Heung May-sze. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2001. / Includes bibliographical references. / Abstracts in English and Chinese. / Title Page --- p.i / Acknowledgement --- p.ii / Table of Contents --- p.iii / List of Abbreviations --- p.vi / List of Figures --- p.viii / List of Tables --- p.xii / Abstract --- p.xiv / Chapter Chapter 1 --- Introduction / Chapter 1.1 --- Epstein-Barr Virus --- p.1-1 / Chapter 1.1.1 --- Virus structure --- p.1-1 / Chapter 1.1.2 --- Genome structure --- p.1-1 / Chapter 1.1.3 --- Nomenclature for EBV open reading frames --- p.1-2 / Chapter 1.1.4 --- Biology of EBV --- p.1-2 / Chapter 1.1.5 --- EBV latency --- p.1-7 / Chapter 1.1.6 --- EBV latent gene promoters --- p.1-8 / Chapter 1.2 --- EBV Infection and Its Persisence --- p.1-9 / Chapter 1.3 --- DNA Methylation --- p.1-17 / Chapter 1.3.1 --- Aberrant CpG island methylation in cancer --- p.1-18 / Chapter 1.3.2 --- DNA methylation and EBV --- p.1-19 / Chapter 1.4 --- Demethylating Agents --- p.1-21 / Chapter 1.5 --- Aims of the Study --- p.1-23 / Chapter Chapter 2 --- EBV Latency Patterns / Chapter 2.1 --- Introduction --- p.2-1 / Chapter 2.2 --- Materials and Methods --- p.2-1 / Chapter 2.2.1 --- Cell line culture --- p.2-1 / Chapter 2.2.2 --- NPC biopsies culture --- p.2-2 / Chapter 2.2.3 --- RNA extraction --- p.2-3 / Chapter 2.2.4 --- RNA quantification --- p.2-4 / Chapter 2.2.5 --- Deoxyribonuclease I treatment for NPC biopsies --- p.2-5 / Chapter 2.2.6 --- Reverse transcriptase-polymerase chain reaction --- p.2-5 / Chapter 2.2.7 --- Gel Electrophoresis --- p.2-10 / Chapter 2.3 --- Results --- p.2-11 / Chapter 2.3.1 --- Burkitt' s lymphoma and lymphoblastoid cell lines --- p.2-11 / Chapter 2.3.2 --- Nasopharyngeal carcinoma biopsies --- p.2-11 / Chapter 2.4 --- Discussion --- p.2-19 / Chapter Chapter 3 --- Treatment with Demethylating Agents on Rael / Chapter 3.1 --- Introduction --- p.3-1 / Chapter 3.2 --- Materials and Methods --- p.3-2 / Chapter 3.2.1 --- Rael cell line culture --- p.3-2 / Chapter 3.2.2 --- Drug treatment --- p.3-2 / Chapter 3.2.3 --- Viability staining --- p.3-2 / Chapter 3.2.4 --- Statistical analysis --- p.3-3 / Chapter 3.2.5 --- RNA extraction and quantification --- p.3-3 / Chapter 3.2.6 --- RT-PCR and gel electrophoresis --- p.3-3 / Chapter 3.2.7 --- DIG oligonucleotide 3'-end labeling --- p.3-3 / Chapter 3.2.8 --- Southern blot --- p.3-10 / Chapter 3.3 --- Results --- p.3-13 / Chapter 3.3.1 --- 5-azacytidine --- p.3-13 / Chapter 3.3.2 --- 5-aza-2-deoxycytidine --- p.3-26 / Chapter 3.4 --- Discussion --- p.3-39 / Chapter Chapter 4 --- Treatment with Demethylating Agents on NPC Biopsies / Chapter 4.1 --- Introduction --- p.4-1 / Chapter 4.2 --- Materials and Methods --- p.4-2 / Chapter 4.2.1 --- NPC biopsy culture --- p.4-2 / Chapter 4.2.2 --- Drug treatment --- p.4-2 / Chapter 4.2.3 --- RNA extraction and quantification --- p.4-2 / Chapter 4.2.4 --- DNase I treatment for NPC biopsies --- p.4-2 / Chapter 4.2.5 --- RT-PCR and gel electrophoresis --- p.4-2 / Chapter 4.3 --- Results --- p.4-3 / Chapter 4.4 --- Discussion --- p.4-3 / Chapter Chapter 5 --- Conclusion --- p.5-1 / Reference --- p.R-1 / Appendix --- p.A-l

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2007. / Härtill 4 uppsatser.

