Après un certain nombre de divisions, les cellules primaires entrent en sénescence, un état caractérisé par des modifications morphologiques, biochimiques et un arrêt de croissance. Deux principaux mécanismes concourent à l'établissement de la sénescence: le raccourcissement Après un certain nombre de divisions, les cellules primaires entrent en sénescence, un état caractérisé par des modifications des télomères et l'accumulation de dommages oxydants. La sénescence est généralement considérée comme une barrière au développement tumoral. Nous montrons dans ce travail que la sénescence pourrait aussi contribuer à l'initiation cancéreuse. En effet, dans des cultures de kératinocytes sénescents nous observons l'émergence systématique de cellules transformées et tumorigènes. Ces cellules se forment à partir d'une fraction de cellules sénescentes, par un mécanisme de mitose atypique. La sénescence des kératinocytes s'accompagne d'une accumulation de dommages oxydants mutagènes (cassures simple brin, guanines oxydées et pontages moléculaires). Par ailleurs, les télomères ne sont que très peu érodés et les voies d'arrêt dans le cycle cellulaire induites par les cassures double-brin ne sont pas activées. Pour comparaison, dans les fibroblastes, qui n'émergent jamais, on observe à la sénescence moins de dommages oxydants dans le noyau, des télomères devenus très courts et l'activation des voies d'arrêt dans le cycle. Ainsi, l'émergence résulterait de l'effet mutagène du stress oxydant associé et nécessiterait des télomères suffisamment longs. En conclusion, nous mettons en évidence dans ces travaux un nouveau mécanisme potentiel de cancérisation des cellules épithéliales, dans lequel la sénescence constituerait l'étape initiale et le stress oxydant jouerait le rôle de carcinogène endogène. / After a finite number of divisions, primary cells enter senescence, a state characterized by morphological and biochemical modifications, and by cell cycle arrest. Two mains events promote the establishment of senescence: telomere shortening and cumulative oxidative stress. Senescence is generally considered as a barrier against tumorigenesis. We show in this work that senescence could also contribute to the cancerous initiation. Indeed, in culture of senescent keratinocytes we observe the systematic emergence of transformed and tumorigenic cells. These cells arise from a fraction of the senescent cell population, by a mechanism of atypical mitosis. Keratinocyte senescence is accompanied by an accumulation of mutagenic oxidative damages (single-strand breaks, oxidized guanines, and cross-linkings). ln addition, telomeres are weakly eroded and cell cycle arrest pathways induced by double-strand breaks are not activated. ln comparison, in fibroblasts, which never emerge, we observe less oxidative damages in nucleus, very short telomeres, and the activation of cel! cycle arrest pathways. Hence, emergence would result from mutagenic oxidative stress and would require enough long telomeres. ln conclusion, we highlight in this work a new potential mechanism of epithelial cel! carcinogenesis, wherein senescence would constitute the initial step and oxidative stress would act as an endogenous carcinogen.

La senescence est un état d’arrêt prolifératif mis en place par les cellules en réponse à différents stress (raccourcissement des télomères, stress oxydant, ou activation d’oncogènes). Bien que la sénescence soit considérée comme irréversible, nous avons récemment montré, en utilisant des kératinocytes humains normaux d’épiderme, que certaines cellules sénescentes réactivent spontanément le processus mitotique pour générer des cellules proliférantes, baptisées émergentes post-sénescence, qui sont transformées et tumorigènes en souris nude. Nous avons montré dans la première partie de ce travail que les cellules sénescentes qui ne génèrent pas de cellules émergentes meurent. La mort engagée à la sénescence n’est ni apoptotique ni nécrotique, mais implique l’élimination par macroautophagie de nombreux composés cellulaires vitaux. Nous avons ensuite démontré que le stress oxydant, via les dommages qu’il crée, notamment aux niveaux nucléaire et mitochondrial, est responsable de l’activation de la mort cellulaire programmée par macroautophagie. Les cellules sénescentes progénitrices des cellules néoplasiques génèrent quant à elle moins d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) que le reste des cellules sénescentes, ce qui leur permet d’échapper à la mort. Cependant, pour générer les cellules émergentes, elles doivent maintenir une activité macroautophagique de ménage. L’ensemble de ces travaux démontre donc que le devenir des kératinocytes sénescents dépend de leur niveau de ROS. Un haut niveau de ROS induirait une activité macroautophagique élevée et létale, alors qu’un niveau plus bas induirait une activité trop faible pour induire la mort, mais suffisante pour éliminer les composés cellulaires oxydés. Dans cette situation, les cellules deviendraient permissives à l’évolution néoplasique si les dommages oxydants touchent l’ADN et affectent des oncogènes, suppresseurs de tumeurs, ou d’autres régulateurs fondamentaux. / Senescence is a non proliferative state that occurs in response to telomere shortening, oxidative stress or oncogenic activation. Whereas senescence is generally considered as an irreversible growth arrest, we recently reported, using Normal Human