Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 422149.pdf: 415747 bytes, checksum: c509f9409deb999a7bde0e7f31c283e9 (MD5) Previous issue date: 2010-01-22 / A Salmonella Enteritidis ? uma das principais bact?rias causadoras de gastrenterite, tamb?m podendo ser respons?vel por doen?as sist?micas. A adequada caracteriza??o deste microrganismo ? essencial nos estudos epidemiol?gicos. Neste contexto, este estudo avaliou a utiliza??o de dois m?todos moleculares, Tipifica??o por Sequenciamento de M?ltiplos loci (MLST) e An?lise de Fragmentos Polim?rficos Amplificados e Fluorescentes (FAFLP), para a diferencia??o de 32 isolados de S. Enteritidis oriundos de diferentes fontes do sul do Brasil, bem como de cinco isolados de S. Enteritidis provenientes de outras ?reas geogr?ficas. Tamb?m foram inclu?dos neste estudo quatro isolados pertencentes a outros sorovares (S. Panama, S. Senftenberg, S. Typhimurium e Salmonella [4,5:-:1,2]. As duas t?cnicas escolhidas para este trabalho j? foram empregadas concomitantemente para analisar diferentes sorotipos de Salmonella, mas este estudo ? o primeiro a utiliz?-las para a diferencia??o de um mesmo grupo de isolados de S. Enteritidis. O esquema desenvolvido para o MLST incluiu a amplifica??o de fragmentos de dois genes constitutivos (hemD e mdh) combinado com dois genes de virul?ncia (ssaQ e slyA), aumentando, assim, a capacidade discriminat?ria do m?todo. Ambas as t?cnicas apresentaram altos ?ndices de poder discriminat?rio, calculados pelo ?ndice de diversidade de Simpson, 0,99 e 0,88 para FAFLP e MLST, respectivamente. Al?m disso, os m?todos avaliados tamb?m mostraram-se eficientes na discrimina??o de isolados de diferentes sorovares de Salmonella. Entretanto, a FAFLP e a MLST n?o foram capazes de diferenciar isolados provavelmente n?o relacionados epidemiologicamente, bem como n?o agruparam isolados pertencentes a um mesmo fagotipo. Desta forma, os resultados obtidos sugerem que ambas as t?cnicas podem ser ferramentas ?teis para a an?lise epidemiol?gica molecular de isolados de Salmonella, inclusive para um sorovar com grande homogeneidade gen?tica como a S. Enteritidis.

Submitted by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-09-08T13:51:47Z No. of bitstreams: 1 OtavioHenriqueB.PintoDissertacao2017.pdf: 3191289 bytes, checksum: b7b005d77190f465fe0685851ff5f090 (MD5) / Approved for entry into archive by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-09-08T13:52:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 OtavioHenriqueB.PintoDissertacao2017.pdf: 3191289 bytes, checksum: b7b005d77190f465fe0685851ff5f090 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-08T13:52:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 OtavioHenriqueB.PintoDissertacao2017.pdf: 3191289 bytes, checksum: b7b005d77190f465fe0685851ff5f090 (MD5) Previous issue date: 2017-03-29 / Acidobacteria is one of the most abundant phyla in soil; however, it is not yet known the reasons for their success in terrestrial habitats. This characteristic may be due to mechanisms of resistance as well as the large amount of glycosyl hydrolases and transferases present in Acidobacteria. Therefore, this study aimed to investigate mechanisms of resistance that may contribute to the abundance of Acidobacteria in soil. In addition, the degradation of cellulose was investigated, to understand its participation in processes of plant biomass degradation. In this study, a member of subdivision 1 of Acidobacteria, Occallatibacter savannae AB23 was used as model. This isolate was taxonomically characterized and cellulose degradation and carotenoid production were evaluated. The degradation of cellulose was evaluated using carboxymethylcellulose (CMC). The pigments were identified since this bacterium produced several carotenoids under different environmental stimuli. The results showed that the isolate AB23 can assimilate CMC, however in a very slow way, requiring 2 months for the visualization of colonies and 1 year to visualization of biomass in liquid medium. For this isolate, endoglucanases were found associated with the cell fraction of culture. In addition, cellobiose has been shown to be a repressor and lactose an inducer of endoglucanases expression. It was possible to observe the production of carotenoids in AB23. By mass spectrometry, it was possible to find ions related to carotenoids: ?? -carotene, neurosporene, lycopene, ??-carotene, ??