Im Rahmen der RELAZA-Studie sollte die Wirksamkeit sowie die Sicherheit von AZA in der Verzögerung bzw. Vermeidung eines hämatologischen Rezidivs bei Patienten mit CD34+ MDS oder AML bei fallendem CD34-Spenderchimärismus nach allogener SZT untersucht werden. Als primäre Zielparameter galten hierbei die Ansprechrate im Sinne eines CD34-Spenderchimärismusanstiegs auf ≥ 80% (majores Ansprechen) etwa einen Monat nach Ende des 4. Zyklus AZA sowie die Dauer dieses Ansprechens. Ferner sollte der weitere Krankheitsverlauf, das Gesamt- und auch rezidivfreie Überleben sowie die Verträglichkeit und die Beeinflussung der GvHD untersucht werden. Dazu wurde der Anteil CD34+ Spenderzellen im peripheren Blut von insgesamt 53 Patienten im Abstand von drei bis vier Wochen und ab dem 9.-24. Monat nach allogener SZT alle sieben bis acht Wochen bestimmt. Die 20 Patienten, die während dieser Screeningphase einen CD34-Spenderzellabfall auf < 80% zeigten, aber gleichzeitig kein hämatologisches Rezidiv und transfusionsunabhängig > 3 Gpt/l Leukozyten sowie > 75 Gpt/l Thrombozyten aufwiesen, wurden in die Therapiegruppe aufgenommen. AZA wurde pro Zyklus unter entsprechender antiemetischer Prophylaxe in einer Dosis von 75 mg/m2/Tag über sieben aufeinanderfolgende Tage subkutan verabreicht. Der Abstand zwischen dem jeweiligen Beginn zweier Zyklen betrug circa 28 Tage. Es wurden zunächst nur vier Zyklen AZA in Folge appliziert. Einen Monat nach Ende des 4. Zyklus erfolgte die Bewertung des Ansprechens durch Zuordnung der einzelnen Patienten zu den Gruppen „majores Ansprechen“ (CD34-Spenderzellchimärismus ≥ 80%), „minores Ansprechen“ (CD34-Spenderzellchimärismus < 80%, aber kein Rezidiv) und „Rezidiv“. Um bei Patienten, die bis dahin nur ein minores Ansprechen erreicht hatten oder deren CD34-Spenderzellchimärismus wieder auf < 80% abgefallen war, ein (erneutes) majores Ansprechen zu induzieren, konnten im Anschluss an Block 1 (Zyklus 1-4) im Rahmen von Block 2 und 3 jeweils weitere vier Zyklen AZA gegeben werden. Vor jedem neuen Zyklus erfolgte die Kontrolle wesentlicher Laborparameter (großes Blutbild, ALAT, ASAT, GGT, Creatinin, Harnstoff, Natrium, Kalium, Bilirubin, CRP) sowie die Bewertung der GvHD. Nach dem 2. und 4. Zyklus jedes Blocks fanden eine erneute Knochenmarkpunktion sowie die Analyse des CD34-Spenderchimärismus statt. Der CD34-Spenderchimärismus der 20 Patienten der Therapiegruppe war im Median 169 Tage nach der letzten SZT auf < 80% abgefallen, sodass die Therapie mit AZA bei diesen Patienten begonnen wurde. Nach nur vier Zyklen AZA konnte bei 16 von 20 (80%) Patienten eine Stabilisierung oder Verminderung der MRD festgestellt werden. Insgesamt zeigten zehn der 20 (50%) Patienten ein majores Ansprechen. Dieses war zum Studienabschluss im Januar 2011 allerdings nur noch bei drei Patienten (medianes follow up von 300 Tagen (Spannweite 181–899 Tage) nach Ende des 1. Blocks) nachweisbar. Sechs (30%) Patienten zeigten nach dem 