Epidermal Keratinocytes (NHEKs), that few senescent cells can spontaneously reactivate a mitotic process to generate so-called post-senescence emergent cells which are transformed and able to form skin hyperplasia in nude mice. In the first part of this work, we have investigated the outcome of the majority of senescent cells that do not generate emergent cells. We highlighted that senescent cells massively die during the growth arrest. Interestingly, the death is not associated with apoptotic or necrotic features but involves the elimination of numerous vital cells components by macroautophagy. We next investigated the mechanism that activates the autophagic programmed cell death in senescent keratinocytes. We show that oxidative stress occuring during senescence causes numerous cellular damages, notably to nucleus and mitochondria, that activate the macroautophagic process to ultimately lead to the death. In the last part of this work, we have investigated the relationship between oxidative stress and macroautophagy during the generation of post-senescence emergent cells. We show that progenitors of these neoplastic cells display less reactive oxygen species (ROS) production than other senescent keratinocytes, and hence escape autophagic cell death. However, in order to generate PS emergent cells, they have to maintain an housekeeping autophagic activity. Taken together, these results indicate that the outcome of a senescent cell is driven by its ROS level. A high ROS level induces a high and lethal activation of autophagy. At a lower ROS level, the cell activates a moderated autophagy that fails to induce death but favors the elimination of oxidized proteins and organelles. By this way, this cell becomes permissive to neoplastic evolution consecutively to the putative oxidative alteration of oncogenes, tumor suppressor genes or other crucial cell regulators.

München, Techn. Univ., Diss., 2010.

Le rôle protecteur des HDL vis-à-vis des maladies cardiovasculaires est principalement attribué à leur participation dans le mécanisme du Transport Retour du Cholestérol (TRC). Ce processus permet l’élimination de l’excès de cholestérol des tissus périphériques vers le foie, où il va être éliminé dans les sécrétions biliaires. Notre équipe a identifié à la surface des cellules hépatocytaires un récepteur à l’apoA-I (apolipoprotéine A1), la protéine majoritaire des HDL, semblable à l’ATP synthase mitochondriale. Cette ATP synthase de surface appelée ecto-F1-ATPase est impliquée dans le mécanisme d’endocytose hépatique du cholestérol. En effet, la liaison de l’apoA-I sur l’ecto-F1-ATPase stimule l’activité ATPasique de cette dernière, produisant alors de l’ADP extracellulaire qui activera ensuite le récepteur purinergique P2Y13, aboutissant à l’endocytose de l’holoparticule de HDL. L’expression membranaire de l’ecto-F1-ATPase a aussi été associée à d’autres processus physiologiques et physiopathologiques tels que l’immunité innée, l’angiogenèse et le cancer. Mais malgré les nombreuses études s’intéressant aux fonctions de la F1-ATPase à la membrane des cellules, les mécanismes de régulation de son expression ectopique ne sont pas encore connus et sont l’objet des travaux présentés dans cette thèse. Des résultats préliminaires suggèrent que le transport conventionnel ne serait pas impliqué dans la régulation de l’ecto-F1-ATPase à la membrane plasmique. L’adressage de ce complexe est donc régulé par d’autres mécanismes physiologiques. Notamment, l’autophagie a été démontrée comme pouvant réguler l’expression de certaines protéines à la membrane plasmique. Le complexe F1FO-ATPase étant classiquement localisé à la mitochondrie, nous avons donc étudié si les mécanismes de la mitophagie, un mécanisme d’autophagie spécifique des mitochondries, sont impliqués dans la régulation de l’ecto-F1-ATPase. / The atheroprotective property of High Density Lipoprotein (HDL) is mostly attributed to its involvement in Reverse Cholesterol Transport (RCT). This process removes excess cholesterol from peripheral tissues and delivers cholesterol to the liver for metabolism and bile excretion. Our team previously identified an ATP synthase-like complex expressed at the hepatocytes plasma membrane as an apoA-I receptor. This surface ATP synthase is called ecto-F1-ATPase and is involved in HDL-Cholesterol uptake. On hepatocytes, apoA-I binding to ecto-F1-ATPase stimulates extracellular ATP hydrolysis into ADP and activates a P2Y13 mediated HDL holoparticle endocytosis pathway. Ectopic expression of ecto-F1-ATPase is also associated with other physiological and physiopathological processes such as innate immunity, angiogenesis and cancer. But despite numerous studies describing ecto-F1-ATPase function, regulation of its ectopic expression is not known and is investigated in this work. Preliminaries results suggest that conventional transport is not involved in the regulation of ecto-F1-ATPase expression. Thus, targeting of this complex to the plasma membrane is regulated by other mechanisms. In particular, autophagy has been described as a mechanism regulating plasma membrane targeting for several cytosolic protein. F1F0-ATPsynthase is classically located at the inner mitochondrial membrane, we investigated whether mitophagy, a process allowing the removal of damaged mitochondria through autophagy, are involved in the regulation of ecto-F1-ATPase plasma membrane expression.

