Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-21Bitstream added on 2014-06-13T18:56:30Z : No. of bitstreams: 1 gomes_ac_me_araca.pdf: 617778 bytes, checksum: dc3fa0c485a53f6482fbc321ee95103f (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste trabalho foi investigar os mecanismos envolvidos na migração de neutrófilos induzida pelo MTA para cavidade peritoneal de camundongos. Observouse que o MTA induziu migração de neutrófilos de maneira dose-dependente (0,5; 5; 50 e 100 mg/cavidade), alcançando o pico de migração 6 horas após a injeção do estímulo com a dose de 50 mg/cavidade. Esta migração foi parcialmente inibida pelo pré-tratamento dos animais com dexametasona (1 mg/Kg), BWA4C (50 mg/Kg) e U75302 (0,5 mg/Kg). Diferentemente, a Indometacina (5 mg/Kg) foi inefetiva neste processo. Verificou-se também que os animais estimulados com MTA (50 mg/cavidade) apresentaram uma liberação significativa de IL-1ß e MIP-2 no exsudato peritoneal. O pré-tratamento com Tioglicolato aumentou em cerca de 380% a população de macrófagos na cavidade peritoneal, potencializando a migração de neutrófilos induzida pelo MTA (p<0,05). O pré-tratamento com composto 48/80 depletou cerca de 75% a população de mastócitos, diminuindo a migração de neutrófilos (p<0,05). A injeção de MTA na bolha de ar subcutânea induziu uma migração de neutrófilos menor comparada à cavidade peritoneal. Estes resultados confirmam a participação de mastócitos e macrófagos na migração de neutrófilos induzida pelo MTA. A injeção de sobrenadante de macrófagos e mastócitos estimulados com MTA na cavidade peritoneal de camundongos causou significante migração de neutrófilos (p<0,05), que foi parcialmente inibida pelo pré-tratamento das células por dexametasona (10 æMolar), BWA4C (100 æMolar) e U75302 (10 æMolar) sugerindo a liberação por essas células de LTB4 e citocinas e/ou quimiocinas. Confirmando esses dados,... / The aim of this study was to investigate the mechanism involved in the neutrophil migration induced by MTA into peritoneal cavity in mice. It was observed that MTA induced a dose dependent neutrophil migration (0.5, 5, 50 and 100 mg/cavity), achieving the peak 6 hours after the stimulation with 50 mg/cavity. Neutrophil migration was inhibited by the pre-treatment with dexamethasone (1 mg/Kg), BWA4C (50 mg/Kg) and U75302 (0,5 mg/Kg). Differently indometacin (5 mg/Kg) was ineffective in this process. It was seen that the animals stimulated with MTA (50 mg/cavity) showed a significative amount of IL-1ß and MIP-2 released to the peritoneal exudate. The pretreatment with Thioglycolate 3% increased 380% the macropahge population into the peritoneal cavity, increasing the MTA-induced neutrophil migration (p<0.05). The pretreatment with 48/80 compound decreased 75% the mast cell population in the peritoneal cavity and decreased the MTAinduced neutrophil migration (p<0.05). The injection of MTA in the air-pouch cavity induced a neutrophil migration, however, the recruitment was shorter than that induced into the peritoneal cavity. These data confirm the participation of the mast cell and macrophages in the MTA-induced neutrophil migration. The injection of MTA-stimulated macrophages and mast cells supernatants into the mice peritoneal cavity induced a significant neutrophil migration that was inhibited by the pretreatment with dexamethasone (10 æMolar), BWA4C (100 æMolar) and U75302 (10 æMolar) suggesting the release of LTB4 and cytokines and/or chemokines by these cells. Besides, macrophages and mast cells MTA-induced were able to express in vitro IL-1ß MIP-2 and 5-LO mRNA. In conclusion, the neutrophil migration into mice peritoneal cavity induced by MTA was dependent on mast cells and macrophages, which expressed IL-1ß, MIP-2 and LTB4.

