Traumatic spinal cord injury (SCI) is a physically debilitating, emotionally devastating, financially costly, and life-changing condition that afflicts more than 1,000,000 people in the United States alone. Owing to the characteristic neuropathology and low regenerative capacity of the central nervous system, many victims of SCI are left permanently paralyzed. Though the tissue damage caused by the initial insult almost certainly cannot be reversed, intensive research in recent years to elucidate the cellular and molecular events that follows has provided new grounds for optimism. Accordingly, in this dissertation, we present a number of potential treatment strategies aimed to address some of these pathological sequelae seen post-SCI so as to facilitate the regeneration of axons and the recovery of physiological functions. After the initial traumatic insult, a prominent and lasting injury-induced proliferative response occur and results in the development of a gliotic scar that isolates the lesion from the surrounding viable tissue. Although this process aids to prevent the spread of uncontrolled tissue damage, the scar nevertheless acts as a physical barrier to axonal regeneration. Furthermore, cells within the scar are a major source of axon growth-inhibitory molecules such as chondroitin sulfate proteoglycans (CSPG) and thus the scar acts concomitantly as a biochemical barrier. Concurrent to all this, inflammatory cells infiltrate the lesion and promote cell death through immunologic activation. Neuronal survival is also threatened from the lack of neurotrophic support caused by axonal severance. Finally, the pathology culminates in the formation of a fluid-filled cyst, which represents a gap that further hinders axonal regrowth. Since regeneration cannot physically occur in the presence of a cavity, we, by employing electrospinning techniques, generated a biocompatible matrix implant that can bridge and direct axonal elongation across the fluid-filled cyst. Given the complex array and scope of pathological sequelae post-SCI, it is generally recognized that a multifaceted approach is required to successfully treat SCI. In view of this, we presented novel approaches by which successful tried and true therapeutic strategies are combined to generate an enhanced matrix. An enzyme as well as a growth factor was incorporated into our matrix implants in order to respectively neutralize CSPGs and provide neurotrophic support. Using in vitro assays, we were able to demonstrate excellent protein bioactivity after incorporation. In vivo experimentation of these enhanced matrices is now ongoing. To address the injury-induced proliferative response, which represents an on-ramp off-ramp obstacle that prevents axonal regeneration onto our matrix implant, we showed how X-irradiation can be utilized to moderate this response by killing dividing cells so as to facilitate a more efficient penetration of regrowing axons into and beyond the gliotic scar. Finally, we demonstrate how a novel pharmacologic agent FTY720 can be used to attenuate the inflammatory response by preventing lymphocytic egress from lymphoid tissues. Collectively, these ideas and experimental results represent novel therapeutic strategies that can be combined in order to bring about meaningful functional recovery after SCI.

Os nervos periféricos são extensões do sistema nervoso central e responsáveis pela interação das atividades das extremidades, em suas funções sensitiva e motora. São vulneráveis aos mesmos tipos de traumas que afetam outros tecidos: contusão, compressão, esmagamento, estiramento, avulsão e laceração. Desta forma, a interrupção de continuidade da estrutura do nervo, por algum tipo de trauma, resulta na interrupção de transmissão dos impulsos nervosos e na desorganização de suas atividades funcionais. Para tanto, em vista da evolução tecnológica e o desenvolvimento de equipamentos mais sofisticados, a microcirurgia vem ganhando cada vez mais espaço no campo da investigação experimental referente a recuperação de nervos periféricos lesionados. Em uma secção simples, sem perda tecidual, a neurorrafia denominada término-terminal apresenta bons resultados, contudo, quando ocorre perda de tecido nervoso ou, não se têm mais os cotos distais do nervo, outras técnicas devem ser empregadas, até porque, não se pode de modo algum tencionar o nervo numa tentativa de coaptá-lo novamente. Várias técnicas de tubulização utilizando-se materiais biológicos e não biológicos, para criar um meio por onde ocorrerá a regeneração nervosa já foram ou ainda estão sendo testados com resultados insatisfatórios sob o aspecto funcional.