L'autophagie est une voie cellulaire strictement régulée dont le but principal est la dégradation lysosomale et le recyclage ultérieur du matériel cytoplasmique afin de maintenir l'homéostasie cellulaire normale. Des défauts dans l'autophagie sont liés à une variété d'états pathologiques, dont le cancer. Le cancer est une maladie associée aux modifications des processus cellulaires fondamentaux tels que l'apoptose et l'autophagie. Le calcium régule une série de processus physiologiques et pathologiques tels que le vieillissement, la neurodégénérescence et le cancer. Si le rôle du calcium et des canaux calciques dans le cancer est bien établi, l'information sur la nature moléculaire des canaux régulant l’autophagie ainsi que les mécanismes de cette régulation reste encore limitée. Le rôle de l'autophagie dans le cancer est complexe. En effet, elle peut favoriser à la fois la prévention tumorale et la résistance aux traitements. Elle est souvent détectée dans les cellules cancéreuses en réponse aux expositions aux rayons et la chimiothérapie. Elle semble contribuer à la résistance thérapeutique de certains cancers. Il est maintenant bien établi que sa modulation peut potentiellement contribuer à la mise en œuvre des méthodes de traitement du cancer. Dans cette étude, nos travaux ont permis d’identifier le calcium intracellulaire, comme un régulateur important de l'autophagie. Ainsi, nous proposons un lien possible entre le calcium, les canaux calciques, l’autophagie et la progression du cancer. De plus, nous avons mis en évidence un nouveau modulateur de l’autophagie, le ML-9. Cet outil pourrait cibler l'autophagie et être utilise dans le traitement des cancers. / Autophagy is a tightly regulated cellular pathway the main purpose of which islysosomal degradation and subsequent recycling of cytoplasmic material to maintain normal cellular homeostasis. Defects in autophagy are linked to a variety of pathological states,including cancer. Cancer is the disease associated with abnormal tissue growth following an alteration in such fundamental cellular processes as apoptosis, proliferation, differentiation,migration and autophagy. Calcium is a ubiquitous secondary messenger which regulates plethora of physiological and pathological processes such as aging, neurodegeneration and cancer. The role of calcium and calcium-permeable channels in cancer is well-established, whereas theinformation about molecular nature of channels regulating autophagy and the mechanisms of this regulation is still limited. The role of autophagy in cancer is complex, as it can promoteboth tumor prevention and survival/treatment resistance. Elevated autophagy is often detected in cancer cells in response to radiation and chemotherapy. Furthermore, autophagy seems to contribute to the therapeutic resistance of some cancers. It's now clear that modulation of autophagy has a great potential in cancer diagnosis and treatment. Our findings identified intracellular calcium as an important regulator of autophagy. We propose a possible link between calcium, calcium permeable ion channels, autopohagy and cancer progression. Further, our results revealed a new autophagy modulator ML-9 as an attractive tool for targeting autophagy in cancer therapy.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / La capacité des cellules à migrer à distance de leur lieu de production est un élément clé du développement embryonnaire du cerveau. A l'âge adulte, dans le système nerveux central, la migration cellulaire est associée aux niches neurogéniques de la zone sous ventriculaire et du gyrus dentelé. Certaines conditions pathologiques ou lésions cérébrales peuvent créer un environnement pouvant attirer les précurseurs neuronaux en dehors de leurs voies habituelles de migration vers le site de lésion. Finalement, des déficits en migration durant le développement peuvent entrainer l'apparition de pathologies se traduisant par une organisation