-carotene, phytoene and phytofluene. These carotenoids might be used as a resistance mechanism since they are produced in response to stress caused by light. However, the presence of vitamins, oxygen and trace elements are essential for carotenoid production. The characteristics found in this work may be one of the mechanisms of persistence and / or resistance that confer abundance for Acidobacteria in soil. / Acidobacteria ?? um dos filos mais abundantes no solo, entretanto, n??o se conhece as raz??es que levam a essa abund??ncia. Estudos indicam que essa caracter??stica pode ser devido a mecanismos de resist??ncia e a grande quantidade de glicosil hidrolases e transferases presentes em Acidobacteria. Assim, esse estudo teve como objetivo investigar mecanismos de resist??ncia que podem contribuir para a abund??ncia de Acidobacteria no solo. Al??m disso, foi investigada a degrada????o de celulose em Acidobacteria, procurando entender sua participa????o em processos de degrada????o de material originado de plantas. Neste estudo foi utilizado como modelo Occallatibacter savannae AB23. Este isolado foi caracterizado taxonomicamente e foram avaliadas a degrada????o de celulose e produ????o de caroten??ides. A degrada????o de celulose foi avaliada utilizando-se carboximetilcelulose (CMC). Para os pigmentos, foram identificados quais carotenoides essa bact??ria produz e os est??mulos que levam a sua produ????o. Os resultados mostraram que o isolado AB23 consegue assimilar CMC, no entanto de uma forma muito lenta, sendo necess??rios 2 meses para a visualiza????o de col??nias. Para este isolado, as endoglucanasases foram encontradas associadas ?? fra????o celular da cultura. Al??m disso, celobiose mostrou ser um repressor e a lactose um indutor da express??o de endocglucanases. Foi poss??vel observar a produ????o de pigmentos em AB23. Por espectrometria de massa, foi poss??vel encontrar ??ons relacionados aos carotenoides: ??-caroteno, neurosporeno, licopeno, ??-caroteno, ??-caroteno, fitoeno e fitoflueno. Estes devem estar sendo empregados como um mecanismo de resist??ncia, uma vez que eles s??o produzidos em resposta ao estresse causado pela luz. No entanto a presen??a de vitaminas, oxig??nio e elementos tra??o s??o essenciais para produ????o desses pigmentos. As caracter??sticas encontradas neste trabalho podem ser um dos mecanismos de persist??ncia e/ou resist??ncia que conferem abund??ncia para Acidobacteria no solo.

Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2016-12-23T13:17:24Z No. of bitstreams: 1 DIS_BRUNO_DALLAGNOL_PARCIAL.pdf: 1004622 bytes, checksum: f24e6bdb92018aba52853bc890c3dc2c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-23T13:17:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DIS_BRUNO_DALLAGNOL_PARCIAL.pdf: 1004622 bytes, checksum: f24e6bdb92018aba52853bc890c3dc2c (MD5) Previous issue date: 2015-03-18 / Anaplasma marginale is a vector-borne pathogen that causes a disease known as anaplasmosis. To date, there are no sequenced genomes of Brazilian strains available. The aim of this work was to compare whole genomes of Brazilian strains of A. marginale (Palmeira and Jaboticabal) with genomes of strains from other regions (North-American and Australian strains). Genome sequencing was performed by next-generation sequencing. Reads were mapped using the genome of the Florida strain of A. marginale as a reference sequence. Identification of single nucleotide polymorphisms (SNPs) and insertions/deletions (INDELs) was performed. Data showed significant differences between the two Brazilian strains, and their comparison with North-American strains (Florida and St. Maries) revealed more nucleotide differences than with Australian strains (Gypsy Plains and Dawn). These results shed light into the evolutionary history of A. marginale and provide the first genome information of South American isolates. Assessing sequences of the genomes of strains from different regions is essential to increase knowledge of the pan-genome of this rickettsia. / Anaplasma marginale ? um pat?geno transmitido por vetores que causa uma doen?a conhecida como anaplasmose. At? o momento, n?o h? genomas sequenciados de cepas brasileiras dispon?veis. O objetivo deste trabalho foi comparar genomas completos de cepas brasileiras de A. marginale (Palmeira e Jaboticabal) com genomas de cepas de outras regi?es (cepas norte-americanas e australianas). O sequenciamento do genoma foi realizado por sequenciamento de alto rendimento. As reads foram mapeadas utilizando o genoma da cepa Florida de A. marginale como uma sequ?ncia de refer?ncia. A identifica??o de polimorfismos de nucleot?deo ?nico (SNPs) e inser??es/dele??es (INDELs) foi realizada. Os dados mostraram diferen?as significativas entre as duas cepas brasileiras, e sua compara??o com as cepas norte-americanas (Fl?rida e St. Maries) revelou mais diferen?as de nucleot?deos do que com as cepas australianas (Gypsy Plains e Dawn). Esses resultados lan?am luz sobre a hist?ria evolutiva de A. marginale e fornecem a primeira informa??o gen?mica de isolados da Am?rica do Sul. Avaliar sequ?ncias dos genomas de cepas de diferentes regi?es ? essencial para aumentar o conhecimento do pangenoma desta rickettsia.