É sabido que em um trauma sem perda tecidual, numa neuropraxia, por exemplo, o nervo recupera espontaneamente de forma satisfatória. É sabido também que em um feixe vásculo-nervoso, o nervo periférico encontra-se em íntimo contato com a adventícia de artérias e veias. A adventícia dos vasos é constituída por tecido conjuntivo frouxo, rico em adipócitos. Assim, em um trauma, os neuritos oriundos do coto proximal do nervo lesado, ficam diretamente em contato com esses adipócitos. Seguindo este raciocínio, e com base em trabalhos anteriores onde foi usada veia preenchida com músculo esquelético a fresco como enxerto, decidimos testar a possibilidade de crescimento axonal por meio de enxerto com tubo de polietileno preenchido por tecido adiposo autólogo. Para tanto será utilizado um tubo com 12 mm de comprimento por 0,25 mm de diâmetro, com poros de 80 µm de diâmetro, preenchido com tecido adiposo in natura retirado das adjacências do referido nervo, na tentativa de se recuperar o nervo isquiático. A certificação do sucesso da recuperação do nervo será feita por meio de técnicas de microcirurgia, microscopia e morfometria. O enxerto de polietileno mostrou ter resistência a pressões, uma vez que não foi observado colapso estrutural. A gordura mostrou ser bom material trófico já que no grupo onde a utilizou apresentou resultados mais próximos do controle final. / Peripheral nerves are extensions of the central nervous system and are responsible for the interaction of the activities of the extremities in their sensory and motor function. They are vulnerable to these types of injuries that affect other tissues: contusion, compression, crush, stretch, tear and avulsion. Thus, the interruption of continuity of the nerve structure, due to some sort of trauma, results in the interruption of transmission of nerve impulses and disruption of their functional activities. Therefore, in view of technological evolution and development of more sophisticated equipment, microsurgery is gaining more space in the field of experimental research concerning the recovery of injured peripheral nerves. In a single section, without loss of tissue, called the end-terminal neurorrhaphy was also good, however, when there is loss of nervous tissue or, if not longer have the distal nerve stumps, other techniques must be employed, because, in any circumstance the nerve should be tensioned as an attempt to coaptation again. Several techniques of tubing, using biological materials and non-biological means to create a place where nerve regeneration have been or are still being tested with unsatisfactory results in the functional aspect. It is known that in a trauma without loss of tissue, a neuropraxia, for example, the nerve recovers spontaneously and satisfactorily. It is also known that in a neurovascular bundle, the peripheral nerve is in close contact with the adventitia of arteries and veins. The adventitia of the vessels is composed of loose connective tissue rich in adipocytes. Thus, in trauma, the neurites from the proximal stump of injured nerve, are directly in contact with these adipocytes. Following this reasoning, and based on previous work where it was used vein filled with fresh skeletal muscle as a graft, decided to test the possibility of axonal growth by grafting polyethylene tube filled with autologous adipose tissue. For that will be used with a tube 12 mm long and 0.25 mm in diameter, with pores of 80 microns in diameter, filled with fresh adipose tissue removed from the vicinity of that nerve, in an attempt to recover the sciatic nerve. Certification of successful nerve recovery will be done through microsurgical techniques, microscopy and morphometry. The graft polyethylene proved to have pressure resistance, since no structural collapse was observed. The fat was found to be good material as trophic group which had used the results closer to the ultimate control.