non conventionnelle des réseaux neuronaux pouvant conduire entre autres à l'apparition de troubles cognitifs ou de symptômes épileptiques. La migration des cellules est guidée par un ensemble complexe de signaux moléculaires, d'interactions physiques et de gradients électriques. C'est l'intégration de ces signaux au niveau intracellulaire qui coordonne la réponse migratoire de la cellule en modulant par exemple le cytosquelette, divers organites tels que les mitochondries ou des mécanismes tels que l'autophagie. Au cours des travaux présentés dans cette thèse, j'ai utilisé comme modèle d'étude la migration des neuroblastes dans le courant migratoire rostral, qui achemine les précurseurs neuronaux depuis la zone sous ventriculaire jusqu'au bulbe olfactif où ils intègrent les réseaux neuronaux existants. Dans le premier chapitre, je me suis intéressé à la contribution du mécanisme d'autophagie dans le contrôle de la migration cellulaire. Nous avons montré que l'autophagie est nécessaire au maintien d'une migration normale et que ce mécanisme est régulé temporellement et spatialement durant la migration. Son activation est liée au niveau énergétique intracellulaire et passe par l'activation d'AMPK, qui est le senseur d'énergie majeur de la cellule. Dans un deuxième temps, je me suis intéressé à l'impact sur la migration cellulaire de mutations des cadhérines Fat4 et Dchs1 qui entrainent chez l'humain un phénotype d'hétérotopie neuronale périventriculaire. Grâce à l'utilisation de greffes de cellules progénitrices issues de cellules humaines pluripotentes induites (dont l'acronyme anglais est iPSC) j'ai pu confirmer un défaut de migration des cellules présentant des mutations pour l'une ou l'autre de ces protéines. Pour finir nous avons aussi pu montrer que ce défaut de migration est accompagné d'une dysfonction dans le flux d'autophagie et une diminution du nombre de lysosomes disponibles. / The ability of cell to migrate away from their sites of production is a major process during embryonic and postnatal brains development allowing for a correct positioning of cells. During adulthood, in the central nervous system, cell migration is still present and, under physiological conditions, is associated with neurogenic niches of the subventricular zone and the dentate gyrus. Some pathologies or brain damaged could de-route migratory neurons away from their normal paths of migration to lesions sites. It should be also mentioned that during embryonic development, migration-associated disorders could lead to brain malformation resulting in cognitive disorder or epilepsy. Migratory behaviors of cells is determined by a complex mixture of extrinsic molecular cues, physical scaffold, or electrical gradient. The integration of these signals at the cellular level creates a coordinated response of intracellular elements like cytoskeleton, mitochondria, or autophagy. In this work, I studied the role of autophagy in neuronal migration under physiological and pathological conditions by using a migration of neuroblasts from the subventricular zone to the olfactory bulb along the rostral migratory stream as model system. In the first chapter of my thesis, I studied the contribution of autophagy in the control of cell migration under physiological conditions. We showed that autophagy is spatially and temporally regulated in migrating neuroblasts and maintains a normal rate of migratory event. This process is controlled by intracellular ATP/ADP level via the activation of AMPK In the second part of this work, I focused on mutation for paired cadherins Fat4 and Dchs1 leading to periventricular neuronal heterotopia phenotypes in humans. By grafting in the pups with NPCs derived from human iPSC with mutation form Fat4 or Dchs1, I showed default of migration in vivo of NPCs with these two mutations. We also showed that these cells exhibit altered autophagy flux associated with a decreased in lysosomal vesicles.