4. Zyklus ein minores Ansprechen und vier (20%) waren bereits im Rezidiv. Von den 16 Patienten, die entweder ein majores oder minores Ansprechen zeigten, begannen 11 Patienten mit dem zweiten und vier auch noch mit dem dritten Block. Durch diese Wiederbehandlung mit AZA konnte allerdings nur bei einer Patientin ein (erneutes) majores Ansprechen erreicht werden, welches jedoch nur etwa einen Monat anhielt. Zusammenfassend betrachtet haben bis zum Studienabschluss 13 von 20 (65%) Therapiepatienten rezidiviert. Das rezidivfreie Überleben dieser Patienten betrug im Median 231 Tage (Spannweite 56–558 Tage), das Gesamtüberleben lag bei im Median 470 Tagen (Spannweite 182-1440 Tage) nach dem initialen Abfall des CD34-Subsetchimärismus < 80%. Neun von ihnen sind im Median 293 Tage (Spannweite 182 – 1159 Tage) nach CD34-Spenderchimärismusabfall verstorben. Vier der 20 Patienten haben bis zum Abschluss der Studie, das heißt im Median 347 Tage (Spannweite 297 – 998 Tage) nach dem ersten Abfall des CD34-Subsetchimärismus < 80%, rezidivfrei überlebt. Drei von ihnen zeigten zum Studienabschluss ein bis dahin im Median seit 300 Tagen (Spannweite 181 – 899 Tage) nach Therapieende bestehendes stabiles majores Ansprechen. Die restlichen drei der 20 Therapiepatienten sind nicht Rezidiv-assoziiert verstorben. Das Gesamtüberleben aller Therapiepatienten lag bei im Median 347 Tagen (Spannweite 162–1440 Tage) nach Abfall der CD34+ Zellen unter die 80% Grenze. Die Hauptnebenwirkung von AZA bestand in der Induktion schwerer Zytopenien, die bei sechs von 20 Patienten zu Infektionen führten. Diese konnten jedoch entweder ambulant oder stationär gut beherrscht werden, sodass sie weder zum Abbruch der Studie noch zum Tod eines Patienten führten. Ansonsten konnte durch Dosisanpassungen, Zyklusverschiebungen sowie durch die Gabe von Wachstumsfaktoren (G-CSF) eine Regeneration des Blutbilds erreicht werden. Gravierende Verschlechterungen bestehender GvHD wurden nicht beobachtet. Hingegen konnte die immunsuppressive Medikation unter den ersten vier Zyklen AZA bei vier von sechs Patienten beendet werden. Die RELAZA-Studie hat gezeigt, dass AZA unter akzeptablen Nebenwirkungen in der Lage ist, das Auftreten eines hämatologischen Rezidivs bei Abfall des CD34-Spenderzellchimärimus nach allogener SZT zumindest zu verzögern. Allerdings mussten wir feststellen, dass nur die Hälfte der Patienten ein majores Ansprechen zeigte und dieses bei den meisten Patienten nur von kurzer Dauer war. Deshalb gehen wir davon aus, dass sowohl zur Induktion eines majoren Ansprechens als auch zum Erhalt desselben vier Zyklen AZA in Folge nicht ausreichend sind. Der Effekt eines dahingehend veränderten Applikationsschemas wird bereits im Rahmen der RELAZA-II-Studie untersucht.

Thesis (M.S.)--University of Florida, 2005. / Typescript. Title from title page of source document. Document formatted into pages; contains 50 pages. Includes Vita. Includes bibliographical references.