Os nervos periféricos são extensões do sistema nervoso central e responsáveis pela interação das atividades das extremidades, em suas funções sensitiva e motora. São vulneráveis aos mesmos tipos de traumas que afetam outros tecidos: contusão, compressão, esmagamento, estiramento, avulsão e laceração. Desta forma, a interrupção de continuidade da estrutura do nervo, por algum tipo de trauma, resulta na interrupção de transmissão dos impulsos nervosos e na desorganização de suas atividades funcionais. Para tanto, em vista da evolução tecnológica e o desenvolvimento de equipamentos mais sofisticados, a microcirurgia vem ganhando cada vez mais espaço no campo da investigação experimental referente a recuperação de nervos periféricos lesionados. Em uma secção simples, sem perda tecidual, a neurorrafia denominada término-terminal apresenta bons resultados, contudo, quando ocorre perda de tecido nervoso ou, não se têm mais os cotos distais do nervo, outras técnicas devem ser empregadas, até porque, não se pode de modo algum tencionar o nervo numa tentativa de coaptá-lo novamente. Várias técnicas de tubulização utilizando-se materiais biológicos e não biológicos, para criar um meio por onde ocorrerá a regeneração nervosa já foram ou ainda estão sendo testados com resultados insatisfatórios sob o aspecto funcional.É sabido que em um trauma sem perda tecidual, numa neuropraxia, por exemplo, o nervo recupera espontaneamente de forma satisfatória. É sabido também que em um feixe vásculo-nervoso, o nervo periférico encontra-se em íntimo contato com a adventícia de artérias e veias. A adventícia dos vasos é constituída por tecido conjuntivo frouxo, rico em adipócitos. Assim, em um trauma, os neuritos oriundos do coto proximal do nervo lesado, ficam diretamente em contato com esses adipócitos. Seguindo este raciocínio, e com base em trabalhos anteriores onde foi usada veia preenchida com músculo esquelético a fresco como enxerto, decidimos testar a possibilidade de crescimento axonal por meio de enxerto com tubo de polietileno preenchido por tecido adiposo autólogo. Para tanto será utilizado um tubo com 12 mm de comprimento por 0,25 mm de diâmetro, com poros de 80 µm de diâmetro, preenchido com tecido adiposo in natura retirado das adjacências do referido nervo, na tentativa de se recuperar o nervo isquiático. A certificação do sucesso da recuperação do nervo será feita por meio de técnicas de microcirurgia, microscopia e morfometria. O enxerto de polietileno mostrou ter resistência a pressões, uma vez que não foi observado colapso estrutural. A gordura mostrou ser bom material trófico já que no grupo onde a utilizou apresentou resultados mais próximos do controle final. / Peripheral nerves are extensions of the central nervous system and are responsible for the interaction of the activities of the extremities in their sensory and motor function. They are vulnerable to these types of injuries that affect other tissues: contusion, compression, crush, stretch, tear and avulsion. Thus, the interruption of continuity of the nerve structure, due to some sort of trauma, results in the interruption of transmission of nerve impulses and disruption of their functional activities. Therefore, in view of technological evolution and development of more sophisticated equipment, microsurgery is gaining more space in the field of experimental research concerning the recovery of injured peripheral nerves. In a single section, without loss of tissue, called the end-terminal neurorrhaphy was also good, however, when there is loss of nervous tissue or, if not longer have the distal nerve stumps, other techniques must be employed, because, in any circumstance the nerve should be tensioned as an attempt to coaptation again. Several techniques of tubing, using biological materials and non-biological means to create a place where nerve regeneration have been or are still being tested with unsatisfactory results in the functional aspect. It is known that in a trauma without loss of tissue, a neuropraxia, for example, the nerve recovers spontaneously and satisfactorily. It is also known that in a neurovascular bundle, the peripheral nerve is in close contact with the adventitia of arteries and veins. The adventitia of the vessels is composed of loose connective tissue rich in adipocytes. Thus, in trauma, the neurites from the proximal stump of injured nerve, are directly in contact with these adipocytes. Following this reasoning, and based on previous work where it was used vein filled with fresh skeletal muscle as a graft, decided to test the possibility of axonal growth by grafting polyethylene tube filled with autologous adipose tissue. For that will be used with a tube 12 mm long and 0.25 mm in diameter, with pores of 80 microns in diameter, filled with fresh adipose tissue removed from the vicinity of that nerve, in an attempt to recover the sciatic nerve. Certification of successful nerve recovery will be done through microsurgical techniques, microscopy and morphometry. The graft polyethylene proved to have pressure resistance, since no structural collapse was observed. The fat was found to be good material as trophic group which had used the results closer to the ultimate control.