Résumé: L’autophagie est un processus essentiel au maintien de l’homéostasie cellulaire. Elle permet de dégrader et recycler aussi bien des organelles entières que des composants cytoplasmiques non fonctionnels. De plus, l’augmentation d’autophagie en condition de stress constitue une réponse adaptative favorisant la survie cellulaire. Chez les cardiomyocytes, l’autophagie en condition basale est indispensable au renouvellement, entre autres, des mitochondries et des protéines formant les sarcomères. De plus, les stress tels l’ischémie cardiaque ou la carence en nutriments induisent une augmentation de l’autophagie protectrice. Dans certaines conditions extrêmes, il a été suggéré qu’un surcroît d’autophagie puisse toutefois exacerber la pathologie cardiaque en provoquant la mort des cardiomyocytes. Considérant l’importance de ce processus dans la physiopathologie cardiaque, l’identification des mécanismes signalétiques régulant l’autophagie chez les cardiomyocytes a été le sujet de recherches intenses. À cet effet, l’activation des Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) a été démontrée pour réguler, avec d’autres voies signalétiques, l’autophagie et l’apoptose des cardiomyocytes. Il est donc probable que les Dual-Specificity Phosphatase (DUSP), enzymes clés contrôlant l’activité des MAPK, participent aussi à la régulation de l’autophagie. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons induit l’autophagie chez des cardiomyocytes isolés de rats nouveau-nés en culture. L’analyse de marqueurs d’autophagie par immunobuvardage démontre que l’activation des MAPK ERK1/2 et p38 corrèle avec l’activité autophagique chez les cardiomyocytes. Dans ces conditions, la diminution d’expression de la majorité des ARNm encodant les différentes DUSP retrouvées chez les cardiomyocytes contraste de façon marquée avec l’augmentation d’expression de l’ARNm Dusp5. De plus, nous avons démontré par une étude de gain de fonction que l’activation soutenue de p38 par surexpression d’un mutant MKK6 constitutivement actif stimule l’autophagie chez les cardiomyocytes. De façon surprenante, la perte de fonction de p38 obtenue par surexpression d’un mutant p38 dominant négatif n’altère en rien la réponse autophagique initiatrice dans notre modèle in vitro. Nos résultats suggèrent que les DUSP puissent réguler, via leurs actions sur les MAPK, d’importantes étapes du processus autophagique chez les cardiomyocytes. / Abstract: Autophagy is a process essential to the maintenance of cellular homeostasis. It helps degrade and recycle whole organelles and nonfunctional cytoplasmic components. In addition, the adaptative up regulation of autophagy in stress condition promotes cell survival. In cardiomyocytes basal autophagy is essential to the renewal of, among others, mitochondria and proteins forming sarcomeres. In addition, stresses such as ischemic heart or nutrient deficiency induce an increase in protective autophagy. In extreme conditions, it has been suggested that autophagy may exacerbate cardiac disease causing the death of cardiomyocytes. Considering the importance of this process in cardiac pathophysiology, identify ing safety mechanisms regulating autophagy in cardiomyocytes has been the subject of intense research. To this end, activation of mitogen-activated protein kinase (MAPK) has been demonstrated to regulate, with other signaling pathways, autophagy and cardiomyocyte apoptosis. It is therefore likely that Dual-Specificity Phosphatases (DUSPs), key enzymes that control the activity of MAPKs, also participate in the regulation of autophagy. To test this hypothesis, we have induced autophagy in isolated cardiomyocytes of newborn rats in culture. Analysis of autophagy markers by immunoblotting demonstrated that the activation of MAPKs ERK1/2 and p38 correlates with autophagic activity in cardiomyocytes. Under these conditions, the decrease in expression of the majority of mRNAs encoding different DUSPs found in cardiomyocytes contrast sharply with the increase mRNA expression of Dusp5. Furthermore, we demonstrated by again of function study that sustained activation of p38 by overexpression of a constitutively active MKK6 mutant stimulates autophagy in cardiomyocytes. Surprisingly, the loss of p38 function obtained by overexpression of a dominant negative p38 mutant does not affect the autophagic response in our in vitro model, but increases the lipidation of autophagosomes marker LC3. Our results suggest that DUSPs can regulate, through their actions on MAPKs, important stages of autophagy in cardiomyocytes.