Obtaining enantiomerically pure compounds is of major importance in modern organic chemistry, and this PhD thesis outlines new advances made in this area. Two new enantioselective synthetic methodologies have been designed using isothiourea based- organocatalysts. A brief introduction to the recent literature involving this catalyst architecture is presented. Then, the results of the structure-activity relationship study carried out on a range of isothiourea catalysts for the kinetic resolution of (±)-1-naphthylethanol 16 is described. Chiral isothiourea HBTM 2.1 58 was identified as the optimum catalyst and was further employed in the resolution of a range of secondary alcohols. Good levels of conversion (c~50%) and selectivity (S up to 100) were achieved delivering alcohols in high levels of enantioselectivity (up to 98% ee). The synthetic utility of this process was subsequently demonstrated through isolation of a range of enantiopure alcohols (>99% ee) on a preparative scale, using low catalyst loading of HBTM 2.1 (0.10 mol%). Secondly, a new organocatalytic asymmetric transformation involving the generation of a C1-ammonium enolate using isothiourea is described. An intramolecular Michael addition-lactonisation (IMAL) of enone-acid substrates was developed using (‒)-tetramisole 37 as a catalyst. The generality of this protocol was probed via structural variation of the enone-acid substrates, providing a range of highly functionalised syn-polycyclic carbo- and heterocycles in excellent yields, diastereo- and enantioselectivities (up to 99% yield, 99 : 1 dr and 99% ee). Whilst investigating this process, we discovered that using cinchona alkaloid derivatives as catalysts gave preferential access to the diastereomeric anti-products. Therefore, a range of anti-dihydrobenzofurans was synthesised from readily available starting materials in good yield and stereoselectivities (up to 73%, 20 : 80 dr and 99% ee) using OTMS-quinidine catalyst. These two complementary synthetic strategies allowed facile and controllable access to both syn- and anti-diasteroisomers of a product in high enantioselectivity via judicious choice of catalyst. Subsequently, two telescoped procedures combining the synthesis of the enone-acid through olefination and asymmetric functionalisation were designed, giving rapid access to stereodefined pyrrolidines in high levels of diastereo- and enantioselectivitiy (up to 99 : 1 dr and 99% ee). The last part of this thesis describes preliminary studies toward the development of a doubly diastereoselective intramolecular Michael addition-lactonisation process, opening new avenues for the construction of complex molecular architectures.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-11-06T18:32:25Z No. of bitstreams: 1 Natalia Machado Tavares Avaliação dos mecanismos de controle da infecção...pdf: 5207322 bytes, checksum: 2d216124e5d301463a0d412a4be8ca4f (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-06T18:32:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Natalia Machado Tavares Avaliação dos mecanismos de controle da infecção...pdf: 5207322 bytes, checksum: 2d216124e5d301463a0d412a4be8ca4f (MD5) Previous issue date: 2013 / Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina da Bahia. Salvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / As Leishmanioses compõem um complexo de doenças causadas pelo parasito protozoário do gênero Leishmania. Os neutrófilos são rapidamente recrutados para o local da infecção, capturando parasitos na pele, e são a principal fonte de leucotrieno B4(LTB4), um mediador lipídico pró- nflamatório. Porém, o papel do LTB4 no controle da infecção por Leishmania amazonensis em neutrófilos humanos tem sido pouco investigado. Neste estudo, foi demonstrado que L. amazonensis ou seu lipofosfoglicano (LPG) induziram ativação dos neutrófilos com liberação dos conteúdos granulares e produção de LTB4. Observamos também que este mediador lipídico está envolvido na eliminação de Leishmania dentro do neutrófilo por regular a degranulação e produção de radicais livres de oxigênio (ROS). A infecção por L. amazonensis também induziu um rápido aumento na expressão de TLR2 e TLR4. Porém, apenas TLR2 é internalizado após 3horas e sua expressão é parcialmente dependente de LTB4. Zileuton, o inibidor farmacológico da 5-lipoxigenase (5-­‐LO), e portanto, inibidor da produção de LTB4, reduziu a capacidade leishmanicida e fagocitose dos neutrófilos. Também demonstramos que NFkB é a principal cascata de sinalização responsável pelo mecanismo leishmanicida induzido por LTB4. Tais mecanismos induzidos por LTB4 são, provavelmente, mediados pelo seu receptor endógeno, PPARα. Estes achados revelam o papel essencial do LTB4 na regulação da fagocitose de L.amazonensis por neutrófilos humanos pela internalização de TLR2. Esta via leva à eliminação da L. amazonensis por mecanismos dependentes de LTB4. / Leishmaniasis is a complex of diseases caused by a protozoan parasite from the Leishmania genus. Neutrophils are rapidly recruited to the site of Leishmania infection and play an active role by capturing parasites in the skin. They are known as the main source of leukotriene B 4 (LTB4), a potent pro-­‐inflammatory lipid mediator. However, the role of LTB4 in the control of Leishmania amazonensis infection by human neutrophils has not yet been investigated. In this study, we demonstrated that L. amazonensis or its lipophosphoglycan (LPG) induced neutrophil activation with release of granules content and LTB4 production. We found that this lipid mediator is involved in Leishmania killing inside the neutrophil through the regulation of enzymes granules release and ROS production. L. amazonensis infection also induced a rapid increase of TLR2 and TLR4 expression. However, only TLR2 is internalized at later time point and its expression is partially LTB4-­‐dependent. Zileuton, the pharmacological inhibitor of 5-­‐lipoxigenase (5-­‐LO) and therefore, inhibitor of LTB4 production, decreased killing ability and phagocytosis in L. amazonensis-­‐infected neutrophil. We confirmed that NFkB is the main signaling cascade responsible for the leishmanicidal mechanism induced by LTB4. These effectors mechanisms triggered by LTB4 are probably mediated through its endogenous receptor, PPARα. Our findings reveal the essential role of LTB4 in regulating L. amazonensis phagocytosis by human neutrophils through TLR2 internalization. This pathway leads to L. amazonensis elimination also by LTB4-­‐ dependent mechanisms.

