Die Studie des menschlichen T1D (Type 1 Diabetes), als eine Autoimmunerkrankung der Bauchspeicheldrüse, könnte man mit der Entdeckung von Insulin unter Verwendung von pankreatectomisierten Tieren argumentieren. Es folgten Studien zur Verfeinerung des Insulinersatzes, Verbesserung der Technologien und zur Untersuchung von Stoffwechsel- und Autoimmunphänomenen in Blutproben. Während Tiermodelle eine Endorgananalyse erlaubten, war die Untersuchung der menschlichen Bauchspeicheldrüse im Vergleich zu Studien mit peripherem Blut stark eingeschränkt. Anhand der so genannten peripheren Blutstudien, die nPOD (Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes), konnte eine menschliche Bauchspeicheldrüsenbank mit Proben von Personen zusammenzustellt werden, die durch die Analyse peripherer Blut-Autoantikörper (Wasserfall, et al., 2016) für T1D als risikoreich eingestuft wurde [CW 1]. Das Hauptziel meiner Dissertation bestand darin, mit diesen noch immer ansteigenden Proben, einige grundlegende Fragen der menschlichen T1D-Biologie zu beantworten. Zuerst konnten meine Kollegen und ich Insulitis bei Autoantikörper-positiven Probanden und bei Patienten mit T1D-Diagnose (Campbell-Thompson, et al., 2016a) studieren [CW 2]. Dabei fanden wir in 2 von 5 Pankreasproben Insulitis von Autoantikörper-positiven Probanden, beide mit der Kombination GADA und IA-2A. In Pankreasproben von T1D-Spendern mit weniger als einem Jahr Krankheitsdauer hatten 100% der Patienten eine Insulitis. Während, in denen mit mehr als einem Jahr Krankheitsdauer, 23% der Insulitis aufzeigten. Dies impliziert, dass die Insulitis vorwiegend zum Krankheitsbeginn auftritt und danach abnimmt. Das steht im extremen Gegensatz zum NOD-Mausmodell, bei dem Insulitis sehr früh auftritt und bei 100% der Inzuchtmäuse, unabhängig davon, ob sie T1D entwickeln oder nicht. Auch im Gegensatz zum NOD, während β-Zellmasse in T1D-Pankreasproben reduziert wurde, fehlte es nicht ganz. Wir bestätigten ebenfalls die Ergebnisse einer reduzierten Gesamtmasse menschlicher T1D-Pankreasproben, die nicht durch fehlende β-Zellen erklärt werden, da die nur einen kleinen Teil des Organs ausmachen. Dies impliziert den Verlust von exokrinem Gewebe in einer Art und Weise, die bis heute ungeklärt bleibt. Weiterhin haben wir getestet, ob Komplement eine potenzielle Rolle in T1D spielt, indem die C4d-Deposition als Marker für (Auto) Antikörpervermittelte Ereignisse verwendet wurde (Rowe, et al., 2013) [CW 3]. Unerwarteterweise fanden wir heraus, dass es erhöhte C4d Antikörperfärbung in T1D Pankreasproben gab. Dies implizierte die Verteilung potentieller exokriner Entzündungen und nicht unbedingt Insel-spezifische Ereignisse. Ob dies mit den Befunden der kleineren Bauchspeicheldrüse in T1D zusammenhängt, ist eine naheliegende Frage für zukünftige Studien. Bei der Zusammenstellung dieser Begriffe verwendete ich eine Technik, um Proteine aus gefrorenen Abschnitten der Bauchspeicheldrüse zu extrahieren und fand die Persistenz von Proinsulin, während die Insulin- und C-Peptid-Konzentrationen niedrig bis nicht nachweisbar durch ELISA in T1D-Proben waren (Wasserfall, et al., 2017) [CW 4]. Weiterhin konnten wir zeigen, dass INS mRNA durch ISH und RT-qPCR zusammen mit Proinsulin und Insulin durch Immunhistochemie anwesend war. Wir waren ebenfalls in der Lage, die Progression von T1D semi-quantifizieren, durch den Verlust von Insulin in Inselchen, sondern die Persistenz von Insulin-positiven Einzelzellen mit längerer Krankheitsdauer. Das Enzym PCSK1 wurde außerdem in T1D-Proben durch RT-qPCR reduziert, was auf einen möglichen Mechanismus für die unvollständige Verarbeitung von Proinsulin zu reifem Insulin und CPeptid hindeutet. Die Aufklärung dieses Prozesses und die Frage, ob die einzelnen insulinpositiven Zellen als therapeutische Option gerettet werden können oder ob sie die Zellen von β dedifferenzieren, werden in Zukunft weiterverfolgt.:TABLE OF CONTENTS II LIST OF ABBREVIATIONS IV LIST OF FIGURES V SUMMARY 1 1 MOTIVATION 1 2 STATE OF THE ART 6 2.1 Type 1 diabetes is an autoimmune disease 6 2.2 Models of type 1 diabetes 6 2.3 Humoral immune responses in type 1 diabetes 7 2.4 Genetics and Cell mediated immunity in type 1 diabetes 8 2.5 The lesion in type 1 diabetes 11 2.6 Prediction of type 1 diabetes in the general human population 14 3 OBJECTIVES 17 4 OWN RESEARCH RESULTS 19 4.1 Screening organ donors for type 1 diabetes autoantibodies is feasible 19 4.2 The insulitis lesion in humans reveals the heterogeneity of type 1 diabetes 20 4.3 Complement deposition in the human pancreas is not specific to islet blood vessels 22 4.4 The pancreas of individuals with type 1 diabetes shows progressive loss of insulin, but proinsulin persists 22 5 DISCUSSION 26 5.1 Even with a low prevalence