Le foie est un organe essentiel à la vie chez tous les mammifères. C’est un organe central du métabolisme énergétique et de la détoxification des substances xénobiotiques auxquelles l’individu est exposé. Le foie est la cible d’agressions diverses, telles que les virus, l’alcool, les substances chimiques présentes dans l’alimentation ou l’environnement. Il peut également subir destransformations pathologiques profondes, lors du diabète ou de l’obésité par exemple.La stéatose hépatique, caractérisée par une accumulation de triglycérides sous forme de vésiculesgénérant une réponse inflammatoire, est connue depuis de nombreuses années. Son étude a permisde définir un modèle en deux étapes (« two hits ») indispensables à la genèse d’une stéatohépatite ou NASH. La première est l’accumulation de lipides, la seconde consiste en la genèse d’un stress oxydant et la libération de cytokines. La NASH est une des conséquences pathologiques du syndrome métabolique au cours duquel une résistance des tissus à l’insuline se développe.Récemment, la composition des lipides accumulés dans la NASH a été décrite et montre la présence de cholestérol libre et de différents métabolites des acides gras dont la toxicité est grande mais variable. De façon surprenante, une nouvelle hypothèse tend à émerger quant aux rôles protecteurs de certaines catégories de lipides. En effet, le stockage des triglycérides sous forme de vésicules pourrait être un mécanisme de survie cellulaire (Neuschwander-Tetri, 2010). Il s’agirait principalement d’une tolérance à la mort cellulaire par nécrose ou apoptose. Dans ce contexte,l’activation de l’autophagie serait capitale et la nécrose ne serait plus un mécanisme non contrôlé,mais au contraire un système finement régulé.Des données expérimentales récentes suggèrent l’existence d’un réseau complexe d’interactions moléculaires qui lient, dans la NASH comme dans le cas de la cancérogenèse, le métabolisme énergétique, la réponse inflammatoire systémique et tissulaire et des altérations subcellulaires, telles que les lésions des mitochondries et du réticulum endoplasmique.Nous avons utilisé le cas particulier du préconditionnement ischémique, une technique chirurgicale qui consiste, grâce à de courtes périodes d’occlusion vasculaire avant l’ischémie, à conférer au tissu une protection contre les lésions d’ischémie/reperfusion (I/R), pour étudier les mécanismes de survie mis en place par les hépatocytes stéatosiques au cours d’un stress d’I/R. Dans deux contextes différents, celui d’une ischémie chaude au cours d’une hépatectomie partielle et celui d’une ischémie froide au cours de la transplantation hépatique, nous avons montré que l’autophagie peut jouer un rôle central dans la protection des hépatocytes stéatosiques. Cependant, il est envisageable qu’un dysfonctionnement de l’autophagie pourrait conduire à la genèse d’altérations cellulaires comme une instabilité génomique, caractéristique de la transformation cancéreuse. L’équilibre entre la survie et la mort cellulaire dépend donc de l’intégration de cette signalisation complexe, qui concerne l’état énergétique de la cellule, la réponse aux stress transitoires et l’adaptation aux stress chroniques. Dans ce contexte, l’autophagie semble jouer un rôle central dans l’intégration de la réponse aux stress (Kroemer et al 2010), ce qui pourrait favoriser directement ou indirectement la transformation cancéreuse d’une cellule.L’amélioration de la compréhension des mécanismes impliqués dans la tolérance et la survie des hépatocytes chargés de lipides en réponse à un stress inflammatoire, ischémique ou du réticulum endoplasmique semble donc essentielle. Elle permettrait en effet la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques qui pourraient améliorer la prise en charge des patients, augmenter le nombre de greffons disponibles pour les greffes, et la prévention des risques cancérogènes pour le foie. / Liver is a an essential to life organ in all mammals. It plays a central role in energy and drug metabolism. Liver is constantly challenged by damaging compounds such as viruses, alcohol and chemicals from food intake or from the environment. It can also undergo some deep pathological transformations, e.g. in diabetes or obesity. Liver steatosis has been known for many years, it is defined as an accumulation of triglycerides vesicles generating an inflammatory response in hepatocytes. A « two step hypothesis » has been proposed for the genesis of Non Alcoholic Steatohepatitis (NASH). The first step is the fat accumulation, the second step involves the generation of an oxidative stress and the release ofcytokines. NASH is one of the pathological consequences of metabolic syndrome, when insulin resistance occurs in the tissues.The composition of accumulated fat in NASH has been recently described and reveals the presence of free cholesterol and different fatty acids metabolites with a high but variable toxicity. Surprisingly, a new hypothesis tends to emerge about the protective effects of some types of lipides.Triglyceride storage in vesicles could indeed be a survival mechanism for cells (Neuschwander-Tetri, 2010). It is assumed that it would mainly result in an tolerance to cell death by necrosis orapoptosis. In this context, (activation of) autophagy would play a key-role and necrosis, usually an uncontrolled mechanism, would become accurately regulated. Similarly to oncogenesis, recent experimental data in NASH suggest that energy metabolism,systemic and tissular inflammatory response and subcellular alterations such as impaired mitochondria and ER are connected in a complex network of molecular interactions. Ischemic preconditioning (IP) is a surgical technique consisting of brief periods of vascular occlusion which confer protection against subsequent ischemia/reperfusion via endogenous protective mechanisms. We investigated the survival mechanisms set up by steatotic hepatocytes during I/R, with or without IP. In the following two situations, warm ischemia during partial hepatectomy and cold ischemia during liver transplantation, we pointed out that autophagy can play a central role in steatotic hepatocytes protection. However, an autophagy dysfunction might result in the generation of cellular impairments such as genomic instabilities, typical features of oncogenic transformation. Therefore, the balance between cell survival or death depends on the integration of a complex signaling, taking into account the cellular energetic state, the cell response to transient stress and its adaptation to chronical stress. In that context, autophagy seems to play a central role in the integration of stress response (Kroemer et al Mol Cell 2010), which could promote, directly or indirectly the malignant cell transformation.Therefore, it seems essential to improve the understanding of mechanisms involved in tolerance and survival of lipid-full hepatocytes in response to an inflammatory, ischemic or ER stress. Indeed, this would help developing new therapeutical strategies to improve patients care, increase the number of available grafts for transplants, and prevent cancer risks in liver.