The goal of nerve tissue engineering is to promote and guide axon growth across a site of nerve injury without misdirection. Bioengineered tissue scaffolds have been shown to be promising for the regeneration of damaged peripheral nerves. Schwann cells play a pivotal role following nerve injury by forming aligned “bands of Büngner” that promote and guide axon regeneration into the distal nerve segment. The incorporation of living Schwann cells into various hydrogels has therefore been urged during the fabrication of tissue engineered nerve scaffolds. The aim of this research is to characterize biomaterials suitable for 3D bioplotting of nerve repair scaffolds. Here a novel technique of scaffold fabrication has been optimized to print alginate-based three-dimensional tissue scaffolds containing hyaluronic acid and living Schwann cells. Alginate/hyaluronic acid scaffolds were successfully fabricated with good printability and cell viability. Addition of the polycation polyethyleneimine (PEI) during the fabrication process stabilized the structure of alginate through the formation of a polyelectrolyte complex and had a significant influence on the degree of swelling, degradation rate, mechanical property, and release kinetics of incorporated protein within the scaffolds. A preliminary in vivo study showed the feasibility of implanting 3D printed alginate/hyaluronic acid scaffolds as nerve conduits in Sprague-Dawley (SD) rats with resected sciatic nerves. However alginate/hyaluronic acid scaffolds were found to be unsuitable for axonal regeneration. Further in vitro culture of Schwann cells was performed in collagen type-I, fibrin, fibrin/hyaluronic acid, and their combination with alginate. It was found that Schwann cells had more favorable cell morphology in fibrin/hyaluronic acid or collagen without alginate. Schwann cell proliferation and alignment were better in fibrin/hyaluronic acid. Therefore fibrin/hyaluronic acid is more ideal than most other hydrogel formulations for use in the bioprinting of nerve repair tissue engineering scaffolds, which incorporate cellular elements. As Schwann cells also align along the long axis of the printed fibrin/hyaluronic acid strands, 3D bioprinting of multiple layers of crosslinked fibrin strands can be used to fabricate a nerve conduit mimicking the bands of Büngner.

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Acquiring knowledge of the morphological, molecular, and functional changes that occur to neurons following axotomy is a key step for a comprehensive understanding of the nervous system and how it reacts to injury. Propriospinal commissural interneurons (PCIs or CINs) are a class of neuron with axons that project through the ventral commissure to the contralateral spinal cord. My goal was to examine the morphological, molecular, and functional changes that occur to adult feline PCIs following a proximal axotomy. We first determined whether proximally axotomized PCIs develop de novo axons from their dendrites. C3 PCIs were proximally axotomized and several weeks later we stained PCIs and prepared the tissue for histological evaluation. Two primary classes of axotomized PCI were identified: those with a very short axon (called permanently axotomized) and those with an axon that projected across the injury site. Permanently axotomized PCIs had processes with morphological features typical of axons that emerged from their distal dendrites. These axonal processes of the distal dendrites also had GAP-43 (an axonal marker) and lacked MAP2a/b (a dendritic marker). We concluded that permanently axotomized PCIs develop de novo axons from distal dendrites. We then determined whether the axons that crossed the lesion site were representative of spontaneous functional regeneration. First, we showed that PCI axons regenerate through an environment that is typically highly inhibitory to regenerating axons. Second, we established that the regenerated axons conduct action potentials. Finally, we found that regenerated PCI axons form functional synaptic connections with neurons in the contralateral spinal cord. Collectively, these data indicated that spinal interneurons are capable of spontaneous functional regeneration through an injured spinal cord. PCI growth cones are complex and unlike growth cones previously described in the literature. The final study of the thesis examines the morphologies of PCI growth cones within spinal cord injury sites. We found that PCI growth cones have a wide range of morphologies that is independent of their location within the lesion site. Taken together, these data indicate that PCIs have a remarkable capacity for axonal elongation and contribute to remodelling of spinal circuitry following spinal injury. / Thesis (Ph.D, Physiology) -- Queen's University, 2009-12-07 11:21:47.036