Master of Science

Os mecanismos que conferem resistência do Mycobacterium tuberculosis (Mtb) à destruição pelo hospedeiro, além da sua capacidade em permanecer e/ou multiplicar-se no interior das células fagocitárias são ainda pouco compreendidos. Nosso grupo de pesquisa tem contribuído para o entendimento do papel dos mediadores lipídicos, que incluem prostaglandinas (PGs) e leucotrienos (LTs) na tuberculose. PGs inibem a resposta imune celular TH1, a produção de citocinas e a fagocitose, e assim facilita a infecção. LTs estão envolvidos no recrutamento de leucócitos, e na modulação da síntese de citocinas, no aumento da fagocitose e dos mecanismos microbicidas, e assim contribui para a eliminação da micobactéria. Neste projeto, avaliamos in vivo e in vitro a produção dos mediadores lipídicos induzidos por cepas de Mtb isolados de pacientes com tuberculose ativa. Demonstramos neste trabalho que macrófagos alveolares infectados com os bacilos da cepa SV009 levam a maior produção de TNF- e nitrito, do que aqueles infectados com a cepa SV068. Em contraste, macrófagos alveolares infectados com os bacilos da cepa SV068 induzem a produção de muito mais LTB4, quando comparado aos bacilos da cepa SV009. Obtivemos maior recuperação de unidades formadoras de colônia (UFC) de macrófagos alveolares tratados com MK886 e infectados com bacilos da cepa SV068; enquanto que mais UFCs foram recuperadas após o tratamento com ácido caféico e infecção com a cepa SV009. Com relação a formação de corpúsculos lipídicos (CLs), observamos um maior número destes quando macrófagos alveolares foram infectados com bacilos da cepa SV068. Ainda, observamos diminuição de CLs quando tratados com MK886 ou ácido caféico. Os bacilos da cepa SV068 foram mais fagocitados, mas os macrófagos não foram muito eficazes na atividade microbicida dos mesmos. Nos experimentos in vivo vimos que camundongos balb/c infectados com a cepa SV068 morrem mais e o tratamento com MK886 parcialmente os protege e a mortalidade não está relacionada com a maior carga bacilar no pulmão ou baço. Houve aumento no recrutamento de neutrófilos induzido pela infecção especialmente após infecção com os bacilos da cepa SV068, sendo que o tratamento com MK886 inibe significativamente o recrutamento quando comparado à infecção com os bacilos da cepa SV009. Células mononucleares também foram recrutadas e permaneceram aumentadas até o final do período observado, sem muitas diferenças significativas quando comparamos a infecção com os isolados SV009 e SV068. A produção de nitrito também encontrou-se elevada em animais infectados com bacilos da cepa SV068. A análise histopatológica dos pulmões dos animais infectados mostrou intensa reação inflamatória com maior comprometimento do parênquima pulmonar dos camundongos infectados bacilos da cepa SV068, com intensa deposição de colágeno e multiplicação bacilar. Encontramos diferenças significativas em relação à producão de citocinas IL-6, IL-10, IL-1, IFN-, TNF- and IL-12 após infecção de 30 e 60 dias com as cepas SV009 e SV068. Também mostramos que há diferenças na produção de LTB4 e PGE2 após 30 e 60 dias de infecção com as cepas SV009 e SV068 em células do camundongos balb/c. Experimentos com animais 129 e 5LO-/- infectados com as duas cepas também foram realizados, e vimos que os animais 5LO-/- são mais suscetíveis à infecção especialmente quando infectados com a cepa SV068. Sugerimos que as cepas são diferentes, mas dependentes de um conjunto de fatores, e nossos dados sugerem que dentre estes mecanismos a produção de TNF- e também de mediadores lipídicos (LTB4 e PGE2) estão envolvidos. / The mechanisms that confer resistance to Mycobacterium tuberculosis (Mtb) for destruction by the host, in addition to its ability to retain and/or multiply within phagocytic cells are still poorly understood. Our research group has contributed to the understanding of the role of lipid mediators, including prostaglandins (PGs) and leukotrienes (LTs) in tuberculosis. PGs inhibit Th1 cell immune response, cytokine production and phagocytosis, thus facilitating the infection. LTs are involved in the leukocytes recruitment, and modulation of cytokine synthesis, phagocytosis and microbicidal mechanisms enhancement, and contribute to the elimination of the mycobacteria. In this project, we evaluated in vivo and in vitro the lipid mediators production induced by Mtb strains isolated from patients with active tuberculosis. We demonstrated in this study that alveolar macrophages infected with bacilli from SV009 strain lead to an increase of TNF- production and nitrite, than those infected with the strain SV068. In contrast, alveolar macrophages infected with bacilli from SV068 strain induced more LTB4 production when compared to SV009 infection. We obtained higher recovery colony forming units (CFU) of alveolar macrophages treated with MK886 and infected with bacilli from SV068 strain; while more CFUs were recovered after treatment with caffeic acid and infection with bacilli from SV009 strain. Regarding the lipid bodies (LBs) formation, we observed a greater number of these structures, when alveolar macrophages were infected with bacilli from SV068 strain. Still, we observed a decrease of LBs when the macrophages were treated with MK886 and caffeic acid. Bacilli from SV068 strain were more phagocytosed, but macrophages were not very effective in the microbicidal activity. In the in vivo experiments we found that mice infected with SV068 strain die more than the other and MK886 treatment partially protects the mice, besides, the mortality is not related to the higher bacterial load in the lung or spleen. There was an increase in neutrophil recruitment induced after infection, especially after infection with SV068 strain, and treatment with MK886 significantly inhibits recruitment when compared to infection with SV009 strain. Mononuclear cells were also recruited and remained increased until the end of the observed period, without many significant differences when comparing infection with SV009 and SV068 strains. The nitrite production was also found greater in animals infected with bacilli from SV068 strain. Histopathological analysis of the infected mice lungs showed an intense inflammatory reaction with greater impairment of the mice lungs when infected with bacilli from SV068 strain with an intense collagen deposition and multiplication of bacilli. We suggest that the SV068 strain is more virulent and participates of the immune response by lipid mediators dependent mechanisms.