Les espèces de la famille des Mycobacteriaceae sont caractérisées par une enveloppe bactérienne épaisse, riche en lipides, de structures uniques, connus pour être d'importants immunomodulateurs. Les mycobactéries sont majoritairement non pathogènes et sont rapidement éliminées par le système immunitaire de l'hôte. Cependant, certaines espèces causent des pathologies graves pour l'homme. Parmi ces espèces, M. tuberculosis, agent étiologique de la tuberculose ou M. abscessus, pathogène opportuniste responsable de mycobactérioses chez les patients immunodéprimés, sont capables d'échapper aux mécanismes fondamentaux du système immunitaire afin de se maintenir au sein des macrophages. Parmi ces mécanismes, l'autophagie, processus cellulaire de dégradation de composants cytoplasmiques par les lysosomes, est impliquée dans l'immunité anti-mycobactérienne en limitant la multiplication intracellulaire des mycobactéries. Les mécanismes moléculaires de l'activation de l'autophagie dans un contexte d'infection à mycobactérie et les mécanismes d'inhibition du processus mis en place par les mycobactéries pathogènes ou opportunistes sont partiellement caractérisés. Ainsi les objectifs principaux de ma thèse furent de (i) caractériser la réponse autophagique des macrophages suite à l'infection par trois espèces de mycobactéries, M. smegmatis (non pathogène), M. abscessus (opportuniste) et M. tuberculosis (pathogène) ; et (ii) de déterminer le rôle de deux facteurs de virulence lipidiques, les dimycocérosates de phthiocérols (DIM) et les sulfolipides (SL) dans la modulation du processus autophagique. Les résultats de ce travail de thèse ont permis (i) de caractériser un nouvel mécanisme d'induction de l'autophagie, ne reposant pas sur l'ubiquitination préalable de la mycobactérie et impliquant l'activation de la voie de signalisation des TLRs et, (ii) grâce à l'utilisation de différents mutants, de montrer que les lipides DIM, SL de M. tuberculosis et les glycopeptidolipides (GPL) de M. abscessus sont impliqués dans la limitation du processus autophagique au sein des macrophages. Ce travail de thèse met en évidence de nouveaux facteurs cellulaires et mycobactériens impliqués dans la régulation du processus autophagique, facteurs qui pourraient être des cibles potentielles dans le développement de vaccin ou de thérapies basées sur les défenses de l'hôte. / Mycobacteria are a large family of bacteria characterized by an atypical cell envelope rich in exotic lipids and glycoconjugates. Although most members of the mycobacteria family are non-pathogenic, a few members such as M. tuberculosis or M. abscessus are pathogenic or opportunistic for humankind. These mycobacteria cause diseases such as Tuberculosis or a wide array of infections in immunocompromised patients, and are able to escape fundamental mechanisms of macrophage innate immune responses. Amongst these mechanisms, autophagy, which is the selective engulfment of cytoplasmic components and degradation by lysosomes, contributes to anti-mycobacterial immunity by limiting the intracellular growth of mycobacteria. The molecular mechanism behind anti-mycobacterial autophagy and the strategies employed by pathogenic or opportunistic mycobacteria to limit this process have yet to be fully uncovered. My thesis project aimed to (i) decipher the autophagic response in macrophages induced by three species of mycobacteria: a non-pathogenic M.smegmatis, an opportunistic M.abcessus and a pathogenic M.tuberculosis and (ii) to determine the role of two lipidic virulence factors, phthiocerols of dimycocerosates (DIM) and sulfolipids (SL) in the modulation of the autophagy process to advantage the mycobacteria. This work has (i) characterized a novel induction mechanism of autophagy, which does not rely on the ubiquitination of the mycobacteria and implicates the activation of TLR signaling, and (ii) has shown that M. tuberculosis lipids DIM and SL and M abscessus glycopeptidolipid (GPL) are involved in the limitation of the autophagy process inside macrophages. Overall, this work provides novel regulation mechanisms of autophagy pathway during macrophage encounter with mycobacteria species, mechanisms that could be potential targets in the development of host-based therapy or vaccine against mycobacterial infections.