La régénération après une lésion de la moelle épinière (ME) est abortive. Elle est du à une cascade d'événements cellulaires et moléculaires, dont la rupture de la barrière hémato-encéphalique, une inflammation persistante, une cicatrice gliale et la formation d'une cavité, combinée à la présence de molécules inhibitrices pour la repousse. Actuellement, aucune thérapie n'est efficace, mais le design de biomatériaux implantables pourrait permettre leur développement. L'hydrogel de chitosane (hCh) apparait prometteur, notamment grâce à la modulation de ses propriétés biologiques, notamment en modifiant son degré de déacétylation (DA). J'ai donc testé, dans une hémisection dorsale de la ME de rat, différentes formulations d'hCh fragmenté et examiné leur capacité à s'intégrer dans le tissu hôte lésé, sans produire une inflammation ou une réaction astrocytaire excessive. Mon travail montre que l'implantation de fragments d'hCh avec un DA de 4% est favorable à la reconstruction du tissu, en attirant différents types cellulaires et en recréant une vascularisation fonctionnelle. Il permet aussi de moduler la réponse inflammatoire, en favorisant une polarisation des macrophages en un phénotype M2. La cicatrice gliale est aussi réduite et les processus astroytaires s'orientent vers l'implant, en s'associant aux axones qui régénèrent et caractérisés par traçage axonale et immunohistochimie. Plusieurs sont myélinisés ou entourés par des cellules de Schwann, au moins jusqu'à 10 semaines après la lésion. Enfin, le remodelage structural est associé à une récupération locomotrice significative. / Regeneration after traumatic spinal cord injury generally fails due to a cascade of cellular and molecular events, including blood-spinal cord barrier breakdown,persistent and uncontrolled inflammation, and glial scarring and cavity formation combined with the presence of axon growth-inhibitory molecules. While efficient therapies are still lacking, recent progress in the design of implantable biomaterials may well open up new possibilites for their development. Chitosan hydrogels (hCh) seem particularly promising as their biological properties can be fine-tuned, notably by their degree of acetylation (DA). In the context of a rat dorsal spinal cord hemisection, I have tested different formulations of fragmented hCh for their ability to integrate into lesioned host tissue without creating additional inflammation, or excessive astrocytic reaction. Thus, I found that implantation of hCh particles of 4% DA allows for tissue reconstruction by attracting different cell types and recreating a functional vasculature. Importantly, it modulates the inflammatory response, favoring polarization of invading macrophages towards the M2 phenotype. In lesioned-implanted animals, the glial scar is less fibrous, astrocyte processes are mainly oriented towards the lesion and accompany a robust regrowth of fibers, whose origin was identified by axon tracing and immunohistochemistry. Many of these fibers are myelinated or ensheathed by Schwann cells, maintained at long term in the implant. Finally, this structural remodeling is associated with significant, long-lasting recovery of locomotor function, as I have shown by open-field and gait analysis.

Lesões medulares resultam em uma perda irreversível da função abaixo do sítio da lesão. Esses comprometimentos são permanentes e ocorrem devido à perda de neurônios localmente e também dos tratos axonais ascendentes e descendentes da medula espinal. Na tentativa de criar um ambiente favorável à regeneração dos axônios lesionados, células da glia embainhante olfatória (GEO) vêm sendo transplantadas como estratégia de tratamento em animais submetidos a diferentes modelos experimentais de lesões medulares. Entretanto, um consenso sobre o potencial terapêutico desse tipo de transplante celular ainda precisa ser estabelecido. O objetivo do presente trabalho foi verificar a eficácia do transplante de lâmina própria (LP) olfatória (que possui células da GEO) e de LP respiratória (desprovido de células da GEO), quando implantadas imediatamente, 2 ou 4 semanas após a realização da transecção da medula espinal. Doze semanas após a realização dos implantes, os animais que receberam LP olfatória e respiratória apresentaram uma melhora sutil na função motora dos membros posteriores. Além disso, o transplante de LP olfatória quando realizado imediatamente após a lesão reduziu a hiperatividade do reflexo de retirada, enquanto o implante desse tipo de tecido 4 semanas pós-lesão produziu uma discreta depressão dependente de frequência do reflexo de Hoffman (um análogo elétrico do reflexo monossináptico de estiramento). Nas diferentes janelas terapêuticas utilizadas, o transplante de ambos os tipos de LP produziu resultados comparáveis em relação à preservação do tecido medular, brotamento de neuritos e regeneração de fibras mielínicas no local da