abstract: The following research is a regulatory and emissions analysis of collocated sources of air pollution as they relate to the definition of "major, stationary, sources", if their emissions were amalgamated. The emitting sources chosen for this study are seven facilities located in a single, aggregate mining pit, along the Aqua Fria riverbed in Sun City, Arizona. The sources in question consist of Rock Crushing and Screening plants, Hot Mix Asphalt plants, and Concrete Batch plants. Generally, individual facilities with emissions of a criteria air pollutant over 100 tons per year or 70 tons per year for PM10 in the Maricopa County non-attainment area would be required to operate under a different permitting regime than those with emissions less than stated above. In addition, facility's that emit over 25 tons per year or 150 pounds per hour of NOx would trigger Maricopa County Best Available Control Technology (BACT) and would be required to install more stringent pollution controls. However, in order to circumvent the more stringent permitting requirements, some facilities have "collocated" in order to escape having their emissions calculated as single source, while operating as a single, production entity. The results of this study indicate that the sources analyzed do not collectively emit major source levels of emissions; however, they do trigger year and daily BACT for NOx. It was also discovered that lack of grid power contributes to the use of generators, which is the main source of emissions. Therefore, if grid electricity was introduced in outlying areas of Maricopa County, facilities could significantly reduce the use of generator power; thereby, reducing pollutants associated with generator use. / Dissertation/Thesis / M.S.Tech Technology 2011

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-01-03T21:40:09Z No. of bitstreams: 1 IageTerraGuedesDeOliveira_DISSERT.pdf: 1463923 bytes, checksum: 19dff760e791d43564091519748df937 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-01-09T15:13:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 IageTerraGuedesDeOliveira_DISSERT.pdf: 1463923 bytes, checksum: 19dff760e791d43564091519748df937 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-09T15:13:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 IageTerraGuedesDeOliveira_DISSERT.pdf: 1463923 bytes, checksum: 19dff760e791d43564091519748df937 (MD5) Previous issue date: 2015-08-31 / Os ecossistemas de ?gua doce tem um importante papel na ciclagem global de carbono, uma vez que recebem cerca de 2,9 Pg C ano-1 advindo dos ecossistemas terrestres, processando e/ou estocando at? 2,6 Pg C ano-1.Desses, at? 2,1 Pg C ano-1 s?o mineralizados na coluna d??gua em grande parte pelas bact?rias planct?nicas. Essas s?o os organismos planct?nicos mais numerosos nos ecossistemas aqu?ticos continentais, por isso sendo respons?veis por grande do processamento do carbono. O seu papel dentro da ciclagem do carbono ir? variar de acordo com v?rios par?metros, agindo como fatores regulat?rios. O principal objetivo desse trabalho ? de avaliar o metabolismo bacteriano em dois reservat?rios do semi?rido tropical. Foram coletadas trimestralmente amostras de ?gua nos reservat?rios Santa Cruz e Umari entre fevereiro de 2013 e e novembro de 2014. Foram analisados par?metros f?sico-qu?micos e biol?gicos. O metabolismo bacteriano mostrou-se bastante vari?vel e com pouca previsibilidade. Isso ocorre devido a grande diversidade de fatores regulat?rios existentes que atuam em momentos e em locais diferentes, conjunta e separadamente. Frequentemente, se torna dif?cil prever os valores reais pois em diferentes momentos o metabolismo tanto pode ser influenciado pelas caracter?sticas f?sicas do sistema, bem como da concentra??o de nutrientes e suas implica??es nas intera??es. Sendo assim, mostram-se ind?cios de que o metabolismo bacteriano sofre bastante influ?ncia tanto bottom-up como top-down, podendo sofrer a partir de mudan?as, direcionadas ou aleat?rias, na estrutura da comunidade.

