Orientador: Camila Marconi / Resumo: A microbiota vaginal normal é predominantemente composta por espécies de Lactobacillus spp., enquanto que o principal tipo de alteração de microbiota vaginal, a vaginose bacteriana (VB), é composta por uma diversidade de bactérias, não pela predominância de uma única espécie. Todavia, dentre as bactérias mais prevalentes nessa condição estão Atopobium vaginae e Gardnerella vaginalis, espécies conhecidamente produtoras de fatores de virulência, dentre eles a capacidade de formar biofilmes vaginais, dificultando a ação de drogas antimicrobianas, como o metronidazol, para o tratamento da VB. No caso particular da G. vaginalis deve-se destacar a produção de sialidases por algumas linhagens que conferem a capacidade de comprometer a barreira mucosa e degradar IgA vaginal, contribuindo para a adesão e proliferação de diversas espécies bacterianas que pertencem ao core patológico da VB. Entretanto, a ação das sialidases sobre a composição desse microbioma vaginal ainda não foi investigada. Dessa forma, os objetivos desse estudo foram: (1) determinar se as cargas cérvico-vaginais das espécies A. vaginae e G. vaginalis na VB estão associadas com o desfecho do tratamento, utilizando o tratamento convencional com metronidazol; (2) avaliar a influência da presença do gene da sialidase de G. vaginalis e da produção de sialidases sobre a composição do microbioma vaginal. Para tanto, foram incluídas 245 mulheres em idade reprodutiva no primeiro estudo, classificadas de acordo com o padrão d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

L’objectif était la caractérisation moléculaire de la vaginose bactérienne (VB) et l’identification d’une relation entre anomalies moléculaires de la flore vaginale et prématurité. Nous avons élaboré un outil de quantification par PCR spécifique en temps réel ciblant 8 microorganismes impliqués dans la VB. Seule la combinaison de la quantification d’Atopobium vaginae (108 copies/mL) à celle de Gardnerella vaginalis (109 copies/mL) présentait une sensibilité (95%) et une spécificité (99%) élevées pour le diagnostic de VB. La classification des flores selon la présence d’une VB, d’après les 2 méthodes de référence (critères d’Amsel et score de Nugent), et d’après notre outil moléculaire était concordante dans 94.5% des cas (kappa=0.81, intervalle de confiance [IC] 95%: 0.70-0.81). La discordance portait sur 9 flores intermédiaires (5.5%) dont les concentrations en G. vaginalis et en A. vaginae étaient élevées. De plus, nous avons démontré une étroite corrélation entre l’auto-prélèvement vaginal et le prélèvement réalisé par le médecin pour la quantification microbienne. Cette méthode alternative semble utile pour le suivi des anomalies de la flore vaginale. Nous avons enfin établi un lien entre la composition de la flore vaginale et le risque de prématurité parmi 90 patientes hospitalisées pour une menace d’accouchement prématuré (MAP). L’analyse par courbe de survie montrait un délai raccourci entre le diagnostic de MAP et le terme de l’accouchement en présence de concentrations élevées en A. vaginae ou en G. vaginalis (hasard ratio: 3.3; IC 95%: 1.1-9.5). Notre travail a contribué à améliorer l’analyse de la flore vaginale et à l’évaluation de son lien avec la prématurité. / The aim was the molecular characterization of bacterial vaginosis (BV) and the estimation of the relationship between molecular abnormalities and preterm delivery. A quantitative molecular tool targeting 8 bacterial vaginosis-related microorganisms was developed using specific real-time PCR. Only the combination of the quantification of Atopobium vaginae (108 copies/mL) and Gardnerella vaginalis (109 copies/ml) had an excellent sensitivity (95%) and specificity (99%) for the diagnosis of BV. The categorization of the vaginal flora according to the presence of BV based on the 2 reference methods (Amsel criteria and Nugent score), and our molecular tool was agree in 94.5% of the cases (kappa=0.81, 95% confidence interval [CI] 0.70-0.81). There was disagreement for 9 intermediate floras (5.5%) for which vaginal concentrations of A. vaginae and G. vaginalis were high. We also reported a good agreement for bacterial quantification in self-collected compared with practitioner-collected vaginal swabs. This method provides an alternative to practitioner-collected swabs especially for follow-up. We finally demonstrated a relationship between the high vaginal concentrations of A. vaginae and G. vaginalis and the risk of preterm delivery among 90 women with preterm labor. Survival curves analysis for preterm labor-to-delivery interval showed a significantly shorter interval for high vaginal concentrations of both A. vaginae or G. vaginalis (hazard ratio: 3.3; IC 95%: 1.1-9.5). Our work improved vaginal flora analysis and investigated the relationship with preterm delivery.