lesão, indicando que o tempo decorrido antes da realização dos transplantes não parece limitar os efeitos regenerativos. Todavia, as fibras mielínicas observadas no sítio da transecção nos animais que receberam LP olfatória 2 e 4 semanas pós-lesão possuíam menor área, diâmetro e espessura da bainha de mielina quando comparados aos animais que receberam LP respiratória nesses mesmos períodos. O transplante imediato de LP olfatória e respiratória também favoreceu o restabelecimento das conexões entre as fibras axonais lesionadas com núcleos do tronco encefálico e até mesmo com a região do córtex somatossensorial, como indicado pela presença de neurônios nessas regiões marcados positivamente com um marcador axonal retrógrado. Um número maior de fibras positivas para 5-HT foi observado no coto proximal dos grupos transplantados com ambos os tipos de LP em comparação às regiões da lesão e do coto caudal. Fibras positivas para CGRP estavam presentes em número considerável no local da lesão. A recuperação locomotora e a regeneração axonal no local da lesão foram limitadas e comparáveis entre os grupos transplantados nos diferentes tempos com LP olfatória e respiratória, sugerindo que esses resultados não estão exclusivamente relacionados à presença de células da GEO nos enxertos utilizados. Um melhor entendimento sobre o potencial restaurativo desse tipo de transplante é necessário a fim de justificar a aplicação dessa terapia em humanos. / Spinal cord injury (SCI) results in an irreversible loss of function below the injury site. These permanent disabilities occur due to local neuronal death and loss of ascending and descending axons in the spinal cord. In attempt to create a favorable environment for the re-growth of injured axons, olfactory ensheathing cells (OECs) have been transplanted as a treatment strategy in animals submitted to different experimental models of SCI. However, a consensus on the efficacy of this cellular transplantation has yet to be reached. The main focus of the present study was explore the efficacy of olfactory lamina propria (OLP, graft containing OECs) or respiratory lamina propria (RLP, graft without OECs) when transplanted immediately, 2-week or 4-week after spinal cord transection. After 12 weeks of transplantation, animals with OLP and RLP grafts showed a subtle hindlimb motor improvement. Furthermore, the transplantation of OLP when performed immediately after injury reduced the withdrawal reflex over-responsiveness, while the implantation of this tissue 4 weeks post-injury produced a discrete frequency-dependent habituation of the Hoffman reflex (the electrical analogue of the classic tendon jerk reflex). In all therapeutic windows used, both lamina propria grafts produced comparable results for tissue sparing, fibers sprouting and re-growth of myelinated fibers at the lesion site, indicating that delayed transplantation approach does not seem to limit the regenerative effects. However, the myelinated fibers observed at the transection site of animals that received OLP 2 or 4 weeks after injury had a smaller myelinated fiber area, diameter and myelin sheath thickness when compared to those animals transplanted with RLP grafts in the same periods. The immediate transplantation of OLP and RLP also foster limited supraspinal axonal re-connection as shown by the presence of neurons stained by retrograde tracing in brainstem nuclei and in the somatosensory cortex. A larger number of 5-HT positive axons were found in the cranial stump of both lamina propria groups compared to the lesion and caudal regions. CGRP positive axons were present in considerable numbers at the SCI site. The locomotor recovery and axon reparative effects were limited and similar between groups transplanted at different times with OLP and RLP, suggesting that these results could not be exclusively related to OECs. In conclusion, a greater understanding of the restorative potential of these tissue grafts is necessary to strengthen the rationale for application of this treatment in humans.

Lesões medulares resultam em uma perda irreversível da função abaixo do sítio da lesão. Esses comprometimentos são permanentes e ocorrem devido à perda de neurônios localmente e também dos tratos axonais ascendentes e descendentes da medula espinal. Na tentativa de criar um ambiente favorável à regeneração dos axônios lesionados, células da glia embainhante olfatória (GEO) vêm sendo transplantadas como estratégia de tratamento em animais submetidos a diferentes modelos experimentais de lesões medulares. Entretanto, um consenso sobre o potencial terapêutico desse tipo de transplante celular ainda precisa ser estabelecido. O objetivo do presente trabalho foi verificar a eficácia do transplante de lâmina própria (LP) olfatória (que possui células da GEO) e de LP respiratória (desprovido de células da GEO), quando implantadas