L’encéphalopathie hypoxique-­‐ischémique cause des milliers de victimes à travers le monde chaque année. Les enfants survivants à un épisode hypoxique-­‐ischémique sont à risque de développer des problèmes neurologiques incapacitants comme une paralysie cérébrale, un retard mental, une épilepsie ou des troubles d’ordre comportemental. Les modèles animaux ont amélioré nos connaissances sur les mécanismes sous-­‐jacents aux dommages cérébraux, mais elles sont encore trop incomplètes pour être capables de prévenir les problèmes neurologiques. Ce projet vise à comprendre l’impact d’un épisode asphyxique périnatale associé à des convulsions ainsi que l’activation de l’adenosine monophosphate-­‐activated protein kinase (AMPK) sur les circuits GABAergiques inhibiteurs en développement chez la souris. Dans le but d’investiguer le sort des neurones inhibiteurs, appelés interneurones, suite à un épisode asphyxique périnatal associé à des convulsions avec des animaux transgéniques, nous avons pris avantage d’un nouveau modèle d’hypoxie permettant d’induire des convulsions chez la souris. Deux populations d’interneurones représentant ensemble environ 60% de tous les interneurones corticaux ont été étudiées, soit les cellules exprimant la parvalbumine (PV) et les cellules exprimant la somatostatine (SOM). L’étude stéréologique n’a montré aucune mort neuronale de ces deux populations d’interneurones dans l’hippocampe chez les souris hypoxique d’âge adulte. Par contre, le cortex des souris hypoxiques présentait des zones complètement ou fortement dépourvues de cellules PV alors que les cellules SOM n’étaient pas affectées. L’utilisation d’une lignée de souris transgénique exprimant une protéine verte fluorescente (GFP) dans les cellules PV nous a permis de comprendre que les trous PV sont le reflet de deux choses : 1) une diminution des cellules PV et 2) une immaturité des cellules PV restantes. Puisque les cellules PV sont spécifiquement affectées dans la première partie de notre étude, nous avons voulu étudier les mécanismes moléculaires sous-­‐jacents à cette vulnérabilité. L’AMPK est un senseur d’énergie qui orchestre le rétablissement des i niveaux d’énergie cellulaire dans le cas d’une déplétion énergétique en modulant des voies de signalisation impliquant la synthèse de protéines et l’excitabilité membranaire. Il est possible que l’activation d’AMPK suite à un épisode asphyxique périnatal associé à des convulsions soit néfaste à long-­‐terme pour le circuit GABAergique en développement et modifie l’établissement de l’innervation périsomatique d’une cellule PV sur les cellules pyramidales. Nous avons étudié cette hypothèse dans un modèle de culture organotypique en surexprimant la forme wild-­‐type (WT) de la sous-­‐unité α2 d’AMPK, ainsi qu’une forme mutée dominante négative (DN), dans des cellules PV individuelles. Nous avons montré que pendant la phase de formation synaptique (jours post-­‐natals équivalents EP 10-­‐18), la surexpression de la forme WT désorganise la stabilisation des synapses. De plus, l’abolition de l’activité d’AMPK semble augmenter le nombre de synapses périsomatiques faits par la cellule PV sur les cellules pyramidales pendant la phase de formation et semble avoir l’effet inverse pendant la phase de maturation (EP 16-­‐24). La neurotransmission GABAergique joue plusieurs rôles dans le cerveau, depuis la naissance jusqu’à l’âge adulte des interneurones, et une dysfonction des interneurones a été associée à plusieurs troubles neurologiques, comme la schizophrénie, l’autisme et l’épilepsie. La maturation des circuits GABAergiques se fait majoritairement pendant la période post-­‐natale et est hautement dépendante de l’activité neuronale et de l’expérience sensorielle. Nos résultats révèlent que le lourd fardeau en demande énergétique d’un épisode asphyxique périnatal peut causer une mort neuronale sélective des cellules