No description available.

In der vorliegenden Arbeit wurden neue Untersuchungsmöglichkeiten mit dem BacT/Alert 3D Mykobakterien-Testsystem erprobt. Erstens wurden Untersuchungen durchgeführt, um die Testkonzentrationen für Protionamid (PTH) und Linezolid (LIZ) für die standardmäßige Empfindlichkeitstestung von M. tuberculosis (Mtb) mit dem BacT/Alert 3D-System festzulegen. Dazu wurden die MHK-Werte für 32 Mtb-Stämme bestimmt: Referenzstamm Mtb H37Rv, sensible Patientenstämme, Patientenstämme mit verschiedenen Resistenzen (u. a. PTH-Resistenz) sowie eigens für die Arbeit isolierte LIZ-resistente Mutanten. Die PTH-MHK betrug für 20 von 21 sensiblen Mtb-Stämmen einschließlich des Referenzstammes Mtb H37Rv 0,125 - 1 mg/l (0,25 mg/l bei 11 von 21 Stämmen). Lediglich ein Stamm mit Resistenz gegenüber Isoniazid, Ethambutol und Streptomycin fiel mit einer etwas erhöhten PTH-MHK von 2 mg/l auf. Sechs PTH-resistente Stämme (z. T. mit anderen Resistenzen gegenüber Erstrang-Antituberkulotika) zeigten PTH-MHK von 4 - 16 mg/l. Die Gruppen der PTH-sensiblen und resistenten Stämme zeigten ein bimodales Verteilungsmuster, das mit einem Schwellenwert von 2 mg PTH/l gut zu differenzieren ist. Für die standardmäßige Durchführung der Empfindlichkeitstestung gegenüber PTH mit dem BacT/Alert 3D-System empfehlen wir deshalb eine PTH-Testkonzentration von 2 mg/l. Die LIZ-MHK betrug für 20 sensible Mtb-Stämme (inklusive Referenzstamm Mtb H37Rv) und sieben Stämme mit verschiedenen Resistenzen gegenüber Erstrang-Antituberkulotika 0,25 - 2 mg/l (0,5 mg/l bei 17 von 27 Stämmen). Für die vier isolierten LIZ-resistenten Mutanten betrug die LIZ-MHK 8 - 16 mg/l. Es zeigt sich auch bei der Verteilung der LIZ-MHK ein bimodales Verteilungsmuster; die Gruppen der sensiblen und resistenten Stämme sind gut zu differenzieren. Wir empfehlen für die standardmäßige Durchführung der Empfindlichkeitstestung gegenüber LIZ mit dem BacT/Alert 3D-System eine LIZ-Testkonzentration von 4 mg/l. Die festgestellten MHK-Werte von PTH und LIZ und die vorgeschlagenen Testkonzentrationen entsprechen Ergebnissen aus der Literatur, die mit ähnlichen Methoden erhoben wurden. Zweitens wurden mit dem BacT/Alert 3D-System Untersuchungen zur Kombinationstestung von Antituberkulotika bei Mtb und Stämmen des MAC-Komplexes durchgeführt, bisher liegen keine Publikationen für Untersuchungen von Wirkstoff-Kombinationen bei Mykobakterien mit diesem System vor. Es wurde geprüft, ob die MHK eines Antituberkulotikums durch die Zugabe einer subinhibitorischen Menge eines anderen Antituberkulotikums verändert wird. Bei Mtb wurden dazu folgende Kombinationen geprüft: Rifampicin (RMP) + LIZ, Moxifloxacin + LIZ, Isoniazid + PTH, RMP + PTH, PTH + LIZ. In keinem Fall konnten signifikante Effekte beobachtet werden. Ein tendenziell synergistischer Effekt der PTH-RMP-Kombination beim Stamm Mtb H37Rv (Reduktion der RMP-MHK um eine Stufe) wurde durch die Analyse der Wachstumskinetik des Stammes unterstützt. Bei zufällig ausgewählten Stämmen des MAC-Komplexes wurde die Kombination Ciprofloxacin (CIP) + Ethambutol (EMB) geprüft. Es zeigte sich bei sieben von zehn Stämmen eine Reduzierung der CIP-MHK um mindestens drei Stufen bei Zugabe einer subinhibitorischen Konzentration von EMB. Dieser synergistische Effekt wurde bereits in den 1990er Jahren mit einer ähnlichen Methode festgestellt, allerdings ohne die Stämme des MAC-Komplexes zu differenzieren (Arbeitsgruppe von S. Hoffner). Interessanterweise handelte es sich bei den von uns untersuchten Stämmen, bei denen dieser synergistische Effekt nachgewiesen wurde, um M. avium-Stämme. Diese Problematik sollte weiter verfolgt werden, da sich daraus Konsequenzen für die Therapieempfehlung ergeben könnten.