La mitophagie, la dégradation sélective des mitochondries par autophagie, est impliquée dans l’élimination des mitochondries endommagées ou superflues et requiert des régulateurs et protéines spécifiques. Chez la levure, Atg32, localisée dans la membrane externe mitochondriale, interagit avec Atg8, et permet le recrutement des mitochondries et leur séquestration à l’intérieur des autophagosomes. Atg8 est conjuguée à de la phosphatidyléthanolamine et est ainsi ancrée aux membranes du phagophore et des autophagosomes. Chez la levure, plusieurs voies de synthèse de PE existent mais leur contribution dans l’autophagie et la mitophagie est inconnue. Dans le premier chapitre, nous avons étudié la contribution des différentes enzymes de synthèse de PE, dans l’induction de l’autophagie et la mitophagie et nous avons démontré que Psd1, la phosphatidylsérine décarboxylase mitochondriale, est impliquée dans la mitophagie seulement en condition de carence azotée alors que Psd2, localisée dans les membranes vacuolaires, endosomales et de l’appareil de Golgi, est nécessaire en phase stationnaire de croissance. Dans le second chapitre, la relation entre Atg32, la mitophagie et le protéasome a été étudiée. Nous avons démontré que l’activité du promoteur d’ATG32 et la quantité de protéine Atg32 exprimée sont inversement régulées. En phase stationnaire de croissance, l’inhibition du protéasome empêche la diminution de l’expression d’Atg32 et la mitophagie est stimulée. Nos données montrent ainsi que la quantité d’Atg32 est reliée à l’activité du protéasome et que cette protéine pourrait être ubiquitinylée. Dans le troisième chapitre, nous nous sommes intéressés au rôle potentiel de Dep1, un composant du complexe nucléaire Rpd3 d’histones déacétylases, dans la mitophagie. Dans nos conditions, Dep1 semble être mitochondriale et elle est impliquée dans la régulation de la mitophagie. BRMS1L (Breast Cancer Metastasis suppressor 1-like) est l’homologue de Dep1 chez les mammifères. Cette protéine possède un rôle anti-métastatique dans des lignées de cancer du sein. Nous avons trouvé que l’expression de BRMS1L augmente en présence de stimuli pro-mitophagie. / Mitophagy, the selective degradation of mitochondria by autophagy, is implicated in the clearance of superfluous or damaged mitochondria and requires specific proteins and regulators. In yeast, Atg32, an outer mitochondrial membrane protein, interacts with Atg8, promoting mitochondria recruitment to the phagophore and their sequestration within autophagosomes. Atg8 is anchored to the phagophore and autophagosome membranes thanks to phosphatidylethanolamine (PE). In yeast, several PE synthesis pathways have been characterized, but their contribution to autophagy and mitophagy is unknown. In the first chapter, we investigated the contribution of the different enzymes responsible for PE synthesis in autophagy and mitophagy and we demonstrated that Psd1, the mitochondrial phosphatidylserine decarboxylase, is involved in mitophagy induction only in nitrogen starvation, whereas Psd2, located in vacuole/Golgi apparatus/endosome membranes, is required preferentially for mitophagy induction in stationary phase of growth. In the second chapter, we were interested in the relationship between Atg32, mitophagy and the proteasome. We demonstrated that ATG32 promoter activity and protein expression are inversely regulated. During stationary phase of growth, proteasome inhibition abolishes the decrease in Atg32 expression and mitophagy is enhanced. Our data indicate that Atg32 protein is regulated by the proteasome activity and could be ubiquitinated. In the third chapter, we investigated the involvement of Dep1, a member of the nuclear Rpd3L histone deacetylase complex, in mitophagy. In our conditions, Dep1 seems to be located in mitochondria and is a novel effector of mitophagy both in nitrogen starvation and stationary phase of growth. BRMS1L (Breast Cancer Metastasis suppressor 1-like) is the mammalian homolog of Dep1 and has been described in breast cancer metastasis suppression. We found that BRMS1L protein expression increases upon pro-mitophagy stimuli.