O Histoplasma capsulatum é um fungo dimórfico responsável por infecções pulmonares graves caracterizadas por reação granulomatosa. Sua incidência vem aumentando nos últimos anos devido principalmente às alterações imunológicas relacionadas ao comprometimento da imunidade celular. Anteriormente, nosso grupo de pesquisa demonstrou o envolvimento dos leucotrienos (LTs) nos mecanismos de defesa do hospedeiro durante a histoplasmose. Além disso, demonstrou que antígenos livres de células (CFAgs, do inglês cell-free antigens), derivados de H. capsulatum, quando empregados na imunização de animais, conferem proteção eficiente aos mesmos e controle da infecção, uma vez que ativam a imunidade celular, e aumento da produção de LTs nos pulmões dos animais imunizados. Assim, nosso grupo desenvolveu microesferas (MS) biodegradáveis, constituídas de ésteres derivados dos ácidos láctico e glicólico (PLGA), contendo LTB4. Estas MS foram avidamente fagocitadas por macrófagos in vitro e aumentaram o recrutamento de leucócitos para os pulmões, quando administradas intratraquealmente. Diante do papel dos LTs na histoplasmose e dos potenciais terapêutico e profilático dos CFAgs, o objetivo deste estudo foi avaliar as atividades biológicas in vitro e in vivo de MS contendo LTB4 e/ou CFAgs. Assim, foram desenvolvidas MS (PLGA) contendo LTB4 e/ou CFAgs através do processo de simples ou dupla emulsão seguido pela extração do solvente. Este método permitiu uma eficiente encapsulação tanto do mediador lipídico quanto dos antígenos protéicos e um perfil de liberação sustentada ao longo dos dias avaliados. O potencial zeta e a morfologia das MS não foram alterados com o processo de microencapsulação; da mesma forma, a integridade dos CFAgs não foi interferida. Para estudos in vitro, empregamos macrófagos diferenciados de medula óssea murina (BMDM). O tamanho adequado das MS contribuiu para sua eficiente fagocitose pelos BMDM e as MS contendo LTB4 e/ou CFAgs modularam a produção de TNF-, IL-1, IL-6 e IL-12, quimiocinas (KC, MCP-1 e RANTES), e nitrito, sendo que as MS-CFAgs mostraram-se mais potentes. O estímulo com as diferentes MS induziu discreto aumento na expressão de CD86 na superfície de BMDM. Neste contexto, verificamos o envolvimento do fator de transcrição NF-B durante a ativação de BMDM induzida pelas MS. Apesar da eficiente ativação dos BMDM induzida pelas MS, não foi possível evidenciar uma resposta imune celular em animais imunizados com as MS-LTB4+CFAgs ou MS-CFAgs. Portanto, futuros experimentos deverão ser realizados a fim de investigar o potencial profilático das MS contendo LTB4 e/ou CFAgs na histoplasmose. / Histoplasma capsulatum is a dimorphic pathogenic fungus that causes a pulmonary disease characterized by chronic granulomatous reaction. In the last years, the incidence of histoplasmosis has increased, mainly as a result of the immunological alterations involved with deficiency of the cellular immunity. Previously, our research group demonstrated the involvement of leukotrienes (LTs) on host defense mechanisms during the histoplasmosis. Cell-free antigens (CFAgs) derived from H. capsulatum, when employed for animals´ immunization, can confer efficient protection and control of the infection, since they activate the cellular immunity. Furthermore, the protection of CFAgs-immunized mice was associated with increased LTB4 generation in the lungs. Based on these results, our group developed biodegradable microspheres (MS) based on PLGA containing LTB4. We showed that these MS were phagocytosed by macrophages in vitro and increased the leukocyte recruitment into the lungs, when administrated via intratracheal. Because the role of leukotrienes in the histoplasmosis and therapeutic and profilatic effects of CFAgs, the aim of this study was evaluate the in vitro and in vivo biological activities of MS containing LTB4 and/or CFAgs. Then, MS (PLGA) containing LTB4 and/or CFAgs were developed through simple or double emulsion/extraction process. This method allowed an efficient encapsulation of the lipid mediator and CFAgs, and a sustained release profile during the evaluated days. Zeta potential and morphology of MS were not altered with the microencapsulation process; CFAgs integrity was not interfered. For in vitro studies, we employed bone marrow-derived macrophages (BMDM). The appropriate size of MS contributed for efficient uptake by BMDM. MS containing LTB4 and/or CFAgs modulated the TNF-, IL-1, IL-6 and IL-12, chemokines (KC, MCP-1 and RANTES), and nitrite production by BMDM, since the MS-CFAgs showed potent immunostimulant effect. Moreover, the stimulus with different MS provoked a discreet increase in the CD86 cell expression. Also we verified an involvement of the transcription factor NF-B during the BMDM activation induced by MS. Even though the in vitro biological activities on BMDM, it was not possible to evidence a cellular immune response in immunized mice with the MS-LTB4+CFAgs or MS-CFAgs. Therefore, future experiments should be conducted in order to investigate the profilatic potential of MS containing LTB4 and/or CFAgs in the histoplasmosis.

