antiinflammatorische Tests, wären bei der weiteren Charakterisierung der Oligosaccharide hilfreich. Die Herstellung eines Oligosaccharid-angereicherten Lebensmittels erfolgte im Labormaßstab unter Zusatz der potentiell bifidogenen GOS-Lösung, die mit Hilfe von β-Galactosidase aus K. lactis synthetisiert wurde. Die Art der Erhitzung des Lebensmittels - Pasteurisierung vs. Hocherhitzung - hatte keinen Einfluss auf die Zuckerzusammensetzung und die Zuckergehalte. Während einer anschließenden sechswöchigen Lagerung in der Kälte konnte kein Abbau der Kohlenhydrate detektiert werden. Als Ausblick für weitere Forschungen ist die Bestätigung der potentiell bifidogenen Wirkung der MOS-haltigen Proben von primärer Bedeutung. Anschließend könnten Studien mit funktionellen, MOS-haltigen Lebensmitteln durchgeführt werden. Dabei sollte versucht werden, ein humanmilchähnliches Lebensmittel mit ca. 20 % sauren und ca. 80 % neutralen Oligosacchariden herzustellen. Die mittels Nanofiltration aufgereinigten, MOS-haltigen Proben könnten als saurer Zusatz und die enzymatisch synthetisierten, GOS-haltigen Proben als neutraler Zusatz verwendet werden. Des Weiteren sollte eine Überprüfung der potentiell bifidogenen Wirkung sowie eine sensorische Prüfung des hergestellten Lebensmittels durchgeführt werden. Sobald MOS durch Nanofiltration bzw. GOS mittels enzymatischer Synthese im großtechnischen Maßstab aufgereinigt bzw. hergestellt werden können, sind Humanstudien zur Bestätigung der Wirksamkeit von milcheigenen Oligosaccharide bzw. der Galacto-Oligosaccharide möglich. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten potentiell funktionelle Lebensmittelinhaltsstoffe (enzymatisch synthetisierte, GOS-haltige Lösungen) und Lebensmittelinhaltsstoffe, deren vermutete Funktionalität noch nicht bestätigt wurde (durch Nanofiltration aufgereinigte, MOS-haltige Lösungen), hergestellt werden. Unter Verwendung der in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse und der Erfüllung der im Ausblick geschilderten Bedingungen, ist eine großtechnische Produktion eines funktionellen, Oligosaccharid-angereicherten Lebensmittels möglich.