PV et compromettre l’intégrité de leur maturation. Un des mécanismes sous-­‐ jacents possible à cette immaturité des cellules PV suite à l’épisode hypoxique est l’activation d’AMPK, en désorganisant leur profil d’innervation sur les cellules pyramidales. Nous pensons que ces changements dans le réseau GABAergique pourrait contribuer aux problèmes neurologiques associés à une insulte hypoxique. / Hypoxia-­‐ischemia encephalopathy causes thousands of victims each year around the world. Children surviving such hypoxia-­‐ischemia insults are at risk of developing disabling neurological problems such as cerebral palsy, epilepsy or cognitive problems. Animal models have improved our knowledge about the underlying mechanisms causing cerebral injury, but it is still too incomplete to be able to prevent neurological problems. This project aims to understand the impact of a perinatal asphyxic insult associated with seizures as well as the activation of adenosine monophosphate-­‐activated protein kinase (AMPK) on developing inhibitory GABAergic networks in mouse. With the objective to study the fate of inhibitory cells, called interneurons, following a perinatal asphyxia insult associated with seizures in transgenic animals, we took advantage of a new hypoxia model allowing us to induce seizures in mice. Cells expressing parvalbumin (PV) and cells expressing somatostatin (SOM) were studied as together they represent about 60% of all cortical interneurons. A stereological study showed no cell death within those two interneuron populations in the hippocampus of adult hypoxic mice. However, the cortex of hypoxic mice showed zones with complete or strongly lacking PV cells, whereas SOM cells were not affected. A transgenic mouse line allowed us to show that PV holes are the reflection of two things 1) a decrease in PV cells and 2) immaturity of surviving PV cells. Because PV cells a selectively affected in the first part of our study, we wanted to study the molecular mechanisms underlying this vulnerability. AMPK is a metabolic energy sensor that orchestrates the recovery of energy in cells undergoing energy depletion by modulating cellular pathways involved in protein synthesis and membrane excitability. It is possible that the activation of AMPK following a perinatal asphyxic insult associated with seizures is detrimental for developing GABAergic networks and modifies the establishment of perisomatic innervation of PV cells on excitatory pyramidal cells. We have studied this hypothesis in an organotypic system by overexpressing the wild-­‐type (WT) form and the dominant negative (DN) form of AMPK iv α 2 sub-­‐unit in individual PV cells. We have observed that during the synaptic formation phase (equivalent post-­‐natal day EP 10-­‐18), overexpressing WT AMPK disorganises synapse stabilisation. Moreover, abolishing AMPK activity with the transfection of AMPK DN seems to increase the number of perisomatic synapses made by PV cells onto pyramidal cells, and seems to have the inverse effect during the synaptic maturation phase (EP 18-­‐24). GABAergic neurotransmission plays many roles in the brain, from interneurons birth to adulthood, and a dysfunction in GABAergic neurotransmission has been associated with many neurological diseases such as schizophrenia, autism and epilepsy. GABAergic networks maturation mainly happens postnatally and is highly dependent on neural activity and sensory experience. Our results reveal that the heavy energetic burden caused by an asphyxic insult can cause selective PV cells death and interfere with their maturation. AMPK activation following an asphyxic insult could be one mechanism interfering with PV cells maturity by disorganising their pattern of innervation onto pyramidal cells. We think that these GABAergic networks alterations could contribute to the neurological problems associated to a hypoxic insult.