Durante a resposta inflamatória alguns mediadores lipídicos, destacando-se o Leucotrieno B4 (LTB4) e a Prostaglandina E2 (PGE2), são liberados no meio e desencadeiam uma série de eventos moleculares e celulares. Não diferentemente do que ocorre em outros tecidos, eventos inflamatórios na polpa também geram a produção destes mediadores lipídicos. Na polpa, entretanto, há presença de células-tronco que persistiram e permanecem indiferenciadas, mas com potencial capacidade de diferenciação em células odontoblast-like. O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão de genes codificadores da síntese e mineralização da matriz dentinária, bem como avaliar a viabilidade celular diante de células indiferenciadas da polpa de camundongos (linhagem OD-21) após estimulação com microesferas de LTB4 e PGE2. Foram preparadas microesferas contendo os mediadores lipídicos (0,01 &mu;M e 0,1 &mu;M) pelo método de simples emulsão óleo-água seguido do processo de evaporação do solvente. Células OD-21 foram mantidas em cultura com os diferentes tratamentos por um período de estimulação de 24 horas para realização de teste de viabilidade celular (Ensaio Colorimétrico MTT). A seguir foi realizada avaliação da expressão gênica relativa dos genes Ibsp, Bmp2, Runx2, Alpl, Msx1 e Bglap pelo método de transcrição reversa e reação em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR), utilizando o sistema TaqMan® após estimulação por períodos de 3, 6, 24, 48 e 72 horas. Foi observado aumento significativo no número de células viáveis após um período de 24 horas de estimulação com microesferas contendo PGE2 a 0,1 &mu;M. A estimulação com microesferas, porém, não induziu a expressão de Alpl, Msx1 e Bglap, mas o fez para os genes Ibsp, Bmp2 e Runx2, em períodos mais curtos de estimulação. A PGE2 encapsulada em microesferas foi capaz de modificar o padrão de expressão gênica de Bmp2 e Runx2 em cultura de células OD-21, sendo que o LTB4 mostrou um papel inibidor da expressão gênica de Ibsp. Estes resultados indicam que estes mediadores podem ser importantes no processo de proliferação e diferenciação de células da polpa dental. / During the inflammatory response some lipid mediators, especially Leukotriene B4 (LTB4) and Prostaglandin E2 (PGE2), are released into the environment and trigger a series of molecular and cellular events. Inflammatory events in the pulp also generate the production of these lipid mediators. However in the pulp there is the presence of stem cells that persisted and remain undifferentiated, but with ability to differentiate into odontoblast-like cells. The aim of to this study was to evaluate of gene expression encoding to the synthesis and mineralization of dentin matrix and to assess cell viability in undifferentiated cells of mice pulp (OD-21 strain) after stimulation with PGE2 and LTB4 microspheres. Microspheres containing lipid mediators were prepared (0.01 &mu;M and 0.1 &mu;M) using an oil-in water emulsion solvent extraction-evaporation process. OD-21 cells were maintained in culture with the different treatments during 24 hours for cell viability test (MTT colorimetric assay). After was made the evaluation of the relative gene expression of genes Ibsp, Bmp2, Runx2, Alpl, Msx1 and Bglap by reverse transcription method and real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR), using the TaqMan® system after stimulation for 3, 6, 24, 48 and 72 hours. There was a significant increase in the number of viable cells following a 24 hours stimulation with microspheres containing PGE2 0.1 &mu;M. The microspheres stimulation did not induce the expression of Alpl, Msx1 and Bglap, but did in genes Ibsp, Runx2 and Bmp2, in shorter periods of stimulation. PGE2 microespheres modified the pattern of Bmp2 and Runx2 gene expression in OD-21 cell culture whereas LTB4 revealed an inhibitory effect on Ibsp expression. These findings indicate that lipid mediators might be important for dental pulp cell proliferation and differentiation.