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Vaginose bacteriana (VB) é uma síndrome caracterizada por uma depleção de espécies de Lactobacillus predominantes na microbiota vaginal saudável e um aumento de outras espécies, principalmente Gardnerella vaginalis e Atopobium vaginae. O objetivo desse trabalho foi avaliar a microbiota vaginal de pacientes com e sem VB, atendidas no serviço de ginecologia do SUS e da rede privada de Juiz de Fora/MG, quanto a sua diversidade bacteriana e quantificar os principais gêneros e espécies envolvidos na patogênese da doença. Secreção vaginal de pacientes com e sem VB foram coletadas e transportadas para o laboratório, em meio específico. Lâminas foram coradas pelo método de Gram, a fim de estabelecer o escore de Nugent para avaliação das pacientes entre saudáveis e doentes. O DNA total das secreções foi extraído e PCR quantitativa (qPCR) em tempo real foi realizada, utilizando primers específicos para Lactobacillus spp., G. vaginalis, A. vaginae, Mobiluncus spp. e Mycoplasma hominis. A partir do DNA total extraído também foi realizada PCR convencional utilizando primers específicos para Domínio Bacteria e os filos Actinobacteria e Firmicutes, e em seguida foi realizada técnica de Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (DGGE). Foi realizada também a técnica de Hibridização Fluorescente in situ (FISH), para identificação e quantificação de bactérias pertencentes aos filos Actinobacteria, Firmicutes, α-Proteobactéria, β-Proteobactéria e γ-Proteobactéria. Entre os grupos saudável e doente (VB) foi observada diferença estatisticamente significativa na quantificação de Lactobacillus spp., G. vaginalis, A. vaginae, Mobiluncus spp. e M. hominis. Lactobacillus spp. esteve presente em maior concentração no grupo saudável enquanto que G. vaginalis, A. vaginae, Mobiluncus spp. e M. hominis estiveram presentes em maior concentração no grupo doente (VB). De um modo geral, a concentração de G. vaginalis e Mobiluncus spp. elevou-se com o aumento do escore de Nugent; em contrapartida, a concentração de Lactobacillus spp., decresceu com o aumento do escore de Nugent. A análise de agrupamento mostrou que, com algumas exceções, os perfis de pacientes apresentando o mesmo status de saúde tenderam a se agrupar juntos, porém em clusters separados e que os agrupamentos parecem ser regidos pelo status de saúde das pacientes. As variáveis riqueza e diversidade revelaram perfis complexos entre as amostras e a análise de componente principal (PCA) mostrou que as amostras dentro do grupo VB tenderam a se agrupar na análise dos filos Actinobacteria e Firmicutes. Não foi observada diferença estatisticamente significativa entre os grupos saudável e doente (VB) em relação a quantificação dos filos Actinobacteria, Firmicutes, α-Proteobactéria, β-Proteobactéria e γ-Proteobactéria. O uso combinado das técnicas DGGE, FISH e PCR quantitativa em tempo real representam uma estratégia bem sucedida para o monitoramento qualitativo e quantitativo de alterações na microbiota vaginal relacionadas a doenças infecciosas, como a vaginose bacteriana. Tal fato pode contribuir tanto para o desenvolvimento de ferramentas que auxiliem no diagnóstico de mulheres acometidas pela VB, especialmente as pacientes assintomáticas, e também pode contribuir com a melhoria e otimização dos regimes terapêuticos adotados na prática clínica para o tratamento da VB. / The vaginal microbiota is considered a complex environment where several bacterial species coexist and develop complex relationships. Bacterial vaginosis (BV) is a syndrome characterized by a depletion of Lactobacillus species prevalent in healthy vaginal microbiota and an increase in other species, especially Gardnerella vaginalis and Atopobium vaginae. The aim of this study was to evaluate the vaginal microbiota of patients with and without BV, attended at the gynecology service of the SUS and the private service of health of Juiz de Fora/MG, as its bacterial diversity and quantify the major genera and species involved in the disease pathogenesis. Vaginal secretions of patients with and without BV were collected and transported to the laboratory in a specific medium. Slides were stained by the Gram method in order to establish the Nugent Score for evaluation of patients between healthy and sick. The total DNA of secretions was extracted and Real-time Polymerase Chain Reaction (qPCR) was performed using specific primers for Lactobacillus spp., G. vaginalis, A. vaginae, Mobiluncus spp. and Mycoplasma hominis. From the total DNA extracted from conventional PCR also was performed using specific primers to Bacteria domain and Actinobacteria and Firmicutes phyla, and then Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) was performed. The identification and quantification of bacteria belonging to the phyla Actinobacteria, Firmicutes, α-Proteobacteria, β-Proteobacteria and γ-Proteobacteria were performed by the technique of Fluorescence in situ Hybridization (FISH). Among the healthy and diseased (VB) groups statistically significant difference was observed in the quantification of Lactobacillus spp., G. vaginalis, A. vaginae, Mobiluncus spp. and M. hominis. Lactobacillus spp. was present in higher concentration in the healthy group while G. vaginalis, A. vaginae, Mobiluncus spp. and M. hominis were present in higher concentrations in the patient group (VB). In general, the concentration of G. vaginalis, and Mobiluncus spp. increased with the increment in the Nugent Score; however, the concentration of Lactobacillus spp decreased with the raise of the Nugent score. The cluster analyses showed that, with few exceptions, the profiles from patients with the same health status grouped together in separate clusters and there was a distinct separation based on the health status of the patients. The richness and diversity showed complex profiles and principal component analysis (PCA) showed that the samples within the VB group grouped together on the analysis of the phyla Firmicutes and Actinobacteria. No statistically significant difference was observed between healthy and diseased groups (VB) for quantification of the phyla Actinobacteria, Firmicutes, α-Proteobacteria, β-Proteobacteria and γ-Proteobacteria. The combined use of techniques DGGE, FISH and real-time quantitative PCR represent a successful strategy for qualitative and quantitative monitoring of changes in vaginal microbiota related to infectious diseases such as Bacterial Vaginosis.This may contribute to both the development of tools that aid in the diagnosis of women affected by BV, especially asymptomatic patients, and may also contribute to the improvement and optimization of therapeutic regimes adopted in clinical practice for the treatment of BV.