L’imagerie IRM de perfusion par Arterial Spin Labeling (ASL) ou marquage des spin artériels a pour principal avantage d’être une méthode d’imagerie non invasive (non irradiante et sans injection de produit de contraste exogène), particulièrement adaptée à l'imagerie cérébrale pédiatrique. Sa facilité de mise en œuvre explique l’engouement pour cette séquence et de nombreuses applications cliniques émergentes. Cette technique initialement développée chez l’adulte nécessite une adaptation à la population pédiatrique, aussi bien des paramètres d’acquisition et de quantification que des algorithmes de traitement d’images. La perfusion cérébrale globale et régionale évolue physiologiquement, parallèlement à l’âge et au développement neurocognitif. Il existe plusieurs méthodes d’étude de la perfusion cérébrale pédiatrique. Dans ce contexte, deux revues de littérature ont été réalisées et publiées : l’une portant sur les différentes techniques d’imagerie de la perfusion cérébrale chez les nouveau-nés, l’autre se focalisant sur la technique d’ASL en pédiatrie et ses applications cliniques. Puis la chaîne de traitement des images morphologiques et de perfusion ASL, développée chez l’adulte au sein de notre unité, a été adaptée aux enfants puis aux nouveau-nés. Ces deux populations ont effectivement des problématiques différentes, en particulier le rapport signal sur bruit de l’ASL est très bon chez les enfants, mais nettement moins bon chez les nouveau-nés, et les images morphologiques ont un contraste différent en raison d’une myélinisation incomplète à la naissance. Grace à l’adaptation de la chaîne de traitement, des travaux de recherche clinique ont pu être finalisés (2 publiés, 1 soumis) illustrant l’intérêt de l’étude de la perfusion cérébrale dans 3 situations : l’étude de l’évolution de la perfusion cérébrale normale chez l’enfant entre 6 mois et 15 ans ; l’étude de la perfusion cérébrale chez les enfants souffrant d’une première crise de migraine avec aura ; et enfin l’étude de l’évolution de la perfusion cérébrale entre le 3ieme et le 10ieme jour de vie chez les enfants souffrant d’asphyxie périnatale et traités par hypothermie. Plusieurs projets restent en cours sur le sujet, avec d’autres challenges de traitement et d’analyse d’image (enfants de neurochirurgie avec modifications morphologiques du cerveau, ou enfants prématurés par exemple), dans la continuité ce qui a été fait au cours de cette thèse. / Physiological changes in overall and regional cerebral perfusion are related to age and neurocognitive development. Brain perfusion in the pediatric population can be assessed using a number of imaging techniques. Two literature reviews were undertaken and published on this topic: one based on brain perfusion imaging techniques in neonates, and the other based on the ASL technique in the pediatric population and its clinical applications. The Arterial Spin Labeling (ASL) MRI perfusion sequence is one of the most suitable imaging techniques for children given that the procedure is non-irradiating and non-invasive (without exogenous contrast agent injection). There are many emerging cerebral perfusion imaging applications for children due to the highly convenient implementation of the ASL sequence, which can be easily incorporated into standard brain MRI protocols following acquisition of morphological images. Certain technical adjustments to the imaging parameters are required to account for the fundamental differences between the pediatric and adult populations. Measuring cerebral blood flow (CBF) in neonates and children using ASL therefore requires a number of adaptations to acquisition and related parameters.The processing of ASL data also requires specific adaptations, in particular regarding the automated segmentation of brain tissues, and the parameters used for CBF quantification models. The processing pipeline for both anatomical and perfusion images that had been previously developed by our team for adult data was adapted firstly for children and secondly for neonates. These two populations notably have specific age-related concerns; in particular the signal-to-noise ratio of ASL is very good in children, but much less so in neonates, and the morphological images have inverted contrast due to incomplete myelination at birth. Following adaptation of the processing pipeline, several studies were completed (2 original articles published and 1 under review), showing the clinical benefits of studying cerebral perfusion in three situations: first physiological changes in cerebral perfusion in children between 6 months and 15 years; secondly changes in cerebral perfusion in children with a first attack of migraine with aura; and lastly changes in brain perfusion between day of life 3 and day of life 10 in asphyxiated neonates. Following adaptation of the processing pipeline, several studies were completed (2 original articles published and 1 under review), showing the clinical benefits of studying cerebral perfusion in three situations: first physiological changes in cerebral perfusion in children between 6 months and 15 years; secondly changes in cerebral perfusion in children with a first attack of migraine with aura; and lastly changes in brain perfusion between day of life 3 and day of life 10 in asphyxiated neonates. Several studies are still in progress, and these present new image processing challenges, involving, for example, children with neurosurgical conditions and morphological changes in the brain, or premature babies, in line with the work undertaken for this thesis.