imediatamente, 2 ou 4 semanas após a realização da transecção da medula espinal. Doze semanas após a realização dos implantes, os animais que receberam LP olfatória e respiratória apresentaram uma melhora sutil na função motora dos membros posteriores. Além disso, o transplante de LP olfatória quando realizado imediatamente após a lesão reduziu a hiperatividade do reflexo de retirada, enquanto o implante desse tipo de tecido 4 semanas pós-lesão produziu uma discreta depressão dependente de frequência do reflexo de Hoffman (um análogo elétrico do reflexo monossináptico de estiramento). Nas diferentes janelas terapêuticas utilizadas, o transplante de ambos os tipos de LP produziu resultados comparáveis em relação à preservação do tecido medular, brotamento de neuritos e regeneração de fibras mielínicas no local da lesão, indicando que o tempo decorrido antes da realização dos transplantes não parece limitar os efeitos regenerativos. Todavia, as fibras mielínicas observadas no sítio da transecção nos animais que receberam LP olfatória 2 e 4 semanas pós-lesão possuíam menor área, diâmetro e espessura da bainha de mielina quando comparados aos animais que receberam LP respiratória nesses mesmos períodos. O transplante imediato de LP olfatória e respiratória também favoreceu o restabelecimento das conexões entre as fibras axonais lesionadas com núcleos do tronco encefálico e até mesmo com a região do córtex somatossensorial, como indicado pela presença de neurônios nessas regiões marcados positivamente com um marcador axonal retrógrado. Um número maior de fibras positivas para 5-HT foi observado no coto proximal dos grupos transplantados com ambos os tipos de LP em comparação às regiões da lesão e do coto caudal. Fibras positivas para CGRP estavam presentes em número considerável no local da lesão. A recuperação locomotora e a regeneração axonal no local da lesão foram limitadas e comparáveis entre os grupos transplantados nos diferentes tempos com LP olfatória e respiratória, sugerindo que esses resultados não estão exclusivamente relacionados à presença de células da GEO nos enxertos utilizados. Um melhor entendimento sobre o potencial restaurativo desse tipo de transplante é necessário a fim de justificar a aplicação dessa terapia em humanos. / Spinal cord injury (SCI) results in an irreversible loss of function below the injury site. These permanent disabilities occur due to local neuronal death and loss of ascending and descending axons in the spinal cord. In attempt to create a favorable environment for the re-growth of injured axons, olfactory ensheathing cells (OECs) have been transplanted as a treatment strategy in animals submitted to different experimental models of SCI. However, a consensus on the efficacy of this cellular transplantation has yet to be reached. The main focus of the present study was explore the efficacy of olfactory lamina propria (OLP, graft containing OECs) or respiratory lamina propria (RLP, graft without OECs) when transplanted immediately, 2-week or 4-week after spinal cord transection. After 12 weeks of transplantation, animals with OLP and RLP grafts showed a subtle hindlimb motor improvement. Furthermore, the transplantation of OLP when performed immediately after injury reduced the withdrawal reflex over-responsiveness, while the implantation of this tissue 4 weeks post-injury produced a discrete frequency-dependent habituation of the Hoffman reflex (the electrical analogue of the classic tendon jerk reflex). In all therapeutic windows used, both lamina propria grafts produced comparable results for tissue sparing, fibers sprouting and re-growth of myelinated fibers at the lesion site, indicating that delayed transplantation approach does not seem to limit the regenerative effects. However, the myelinated fibers observed at the transection site of animals that received OLP 2 or 4 weeks after injury had a smaller myelinated fiber area, diameter and myelin sheath thickness when compared to those animals transplanted with RLP grafts in the same periods. The immediate transplantation of OLP and RLP also foster limited supraspinal axonal re-connection as shown by the presence of neurons stained by retrograde tracing in brainstem nuclei and in the somatosensory cortex. A larger number of 5-HT positive axons were found in the cranial stump of both lamina propria groups compared to the lesion and caudal regions. CGRP positive axons were present in considerable numbers at the SCI site. The locomotor recovery and axon reparative effects were limited and similar between groups transplanted at different times with OLP and RLP, suggesting that these results could not be exclusively related to OECs. In conclusion, a greater understanding of the restorative potential of these tissue grafts is necessary to strengthen the rationale for application of this treatment in humans.