Im Rahmen der RELAZA-Studie sollte die Wirksamkeit sowie die Sicherheit von AZA in der Verzögerung bzw. Vermeidung eines hämatologischen Rezidivs bei Patienten mit CD34+ MDS oder AML bei fallendem CD34-Spenderchimärismus nach allogener SZT untersucht werden. Als primäre Zielparameter galten hierbei die Ansprechrate im Sinne eines CD34-Spenderchimärismusanstiegs auf ≥ 80% (majores Ansprechen) etwa einen Monat nach Ende des 4. Zyklus AZA sowie die Dauer dieses Ansprechens. Ferner sollte der weitere Krankheitsverlauf, das Gesamt- und auch rezidivfreie Überleben sowie die Verträglichkeit und die Beeinflussung der GvHD untersucht werden. Dazu wurde der Anteil CD34+ Spenderzellen im peripheren Blut von insgesamt 53 Patienten im Abstand von drei bis vier Wochen und ab dem 9.-24. Monat nach allogener SZT alle sieben bis acht Wochen bestimmt. Die 20 Patienten, die während dieser Screeningphase einen CD34-Spenderzellabfall auf < 80% zeigten, aber gleichzeitig kein hämatologisches Rezidiv und transfusionsunabhängig > 3 Gpt/l Leukozyten sowie > 75 Gpt/l Thrombozyten aufwiesen, wurden in die Therapiegruppe aufgenommen. AZA wurde pro Zyklus unter entsprechender antiemetischer Prophylaxe in einer Dosis von 75 mg/m2/Tag über sieben aufeinanderfolgende Tage subkutan verabreicht. Der Abstand zwischen dem jeweiligen Beginn zweier Zyklen betrug circa 28 Tage. Es wurden zunächst nur vier Zyklen AZA in Folge appliziert. Einen Monat nach Ende des 4. Zyklus erfolgte die Bewertung des Ansprechens durch Zuordnung der einzelnen Patienten zu den Gruppen „majores Ansprechen“ (CD34-Spenderzellchimärismus ≥ 80%), „minores Ansprechen“ (CD34-Spenderzellchimärismus < 80%, aber kein Rezidiv) und „Rezidiv“. Um bei Patienten, die bis dahin nur ein minores Ansprechen erreicht hatten oder deren CD34-Spenderzellchimärismus wieder auf < 80% abgefallen war, ein (erneutes) majores Ansprechen zu induzieren, konnten im Anschluss an Block 1 (Zyklus 1-4) im Rahmen von Block 2 und 3 jeweils weitere vier Zyklen AZA gegeben werden. Vor jedem neuen Zyklus erfolgte die Kontrolle wesentlicher Laborparameter (großes Blutbild, ALAT, ASAT, GGT, Creatinin, Harnstoff, Natrium, Kalium, Bilirubin, CRP) sowie die Bewertung der GvHD. Nach dem 2. und 4. Zyklus jedes Blocks fanden eine erneute Knochenmarkpunktion sowie die Analyse des CD34-Spenderchimärismus statt. Der CD34-Spenderchimärismus der 20 Patienten der Therapiegruppe war im Median 169 Tage nach der letzten SZT auf < 80% abgefallen, sodass die Therapie mit AZA bei diesen Patienten begonnen wurde. Nach nur vier Zyklen AZA konnte bei 16 von 20 (80%) Patienten eine Stabilisierung oder Verminderung der MRD festgestellt werden. Insgesamt zeigten zehn der 20 (50%) Patienten ein majores Ansprechen. Dieses war zum Studienabschluss im Januar 2011 allerdings nur noch bei drei Patienten (medianes follow up von 300 Tagen (Spannweite 181–899 Tage) nach Ende des 1. Blocks) nachweisbar. Sechs (30%) Patienten zeigten nach dem 4. Zyklus ein minores Ansprechen und vier (20%) waren bereits im Rezidiv. Von den 16 Patienten, die entweder ein majores oder minores Ansprechen zeigten, begannen 11 Patienten mit dem zweiten und vier auch noch mit dem dritten Block. Durch diese Wiederbehandlung mit AZA konnte allerdings nur bei einer Patientin ein (erneutes) majores Ansprechen erreicht werden, welches jedoch nur etwa einen Monat anhielt. Zusammenfassend betrachtet haben bis zum Studienabschluss 13 von 20 (65%) Therapiepatienten rezidiviert. Das rezidivfreie Überleben dieser Patienten betrug im Median 231 Tage (Spannweite 56–558 Tage), das Gesamtüberleben lag bei im Median 470 Tagen (Spannweite 182-1440 Tage) nach dem initialen Abfall des CD34-Subsetchimärismus < 80%. Neun von ihnen sind im Median 293 Tage (Spannweite 182 – 1159 Tage) nach CD34-Spenderchimärismusabfall verstorben. Vier der 20 Patienten haben bis zum Abschluss der Studie, das heißt im Median 347 Tage (Spannweite 297 – 998 Tage) nach dem ersten Abfall des CD34-Subsetchimärismus < 80%, rezidivfrei überlebt. Drei von ihnen zeigten zum Studienabschluss ein bis dahin im Median seit 300 Tagen (Spannweite 181 – 899 Tage) nach Therapieende bestehendes stabiles majores Ansprechen. Die restlichen drei der 20 Therapiepatienten sind nicht