Durante a resposta inflamatória alguns mediadores lipídicos, destacando-se o Leucotrieno B4 (LTB4) e a Prostaglandina E2 (PGE2), são liberados no meio e desencadeiam uma série de eventos moleculares e celulares. Não diferentemente do que ocorre em outros tecidos, eventos inflamatórios na polpa também geram a produção destes mediadores lipídicos. Na polpa, entretanto, há presença de células-tronco que persistiram e permanecem indiferenciadas, mas com potencial capacidade de diferenciação em células odontoblast-like. O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão de genes codificadores da síntese e mineralização da matriz dentinária, bem como avaliar a viabilidade celular diante de células indiferenciadas da polpa de camundongos (linhagem OD-21) após estimulação com microesferas de LTB4 e PGE2. Foram preparadas microesferas contendo os mediadores lipídicos (0,01 &mu;M e 0,1 &mu;M) pelo método de simples emulsão óleo-água seguido do processo de evaporação do solvente. Células OD-21 foram mantidas em cultura com os diferentes tratamentos por um período de estimulação de 24 horas para realização de teste de viabilidade celular (Ensaio Colorimétrico MTT). A seguir foi realizada avaliação da expressão gênica relativa dos genes Ibsp, Bmp2, Runx2, Alpl, Msx1 e Bglap pelo método de transcrição reversa e reação em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR), utilizando o sistema TaqMan® após estimulação por períodos de 3, 6, 24, 48 e 72 horas. Foi observado aumento significativo no número de células viáveis após um período de 24 horas de estimulação com microesferas contendo PGE2 a 0,1 &mu;M. A estimulação com microesferas, porém, não induziu a expressão de Alpl, Msx1 e Bglap, mas o fez para os genes Ibsp, Bmp2 e Runx2, em períodos mais curtos de estimulação. A PGE2 encapsulada em microesferas foi capaz de modificar o padrão de expressão gênica de Bmp2 e Runx2 em cultura de células OD-21, sendo que o LTB4 mostrou um papel inibidor da expressão gênica de Ibsp. Estes resultados indicam que estes mediadores podem ser importantes no processo de proliferação e diferenciação de células da polpa dental. / During the inflammatory response some lipid mediators, especially Leukotriene B4 (LTB4) and Prostaglandin E2 (PGE2), are released into the environment and trigger a series of molecular and cellular events. Inflammatory events in the pulp also generate the production of these lipid mediators. However in the pulp there is the presence of stem cells that persisted and remain undifferentiated, but with ability to differentiate into odontoblast-like cells. The aim of to this study was to evaluate of gene expression encoding to the synthesis and mineralization of dentin matrix and to assess cell viability in undifferentiated cells of mice pulp (OD-21 strain) after stimulation with PGE2 and LTB4 microspheres. Microspheres containing lipid mediators were prepared (0.01 &mu;M and 0.1 &mu;M) using an oil-in water emulsion solvent extraction-evaporation process. OD-21 cells were maintained in culture with the different treatments during 24 hours for cell viability test (MTT colorimetric assay). After was made the evaluation of the relative gene expression of genes Ibsp, Bmp2, Runx2, Alpl, Msx1 and Bglap by reverse transcription method and real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR), using the TaqMan® system after stimulation for 3, 6, 24, 48 and 72 hours. There was a significant increase in the number of viable cells following a 24 hours stimulation with microspheres containing PGE2 0.1 &mu;M. The microspheres stimulation did not induce the expression of Alpl, Msx1 and Bglap, but did in genes Ibsp, Runx2 and Bmp2, in shorter periods of stimulation. PGE2 microespheres modified the pattern of Bmp2 and Runx2 gene expression in OD-21 cell culture whereas LTB4 revealed an inhibitory effect on Ibsp expression. These findings indicate that lipid mediators might be important for dental pulp cell proliferation and differentiation.