Lesões medulares resultam em uma perda irreversível da função abaixo do sítio da lesão. Esses comprometimentos são permanentes e ocorrem devido à perda de neurônios localmente e também dos tratos axonais ascendentes e descendentes da medula espinal. Na tentativa de criar um ambiente favorável à regeneração dos axônios lesionados, células da glia embainhante olfatória (GEO) vêm sendo transplantadas como estratégia de tratamento em animais submetidos a diferentes modelos experimentais de lesões medulares. Entretanto, um consenso sobre o potencial terapêutico desse tipo de transplante celular ainda precisa ser estabelecido. O objetivo do presente trabalho foi verificar a eficácia do transplante de lâmina própria (LP) olfatória (que possui células da GEO) e de LP respiratória (desprovido de células da GEO), quando implantadas imediatamente, 2 ou 4 semanas após a realização da transecção da medula espinal. Doze semanas após a realização dos implantes, os animais que receberam LP olfatória e respiratória apresentaram uma melhora sutil na função motora dos membros posteriores. Além disso, o transplante de LP olfatória quando realizado imediatamente após a lesão reduziu a hiperatividade do reflexo de retirada, enquanto o implante desse tipo de tecido 4 semanas pós-lesão produziu uma discreta depressão dependente de frequência do reflexo de Hoffman (um análogo elétrico do reflexo monossináptico de estiramento). Nas diferentes janelas terapêuticas utilizadas, o transplante de ambos os tipos de LP produziu resultados comparáveis em relação à preservação do tecido medular, brotamento de neuritos e regeneração de fibras mielínicas no local da lesão, indicando que o tempo decorrido antes da realização dos transplantes não parece limitar os efeitos regenerativos. Todavia, as fibras mielínicas observadas no sítio da transecção nos animais que receberam LP olfatória 2 e 4 semanas pós-lesão possuíam menor área, diâmetro e espessura da bainha de mielina quando comparados aos animais que receberam LP respiratória nesses mesmos períodos. O transplante imediato de LP olfatória e respiratória também favoreceu o restabelecimento das conexões entre as fibras axonais lesionadas com núcleos do tronco encefálico e até mesmo com a região do córtex somatossensorial, como indicado pela presença de neurônios nessas regiões marcados positivamente com um marcador axonal retrógrado. Um número maior de fibras positivas para 5-HT foi observado no coto proximal dos grupos transplantados com ambos os tipos de LP em comparação às regiões da lesão e do coto caudal. Fibras positivas para CGRP estavam presentes em número considerável no local da lesão. A recuperação locomotora e a regeneração axonal no local da lesão foram limitadas e comparáveis entre os grupos transplantados nos diferentes tempos com LP olfatória e respiratória, sugerindo que esses resultados não estão exclusivamente relacionados à presença de células da GEO nos enxertos utilizados. Um melhor entendimento sobre o potencial restaurativo desse tipo de transplante é necessário a fim de justificar a aplicação dessa terapia em humanos. / Spinal cord injury (SCI) results in an irreversible loss of function below the injury site. These permanent disabilities occur due to local neuronal death and loss of ascending and descending axons in the spinal cord. In attempt to create a favorable environment for the re-growth of injured axons, olfactory ensheathing cells (OECs) have been transplanted as a treatment strategy in animals submitted to different experimental models of SCI. However, a consensus on the efficacy of this cellular transplantation has yet to be reached. The main focus of the present study was explore the efficacy of olfactory lamina propria (OLP, graft containing OECs) or respiratory lamina propria (RLP, graft without OECs) when transplanted immediately, 2-week or 4-week after spinal cord transection. After 12 weeks of transplantation, animals with OLP and RLP grafts showed a subtle hindlimb motor improvement. Furthermore, the transplantation of OLP when performed immediately after injury reduced the withdrawal reflex over-responsiveness, while the implantation of this tissue 4 weeks post-injury produced a discrete frequency-dependent habituation of the Hoffman reflex (the electrical analogue of the classic tendon jerk reflex). In all therapeutic windows used, both lamina propria grafts produced comparable results for tissue sparing, fibers sprouting and re-growth of myelinated fibers at the lesion site, indicating that delayed transplantation approach does not seem to limit the regenerative effects. However, the myelinated fibers observed at the transection site of animals that received OLP 2 or 4 weeks after injury had a smaller myelinated fiber area, diameter and myelin sheath thickness when compared to those animals transplanted with RLP grafts in the same periods. The immediate transplantation of OLP and RLP also foster limited supraspinal axonal re-connection as shown by the presence of neurons stained by retrograde tracing in brainstem nuclei and in the somatosensory cortex. A larger number of 5-HT positive axons were found in the cranial stump of both lamina propria groups compared to the lesion and caudal regions. CGRP positive axons were present in considerable numbers at the SCI site. The locomotor recovery and axon reparative effects were limited and similar between groups transplanted at different times with OLP and RLP, suggesting that these results could not be exclusively related to OECs. In conclusion, a greater understanding of the restorative potential of these tissue grafts is necessary to strengthen the rationale for application of this treatment in humans.