Le handicap ou les décès en rapport avec l'asphyxie périnatale dans les pays développés correspondent à 0,2 à 1,3/1000 naissances vivantes. L’évaluation clinique et l’IRM conventionnelle permettent de distinguer les formes modérées des formes graves d’Encéphalopathies Hypoxiques Ischémiques (EHI). Le pronostic des EHI modérées reste difficile à préciser. L’imagerie des tenseurs de diffusion (DTI) mesure la diffusion de l'eau dans les tissus cérébraux et les paramètres quantitatifs tels que la Fraction d’Anisotropie et le Coefficient Apparent de Diffusion de l’eau (ADC) reflètent les propriétés microstructurales tissulaires. Nous avons mené une étude clinique et une étude expérimentale. L'objectif de l'étude clinique était d'évaluer les paramètres d'IRM, de SRM et de DTI chez les nouveau-nés asphyxiques à terme. Nous avons montré que l'IRM (y compris la diffusion conventionnelle) et les ratios du Lactate en SRM sont des outils intéressants pour l’évaluation neurologique précoce de ces nouveau-nés. Les paramètres de DTI (FA et ADC) dans des zones spécifiques cérébrales (capsules internes, pédoncules cérébraux, putamen/pallidum) sont fortement corrélés avec l'évolution neurologique précoce (J8) et à 6 mois, reflétant de possibles différences dans les mécanismes physiopathologiques impliqués. Des études sont nécessaires pour évaluer à long terme la valeur pronostique de ces paramètres. L'objectif de l'étude expérimentale était d'évaluer les effets à court terme de l'érythropoïétine (Epo) sur les lésions cérébrales en imagerie de diffusion et l’expression de l’aquaporine-4 en immunohistochimie dans un modèle HI de rat nouveau-né. L'effet protecteur potentiel de l'Epo humaine recombinante sur les ratons a été étudié. L'Epo a un effet neuroprotecteur précocement dans notre modèle (réduction de la surface de l’accident vasculaire cérébral AVC, augmentation de la valeur d’ADC dans l’AVC chez les rats traités), éventuellement grâce à une « up-régulation » de l’expression de l'aquaporine-4. Un mécanisme possible de la diminution de l’œdème cérébral pourrait être une meilleure élimination de l’'excès d'eau des tissus cérébraux vers la circulation sanguine via l'aquaporine-4. / Severe neurological impairment or death in relation to perinatal asphyxia in developed countries concern 0.2 to 1.3/1000 live births. Clinical evaluation and conventional Magnetic Resonance Imaging (MRI) parameters are efficient to distinguish severe to minor Hypoxic-Ischemic Encephalopathy (HIE), but it remains discussed regarding long term outcome for babies with moderate HIE. Diffusion Tensor Imaging (DTI) measures the diffusion of water in cerebral tissue and quantitative parameters such as Fractional Anisotropy (FA) and Apparent Diffusion Coefficient (ADC) reflect the microstructure properties in local areas. We conducted in the same time a clinical and an experimental study. The aim of the clinical study was to evaluate MRI, MR Spectroscopy (MRS) and DTI parameters in asphyxiated full-term neonates. We showed that MRI (including conventional diffusion) and MRS represent interesting tools to evaluate the early neurological outcome in HIE neonates. DTI parameters in specific brain areas had strong correlations with early and at 6 months neurological outcome in babies with HIE. Studies are needed to evaluate the long-term prognostic value of DTI parameters in neonates with moderate injury. The aim of the experimental study was to evaluate the short-term effects of erythropoietin (Epo) on brain lesions (MR-Diffusion Imaging) and aquaporin-4 (immunohistochemistry) expression in a HI neonatal rat model. The potential protective effect of human recombinant Epo on a HI pup rat model was studied. We conclude that Epo has a short-term protective effect in HI pup rat model (reduction of stroke area; increase of ADC value in stroke area in treated rats), possibly through an early up-regulation of aquaporin-4 expression. One possible mechanism could be a better clearance of water excess from brain tissues to blood by aquaporin-4.