Rezidiv-assoziiert verstorben. Das Gesamtüberleben aller Therapiepatienten lag bei im Median 347 Tagen (Spannweite 162–1440 Tage) nach Abfall der CD34+ Zellen unter die 80% Grenze. Die Hauptnebenwirkung von AZA bestand in der Induktion schwerer Zytopenien, die bei sechs von 20 Patienten zu Infektionen führten. Diese konnten jedoch entweder ambulant oder stationär gut beherrscht werden, sodass sie weder zum Abbruch der Studie noch zum Tod eines Patienten führten. Ansonsten konnte durch Dosisanpassungen, Zyklusverschiebungen sowie durch die Gabe von Wachstumsfaktoren (G-CSF) eine Regeneration des Blutbilds erreicht werden. Gravierende Verschlechterungen bestehender GvHD wurden nicht beobachtet. Hingegen konnte die immunsuppressive Medikation unter den ersten vier Zyklen AZA bei vier von sechs Patienten beendet werden. Die RELAZA-Studie hat gezeigt, dass AZA unter akzeptablen Nebenwirkungen in der Lage ist, das Auftreten eines hämatologischen Rezidivs bei Abfall des CD34-Spenderzellchimärimus nach allogener SZT zumindest zu verzögern. Allerdings mussten wir feststellen, dass nur die Hälfte der Patienten ein majores Ansprechen zeigte und dieses bei den meisten Patienten nur von kurzer Dauer war. Deshalb gehen wir davon aus, dass sowohl zur Induktion eines majoren Ansprechens als auch zum Erhalt desselben vier Zyklen AZA in Folge nicht ausreichend sind. Der Effekt eines dahingehend veränderten Applikationsschemas wird bereits im Rahmen der RELAZA-II-Studie untersucht.

Acute erythroleukemia (AEL) is a rare disease typically associated with a poor prognosis. Themedian survival ranges between 3–9months frominitial diagnosis. Hypomethylating agents (HMAs) have been shown to prolong survival in patients with myelodysplastic syndromes (MDS) and AML, but there is limited data of their efficacy in AEL. We collected data from 210 AEL patients treated at 28 international sites. Overall survival (OS) and PFS were estimated using the Kaplan-Meier method and the log-rank test was used for subgroup comparisons. Survival between treatment groups was compared using the Cox proportional hazards regression model. Eighty-eight patients were treated with HMAs, 44 front line, and 122 with intensive chemotherapy (ICT). ICT led to a higher overall response rate (complete or partial) compared to first-line HMA (72% vs. 46.2%, respectively; p 0.001), but similar progression-free survival (8.0 vs. 9.4 months; p = 0.342). Overall survival was similar for ICT vs. HMAs (10.5 vs. 13.7months; p = 0.564), but patients with high-risk cytogenetics treated with HMA first-line lived longer (7.5 for ICT vs. 13.3 months; p = 0.039). Our results support the therapeutic value of HMA in AEL.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23777号 / 医博第4823号 / 新制||医||1057(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 江藤 浩之, 教授 寺田 智祐, 教授 小川 誠司 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

CCCTC-binding factor (CTCF) can both activate as well as inhibit transcription by forming chromatin loops between regulatory regions and promoters. In this regard, Ctcf binding on the non-methylated DNA and its interaction with the Cohesin complex results in differential regulation of the H19/Igf2 locus. Similarly, a role for CTCF has been established in normal hematopoietic development; however its involvement, despite mutations in CTCF and Cohesin complex were identified in leukemia, remains elusive. CTCF regulates transcription dependently on DNA methylation status and can if bound block interactions of enhancers and promoters. Here, we show that in hematopietic cells CTCF binds to the imprinting control region of H19/Igf2 and found that chromatin remodeller Smarca5, which also associates with the Cohesin complex, facilitates Ctcf binding and regulatory effects. Furthermore, Smarca5 supports CTCF functionally and is needed for enhancer-blocking effect at imprinting control region. We identified new CTCF-recognized locus near hematopoietic regulator SPI1 (PU.1) in normally differentiating myeloid cells together with members of the Cohesin complex. Due to DNA methylation, CTCF binding to the SPI1 gene is reduced in AML blasts and this effect was reversible by DNA methylation inhibitor 5-azacitidine.