O Histoplasma capsulatum é um fungo dimórfico responsável por infecções pulmonares graves caracterizadas por reação granulomatosa. Sua incidência vem aumentando nos últimos anos devido principalmente às alterações imunológicas relacionadas ao comprometimento da imunidade celular. Anteriormente, nosso grupo de pesquisa demonstrou o envolvimento dos leucotrienos (LTs) nos mecanismos de defesa do hospedeiro durante a histoplasmose. Além disso, demonstrou que antígenos livres de células (CFAgs, do inglês cell-free antigens), derivados de H. capsulatum, quando empregados na imunização de animais, conferem proteção eficiente aos mesmos e controle da infecção, uma vez que ativam a imunidade celular, e aumento da produção de LTs nos pulmões dos animais imunizados. Assim, nosso grupo desenvolveu microesferas (MS) biodegradáveis, constituídas de ésteres derivados dos ácidos láctico e glicólico (PLGA), contendo LTB4. Estas MS foram avidamente fagocitadas por macrófagos in vitro e aumentaram o recrutamento de leucócitos para os pulmões, quando administradas intratraquealmente. Diante do papel dos LTs na histoplasmose e dos potenciais terapêutico e profilático dos CFAgs, o objetivo deste estudo foi avaliar as atividades biológicas in vitro e in vivo de MS contendo LTB4 e/ou CFAgs. Assim, foram desenvolvidas MS (PLGA) contendo LTB4 e/ou CFAgs através do processo de simples ou dupla emulsão seguido pela extração do solvente. Este método permitiu uma eficiente encapsulação tanto do mediador lipídico quanto dos antígenos protéicos e um perfil de liberação sustentada ao longo dos dias avaliados. O potencial zeta e a morfologia das MS não foram alterados com o processo de microencapsulação; da mesma forma, a integridade dos CFAgs não foi interferida. Para estudos in vitro, empregamos macrófagos diferenciados de medula óssea murina (BMDM). O tamanho adequado das MS contribuiu para sua eficiente fagocitose pelos BMDM e as MS contendo LTB4 e/ou CFAgs modularam a produção de TNF-, IL-1, IL-6 e IL-12, quimiocinas (KC, MCP-1 e RANTES), e nitrito, sendo que as MS-CFAgs mostraram-se mais potentes. O estímulo com as diferentes MS induziu discreto aumento na expressão de CD86 na superfície de BMDM. Neste contexto, verificamos o envolvimento do fator de transcrição NF-B durante a ativação de BMDM induzida pelas MS. Apesar da eficiente ativação dos BMDM induzida pelas MS, não foi possível evidenciar uma resposta imune celular em animais imunizados com as MS-LTB4+CFAgs ou MS-CFAgs. Portanto, futuros experimentos deverão ser realizados a fim de investigar o potencial profilático das MS contendo LTB4 e/ou CFAgs na histoplasmose. / Histoplasma capsulatum is a dimorphic pathogenic fungus that causes a pulmonary disease characterized by chronic granulomatous reaction. In the last years, the incidence of histoplasmosis has increased, mainly as a result of the immunological alterations involved with deficiency of the cellular immunity. Previously, our research group demonstrated the involvement of leukotrienes (LTs) on host defense mechanisms during the histoplasmosis. Cell-free antigens (CFAgs) derived from H. capsulatum, when employed for animals´ immunization, can confer efficient protection and control of the infection, since they activate the cellular immunity. Furthermore, the protection of CFAgs-immunized mice was associated with increased LTB4 generation in the lungs. Based on these results, our group developed biodegradable microspheres (MS) based on PLGA containing LTB4. We showed that these MS were phagocytosed by macrophages in vitro and increased the leukocyte recruitment into the lungs, when administrated via intratracheal. Because the role of leukotrienes in the histoplasmosis and therapeutic and profilatic effects of CFAgs, the aim of this study was evaluate the in vitro and in vivo biological activities of MS containing LTB4 and/or CFAgs. Then, MS (PLGA) containing LTB4 and/or CFAgs were developed through simple or double emulsion/extraction process. This method allowed an efficient encapsulation of the lipid mediator and CFAgs, and a sustained release profile during the evaluated days. Zeta potential and morphology of MS were not altered with the microencapsulation process; CFAgs integrity was not interfered. For in vitro studies, we employed bone marrow-derived macrophages (BMDM). The appropriate size of MS contributed for efficient uptake by BMDM. MS containing LTB4 and/or CFAgs modulated the TNF-, IL-1, IL-6 and IL-12, chemokines (KC, MCP-1 and RANTES), and nitrite production by BMDM, since the MS-CFAgs showed potent immunostimulant effect. Moreover, the stimulus with different MS provoked a discreet increase in the CD86 cell expression. Also we verified an involvement of the transcription factor NF-B during the BMDM activation induced by MS. Even though the in vitro biological activities on BMDM, it was not possible to evidence a cellular immune response in immunized mice with the MS-LTB4+CFAgs or MS-CFAgs. Therefore, future experiments should be conducted in order to investigate the profilatic potential of MS containing LTB4 and/or CFAgs in the histoplasmosis.