Les enfants qui ont subi une asphyxie périnatale modérée (MPA) risquent de développer des déficits cognitifs et comportementaux subtils et durables, notamment des troubles d'apprentissage et des problèmes émotionnels. Comprendre les mécanismes sous-jacents est une étape essentielle pour concevoir une thérapie ciblée. Déterminer comment le développement du cerveau est corrélé entre les humains et les rongeurs n'est pas simple, mais il existe également un alignement inter-espèces considérable en termes d'étapes clés du développement. Sur la base des changements biochimiques et neuroanatomiques au cours du développement précoce, le consensus général est qu'un cerveau de rongeur P8-10 correspond à peu près au cerveau d'un enfant à terme ; par conséquent, nous avons utilisé cette fenêtre temporelle comme référence pour développer un modèle préclinique de MPA chez la souris. Nous avons d'abord établi un protocole qui nous permet d'observer de manière fiable les crises induites par l'hypoxie chez les souris postnatales. Nous avons constaté que l'exposition de chiots P8-9 directement à 4 % d'O2 pendant 8 minutes induit de manière fiable des crises avec une latence d'environ 5 minutes chez 3 souches de souris (FVB, C57Bl/6, 129S6). Cet aspect est cliniquement pertinent car les convulsions sont la caractéristique néonatale la plus importante de l'encéphalopathie de stade 2 (modérée) telle que définie par l'échelle de Sarnat. Les souris MPA adultes présentent des séquelles à long terme sur des performances cognitives spécifiques, notamment des déficits de la mémoire de reconnaissance et de la flexibilité cognitive, mais aucune altération du comportement moteur et émotionnel. Le cortex préfrontal (PFC) régule la flexibilité cognitive et le comportement émotionnel. Les neurones qui libèrent la sérotonine (5-HT) projettent vers le PFC, et les composés modulant l'activité 5-HT influencent l'émotion et la cognition. On ne sait pas si les dérégulations de la 5-HT contribuent aux problèmes cognitifs induits par le MPA. Dans une première étude, nous avons trouvé que les niveaux d'expression de 5-HT, quantifiés par immunohistochimie, et de libération de 5-HT, quantifiés par microdialyse in vivo chez des souris éveillées, sont réduits dans le PFC de souris MPA adultes. Les souris MPA présentent également une régulation de la température corporelle altérée après l'injection de l'agoniste des récepteurs 5-HT1A, 8-OH-DPAT, suggérant la présence de déficits dans la fonction des auto-récepteurs 5-HT sur les neurones du raphé. Enfin, le traitement chronique de souris MPA adultes avec de la fluoxétine, un inhibiteur du transporteur de recapture de la 5-HT, ou l'agoniste des récepteurs 5-HT1A, la tandospirone, sauve la flexibilité cognitive et les troubles de la mémoire. Ensemble, ces données démontrent que le développement de la fonction du système 5-HT est vulnérable à une asphyxie périnatale modérée. L'hypofonctionnement de la 5-HT pourrait à son tour contribuer à une déficience cognitive à long terme à l'âge adulte, indiquant une cible potentielle pour les thérapies pharmacologiques. Les circuits GABAergiques comprennent une variété étonnante de différents types de cellules, qui sont probablement recrutées par différents événements comportementaux. Un sous-type important de cellules GABAergiques, les cellules positives à la parvalbumine (PV), génèrent des potentiels d'action à haute fréquence et synchronisent l'activité des neurones pyramidaux excitateurs. Les cellules PV sont particulièrement importantes pour la génération d'oscillations gamma, qui à leur tour régulent de nombreuses fonctions cognitives, notamment le traitement attentionnel axé sur les objectifs et la mémoire de travail. Des découvertes récentes indiquent que les cellules PV utilisent beaucoup plus d'énergie que les autres neurones corticaux, ce qui peut les rendre très vulnérables aux conditions de stress métabolique et oxydatif causées par le MPA. Nos données ont montré que l'expression de PV est altérée chez les souris MPA adultes. Nous avons en outre constaté que le niveau d'expression du récepteur de la neurotrophine p75NTR, qui limite la maturation des cellules PV au cours de la première semaine postnatale, est augmenté chez les souris MPA. La suppression génétique de p75NTR dans les neurones GABAergiques exprimant le facteur de transcription Nkx2.1, qui comprend les cellules