disease such as T1D it is possible to screen organ donors for the presence of disease specific autoantibodies 26 5.2 Insulitis in the natural history of T1D 26 5.3 Complement deposition in the natural history of T1D 28 5.4 Presence of endocrine hormones in the natural history of T1D 29 6 RESUME 31 SUMMARY GERMAN 33 BIBLIOGRAPHY 35 LIST OF PUBLICATIONS 53 [CW1] Validation of a rapid type 1 diabetes screening assay for community-based screening of organ donors to identify subjects at increased risk for the disease 54 [CW2] Insulitis and β-Cell Mass in the Natural History of Type 1 Diabetes 66 [CW3] Increased Complement Activation in Human Type 1 Diabetes Pancreata 82 [CW4] Persistence of Pancreatic Insulin mRNA Expression and Proinsulin Protein in Type 1 Diabetes Pancreata 87 CURRICULUM VITAE 101 ACKNOWLEDGEMENTS 121 SELBSTSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG 124 ANLAGE 1 125 ANLAGE 2 127

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Die Myasthenia Gravis (MG) ist ein Prototyp einer Antikörper-vermittelte Autoimmunerkrankung. Die Autoantikörper richten sich hauptsächlich gegen den Acetylcholinrezeptor (AChR). Welche Bedeutung TH17-Zellen für die Pathogenese der MG haben, konnte bisher noch nie direkt gezeigt werden. Mithilfe des Tiermodells Experimentelle Autoimmune Myasthenia Gravis (EAMG) sollte die Rolle der TH17-Zellen im Rahmen dieser Arbeit analysiert werden. Eine signifikante Anzahl tAChR-spezifischer CD4+ T-Zellen, die IL17 exprimieren, konnte nach der Immunisierung mit torpedo AChR in CFA in Wildtyp-Mäusen (WT) beobachtet werden. Die IL17ko Mäuse entwickelten weniger oder keine EAMG Symptome, obwohl weder die Frequenz tAChR-spezifischer CD4+ T-Zellen, die IL2, IFNgamma oder IL21 sezernierten noch der prozentuale Anteil der FoxP3+ Treg-Zellen einen Unterschied aufwiesen. Im Gegensatz dazu waren die Level pathogener anti-muriner AChR Antikörper statistisch geringer in IL17ko Mäusen, während bei anti-tAChR Antikörpertitern kein Unterschied festzustellen war. Ähnliche Resultate erbrachten TCRbeta/delta ko Mäuse rekonstituiert mit entweder WT oder IL17ko CD4+ T-Zellen. Die Depletion von Treg-Zellen mithilfe von DEREG Mäusen in der frühen Erkrankungsphase zeigte keine signifikanten Unterschiede bezüglich der analysierten Parameter. Zusammenfassend lässt sich hier festhalten, dass die Frequenz und Differenzierung Antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen sowie der Antikörpertiter gegen den tAChR nicht durch die IL17-Defizienz im EAMG Modell beeinflusst wird. Auch hat eine frühe Treg-Zell-Depletion keinen Einfluß auf die Erkrankungsstärke. Allerdings scheint das Durchbrechen der B-Zell Toleranz, das zur Produktion von pathogenen Anti-mAChR-spezifischen Antikörpern und somit zu einer Induktion der Erkrankung führt, abhängig von IL17-produzierenden CD4+ T-Zellen zu sein. Der Einsatz von Anti-IL17-Antikörpern könnte insofern auch für die MG eine Therapieoption darstellen. / Myasthenia gravis (MG) is an antibody-mediated autoimmune disease. The autoantibodies are directed against the acetylcholine receptor (AChR). The importance TH17 cells have for MG pathogenesis has never been directly demonstrated. Therefore, the analysis of TH17 cells in the Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis (EAMG) animal model was the aim of this work. Here, it is shown that in wildtype mice (WT) significant numbers of IL17-producing tAChR-specific CD4+ T cells could be observed after immunization with torpedo AChR in CFA. IL17ko mice developed less or no EAMG symptoms, although frequencies of tAChR-specific CD4+T cells secreting IL2, IFNgamma or IL21 as well as percentage of FoxP3+ Treg cells were similar. In contrast, pathogenic anti-murine AChR antibody levels were significantly lower in IL17ko mice, while anti-tAChR antibody levels were equal. Similar results were obtained by the reconstitution of TCR beta/delta ko mice with CD4+ T cells of either WT or IL17ko origin. For the depletion of Treg cells using DEREG mice in the initial phase of the disease no significant differences could be detected in terms of the analyzed parameters. In summary, this thesis demonstrates, that frequencies and differentiation of antigen specific CD4+ T cells as well as the level of anti-tAChR specific antibody titers are not affected by IL17-deficiency in the EAMG model. Likewise, an early Treg cell depletion seems to have no impact on disease severity. However, breaking of B cell tolerance resulting in pathogenic anti-murine AChR specific antibodies and subsequent disease induction, seems to be dependent on IL17 producing CD4+ T cells. In this respect, the application of anti-IL17 antibodies could also become a MG therapy option.

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