Os mecanismos que conferem resistência do Mycobacterium tuberculosis (Mtb) à destruição pelo hospedeiro, além da sua capacidade em permanecer e/ou multiplicar-se no interior das células fagocitárias são ainda pouco compreendidos. Nosso grupo de pesquisa tem contribuído para o entendimento do papel dos mediadores lipídicos, que incluem prostaglandinas (PGs) e leucotrienos (LTs) na tuberculose. PGs inibem a resposta imune celular TH1, a produção de citocinas e a fagocitose, e assim facilita a infecção. LTs estão envolvidos no recrutamento de leucócitos, e na modulação da síntese de citocinas, no aumento da fagocitose e dos mecanismos microbicidas, e assim contribui para a eliminação da micobactéria. Neste projeto, avaliamos in vivo e in vitro a produção dos mediadores lipídicos induzidos por cepas de Mtb isolados de pacientes com tuberculose ativa. Demonstramos neste trabalho que macrófagos alveolares infectados com os bacilos da cepa SV009 levam a maior produção de TNF- e nitrito, do que aqueles infectados com a cepa SV068. Em contraste, macrófagos alveolares infectados com os bacilos da cepa SV068 induzem a produção de muito mais LTB4, quando comparado aos bacilos da cepa SV009. Obtivemos maior recuperação de unidades formadoras de colônia (UFC) de macrófagos alveolares tratados com MK886 e infectados com bacilos da cepa SV068; enquanto que mais UFCs foram recuperadas após o tratamento com ácido caféico e infecção com a cepa SV009. Com relação a formação de corpúsculos lipídicos (CLs), observamos um maior número destes quando macrófagos alveolares foram infectados com bacilos da cepa SV068. Ainda, observamos diminuição de CLs quando tratados com MK886 ou ácido caféico. Os bacilos da cepa SV068 foram mais fagocitados, mas os macrófagos não foram muito eficazes na atividade microbicida dos mesmos. Nos experimentos in vivo vimos que camundongos balb/c infectados com a cepa SV068 morrem mais e o tratamento com MK886 parcialmente os protege e a mortalidade não está relacionada com a maior carga bacilar no pulmão ou baço. Houve aumento no recrutamento de neutrófilos induzido pela infecção especialmente após infecção com os bacilos da cepa SV068, sendo que o tratamento com MK886 inibe significativamente o recrutamento quando comparado à infecção com os bacilos da cepa SV009. Células mononucleares também foram recrutadas e permaneceram aumentadas até o final do período observado, sem muitas diferenças significativas quando comparamos a infecção com os isolados SV009 e SV068. A produção de nitrito também encontrou-se elevada em animais infectados com bacilos da cepa SV068. A análise histopatológica dos pulmões dos animais infectados mostrou intensa reação inflamatória com maior comprometimento do parênquima pulmonar dos camundongos infectados bacilos da cepa SV068, com intensa deposição de colágeno e multiplicação bacilar. Encontramos diferenças significativas em relação à producão de citocinas IL-6, IL-10, IL-1, IFN-, TNF- and IL-12 após infecção de 30 e 60 dias com as cepas SV009 e SV068. Também mostramos que há diferenças na produção de LTB4 e PGE2 após 30 e 60 dias de infecção com as cepas SV009 e SV068 em células do camundongos balb/c. Experimentos com animais 129 e 5LO-/- infectados com as duas cepas também foram realizados, e vimos que os animais 5LO-/- são mais suscetíveis à infecção especialmente quando infectados com a cepa SV068. Sugerimos que as cepas são diferentes, mas dependentes de um conjunto de fatores, e nossos dados sugerem que dentre estes mecanismos a produção de TNF- e também de mediadores lipídicos (LTB4 e PGE2) estão envolvidos. / The mechanisms that confer resistance to Mycobacterium tuberculosis (Mtb) for destruction by the host, in addition to its ability to retain and/or multiply within phagocytic cells are still poorly understood. Our research group has contributed to the understanding of the role of lipid mediators, including prostaglandins (PGs) and leukotrienes (LTs) in tuberculosis. PGs inhibit Th1 cell immune response, cytokine production and phagocytosis, thus facilitating the infection. LTs are involved in the leukocytes recruitment, and modulation of cytokine synthesis, phagocytosis and microbicidal mechanisms enhancement, and contribute to the elimination of the mycobacteria. In this project, we evaluated in vivo and in vitro the lipid mediators production induced by Mtb strains isolated from patients with active tuberculosis. We demonstrated in this study that alveolar macrophages infected with bacilli from SV009 strain lead to an increase of TNF- production and nitrite, than those infected with the strain SV068. In contrast, alveolar macrophages infected with bacilli from SV068 strain induced more LTB4 production when compared to SV009 infection. We obtained higher recovery colony forming units (CFU) of alveolar macrophages treated with MK886 and infected with bacilli from SV068 strain; while more CFUs were recovered after treatment with caffeic acid and infection with bacilli from SV009 strain. Regarding the lipid bodies (LBs) formation, we observed a greater number of these structures, when alveolar macrophages were infected with bacilli from SV068 strain. Still, we observed a decrease of LBs when the macrophages were treated with MK886 and caffeic acid. Bacilli from SV068 strain were more phagocytosed, but macrophages were not very effective in the microbicidal activity. In the in vivo experiments we found that mice infected with SV068 strain die more than the other and MK886 treatment partially protects the mice, besides, the mortality is not related to the higher bacterial load in the lung or spleen. There was an increase in neutrophil recruitment induced after infection, especially after infection with SV068 strain, and treatment with MK886 significantly inhibits recruitment when compared to infection with SV009 strain. Mononuclear cells were also recruited and remained increased until the end of the observed period, without many significant differences when comparing infection with SV009 and SV068 strains. The nitrite production was also found greater in animals infected with bacilli from SV068 strain. Histopathological analysis of the infected mice lungs showed an intense inflammatory reaction with greater impairment of the mice lungs when infected with bacilli from SV068 strain with an intense collagen deposition and multiplication of bacilli. We suggest that the SV068 strain is more virulent and participates of the immune response by lipid mediators dependent mechanisms.