PV, protège les souris de la perte de niveaux de PV et des effets cognitifs à long terme du MPA. Enfin, un traitement d'une semaine avec un inhibiteur de p75NTR commençant après le MPA sauve complètement les déficits d'activité cognitive et corticale chez les souris adultes. L'ensemble de ces données révèle une cible moléculaire potentielle pour le traitement des altérations cognitives causées par le MPA. / Children who experienced moderate perinatal asphyxia (MPA) are at risk of developing long lasting subtle cognitive and behavioral deficits, including learning disabilities and emotional problems. Understanding the underlying mechanisms is an essential step for designing targeted therapy. Determining how brain development correlates between humans and rodents is not straightforward, however there is also considerable cross-species alignment in terms of key developmental milestones. Based on biochemical and neuroanatomical changes during early development, the general consensus is that a P8-10 rodent brain corresponds roughly to the brain of a term infant; therefore, we used this time window as reference to develop a preclinical model of MPA in mouse. We first established a protocol that allows us to reliably observe hypoxia-induced seizures in postnatal mice. We found that exposing P8-9 pups directly to 4% O2 for 8 minutes reliably induces seizures with a latency of about 5’ in 3 mouse strains (FVB, C57Bl/6, 129S6). This aspect is clinically relevant as seizures are the most prominent neonatal hallmark of Stage 2 (Moderate) encephalopathy as defined by the Sarnat Scale. Adult MPA mice show long-term sequelae on specific cognitive performance, including deficits in recognition memory and cognitive flexibility, but no impairment in motor and emotional behavior. The prefrontal cortex (PFC) regulates cognitive flexibility and emotional behavior. Neurons that release serotonin (5-HT) project to the PFC, and compounds modulating 5-HT activity influence emotion and cognition. Whether 5-HT dysregulations contribute to MPA-induced cognitive problems is unknown. In a first study, we found that 5-HT expression levels, quantified by immunohistochemistry, and 5-HT release, quantified by in vivo microdialysis in awake mice, are reduced in PFC of adult MPA mice. MPA mice also show impaired body temperature regulation following injection of the 5-HT1A receptor agonist 8-OH-DPAT, suggesting the presence of deficits in 5-HT auto-receptor function on raphe neurons. Finally, chronic treatment of adult MPA mice with fluoxetine, an inhibitor of 5-HT reuptake transporter, or the 5-HT1A receptor agonist tandospirone rescues cognitive flexibility and memory impairments. All together, these data demonstrate that the development of 5-HT system function is vulnerable to moderate perinatal asphyxia. 5-HT hypofunction might in turn contribute to long-term cognitive impairment in adulthood, indicating a potential target for pharmacological therapies. GABAergic circuits comprise an astonishing variety of different cell types, which are likely recruited by different behavioral events. An important subtype of GABAergic cells, the fast-spiking, parvalbumin-positive (PV) cells, generate action potentials at high frequency and synchronize the activity of excitatory pyramidal neurons. PV cells are particularly important for the generation of gamma oscillations, which in turn regulate many cognitive functions including goal-directed attentional processing and working memory. Recent findings indicate that PV cells utilize much more energy than other cortical neurons, which may render them highly vulnerable to conditions of metabolic and oxidative stress caused by MPA. Our data showed that PV expression is impaired in adult MPA mice. We further found that the expression level of the neurotrophin receptor p75NTR, which limits PV cell maturation during the first postnatal week, is increased in MPA mice. Genetic deletion of p75NTR in GABAergic neurons expressing the transcription factor Nkx2.1, which include PV cells, protects mice from PV levels loss and the long-term cognitive effects of MPA. Finally, one week treatment with a p75NTR inhibitor starting after MPA completely rescues the cognitive and cortical activity deficits in adult mice. All together this data reveals a potential molecular target for the treatment of the cognitive alterations caused by MPA.