Submitted by Ricardo Cedraz Duque Moliterno (ricardo.moliterno@uefs.br) on 2017-10-09T22:34:41Z No. of bitstreams: 1 MATHUES BRITO DE OLIVEIRA Disserta??ov.pdf: 5287293 bytes, checksum: 8d3e3b854b5799f16c0b61b6a5d33f1c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-09T22:34:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MATHUES BRITO DE OLIVEIRA Disserta??ov.pdf: 5287293 bytes, checksum: 8d3e3b854b5799f16c0b61b6a5d33f1c (MD5) Previous issue date: 2017-06-12 / The assembly of bacterial genomes consists of a process of reordering fragments so that the original genome can be represented. However, to maximize the results of genome assembly, some steps are required, for instance, read quality analysis and preprocessing, repetition identification and quality check. The process of assembly of genomes is a complex step that involves the type of sequencing that was used, there are several types of sequencers which imply different characteristics for each one for example: fragments size, throughput, among others. Analyzing these characteristics requires the use of several computational tools, to assist in all the processes mentioned above, and since the range of software available is quite broad and distinct, it is necessary for the user to learn to work with this computational diversity, dominating often knowledge that is not of the biological area, implying in less time for a deepening in biological questions. Based on this context, we developed a pipeline to perform an automated fragment analysis, read preprocessing, genome assembly and orientation of contigs, having as the assembly the main objective of the pipeline and that it will be managed by a Web application called GATOOL (Genome Assembly Tool). Aiming to evaluate the performance of the application, tests were carried out with two samples of prokaryotic organisms, which are: Bacillus amyloliquefaciens and Serratia marcescens. Also perform a test with seven SRA samples. Both organisms are sequenced on the Ion PGMTM platform. The tools used to perform the assembly were SPAdes and Velvet, both assemblers use de Bruijn graph algorithm as a paradigm for the assembly of the genome, after this stage the resulting set of contigs was ordered through the CONTIGuator, which is a reference ordering. We observed that the interface GATOOL allowed a quick and easy execution of several steps and processes in the field of genome assembly, including the assembly of two prokaryotic species in an automated way, thus facilitating the use and accomplishment of such processes by any user. / A montagem de genomas bacterianos ? um processo de reordena??o de fragmentos, de forma que se possa representar o genoma original. Entretanto, para que a montagem de um genoma seja realizada visando maximizar os resultados, ? preciso que algumas etapas sejam cumpridas, por exemplo: a an?lise dos fragmentos, o pr?-processamento destes fragmentos e novamente uma repeti??o do processo de an?lise, para verificar a efic?cia do pr?