Hematopoiesis has been for many years seen as a straightforward process based on sequential restriction of cell fate potential leading to production of mature blood cells. In the last decade, however, several works documented an unexpected plasticity of hematopoietic cells with expanded potential of myeloid development from lymphoid progenitors and vice versa. Under physiologic conditions hematopoiesis is tightly controlled and the definite cell fate is denominated by multiple factors that all lead to changes in regulatory networks that include transcription factors, epigenetic changes and post-transcriptional modulations. Any disruption of this strict regulation, caused by mutations or other events, affects the proliferation and lineage fidelity of hematopoietic precursors. This may lead to clonal growth of variable significance or leukemogenesis and may possibly affect the treatment sensitivity of the hematological malignancies. For better understanding of hematopoietic regulation we described gene expression changes during physiological development of lymphoid and myeloid lineages and in leukemic specimens using our own simplified real-time PCR based platform. We investigated expression of 95 genes connected with lymphoid and myeloid differentiation or with leukemogenesis in sorted hematopoietic...

The overall aim of this thesis is to improve knowledge about the prevention of infectious and bleeding complications in patients with hematological malignancies, primarily in those with chronic lymphocytic leukemia (CLL) and myelodysplatic syndrome (MDS). Hypogammaglobulinemia, impaired production of immunoglobulins (Ig), is an established risk factor for infection, but the impact of IgG pure subclass deficiency (IgG subclass deficiency with adequate production of IgG, IgA, and IgM) has been debated. In a retrospective single institution study, we concluded that pure IgG subclass deficiency in CLL patients is rare and is not associated with an increased risk of infection. Hence, routine analysis of IgG subclasses in patients with CLL is not warranted. There is no consensus on recommending vaccination against Streptococcus pneumoniae to CLL patients mainly because comparative studies are lacking. In our randomized trial, the efficacy of a conjugated pneumococcal vaccine on immune response was superior or equal to a polysaccharide vaccine for all pneumococcal serotypes common for the two vaccines. A conjugate pneumococcal vaccine should therefore be included in vaccination programs for patients with CLL. Bronchoalveolar lavage (BAL) is a well-established invasive method to identify the cause of pulmonary infiltrates in immunocompromised patients. In a retrospective trial, we have studied the diagnostic yield of BAL in patients with hematological malignancies. We concluded that BAL is highly useful in either verifying or excluding some of the important respiratory tract infections affecting these patients, particularly invasive pulmonary aspergillosis (IPA) and Pneumocystis jirovecii pneumonia (PJP). However, standardized procedures for BAL sampling should be continually revised to avoid unnecessary microbiological tests. Thrombocytopenia, an adverse prognostic factor in patients with MDS, can be aggravated by azacitidine, first-line treatment for high-risk MDS. Eltrombopag, a thrombopoietin-receptor agonist (TPO-R), alleviates thrombocytopenia in patients with immune thrombocytopenic purpura (ITP). In a phase I clinical trial, we concluded that the combination of eltrombopag and azacitidine in high-risk MDS patients with thrombocytopenia is feasible and well tolerated in doses up to 200 mg eltrombopag daily.