-processamento realizado. O processo de montagem de genomas ? uma etapa complexa, que envolve o tipo de sequenciamento que foi utilizado. Existem diversos tipos de sequenciadores, o que implica caracter?sticas distintas em cada um, como por exemplo: tamanho dos fragmentos, quantidade de fragmentos gerados por corrida, dentre outros. Analisando essas caracter?sticas, faz-se necess?ria a utiliza??o de diversas ferramentas computacionais para auxiliar a todos os processos citados anteriormente e, como a gama de softwares dispon?veis ? bem ampla e distinta, ? importante que o usu?rio domine essa diversidade computacional, contendo muitas vezes conhecimentos que n?o s?o da ?rea biol?gica, implicando menos tempo para um aprofundamento das quest?es biol?gicas. Com base neste contexto, prop?em-se um pipeline para a realiza??o da an?lise de fragmentos, pr?-processamento dos fragmentos, montagem de genomas e orienta??o de contigs, tendo como a montagem o objetivo principal do pipeline e este ser? gerenciado por uma aplica??o web chamada GATOOL (Genome Assembly Tool). Visando avaliar o desempenho da aplica??o, foram feitos testes com duas amostras de organismos procariontes, que s?o: Bacillus amyloliquefaciens e Serratia marcescens. Tamb?m foram realizados testes com sete amostras SRA. Ambos os organismos est?o sequenciados na plataforma Ion PGMTM. Os montadores usados foram o SPAdes e o Velvet, ambos montadores, utilizam o algor?tmo grafo de Bruijn como paradigma para a montagem do genoma; ap?s esta etapa, o conjunto de contigs resultante foi ordenado atrav?s do CONTIGuator, que ? uma ordena??o por refer?ncia. Observamos que a interface GATOOL permitiu uma execu??o r?pida e f?cil de diversas etapas e processos no campo da montagem de genomas, inclusive realizando a montagem de duas esp?cies procariontes de maneira automatizada, facilitando assim a utiliza??o e realiza??o de tais processos por qualquer usu?rio.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:50:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 400016.pdf: 696310 bytes, checksum: 7f8908ad96586598d5473332eb4bd96b (MD5) Previous issue date: 2008-03-26 / Interferons s?o prote?nas expressas por diferentes c?lulas humanas e sintetizadas como resposta a muitos agentes qu?micos e biol?gicos. Eles est?o envolvidos em repostas antiviral, antiproliferativa e imunomodulat?ria, atuando na manuten??o da homeostase e na prote??o do organismo contra pat?genos. Devido a essa atividade biol?gica, os interferons s?o atualmente aprovados no mundo inteiro para o tratamento de v?rias desordens virais, malignas e imunol?gicas. Interferon β1, por exemplo, ? uma das poucas subst?ncias que provou ser efetiva na supress?o das manifesta??es da esclerose m?ltipla que ? uma doen?a cr?nica do sistema nervoso central. Ele ? produzido comercialmente em microorganismos como Escherichia coli, utilizando a tecnologia do DNA recombinante e ? chamado de biof?rmaco. As patentes de muitos biof?rmacos originais est?o expirando e uma nova gera??o de mol?culas, chamadas biossimilares, est? em desenvolvimento. O interferon β1 foi aprovado para uso no tratamento da esclerose m?ltipla surtoremiss?o pelo Departamento de Controle de Drogas e Alimentos dos EUA em 1993 e perdeu sua prote??o de patente em 2007, tornando-se um alvo para a produ??o do biossimilar pelas ind?strias farmac?uticas. O desenvolvimento do biossimilar interferon β1 ? uma alternativa para o alto custo do biof?rmaco original. Desenvolvemos um protocolo para produzir grandes quantidades do interferon β1, no qual aproximadamente 3 mg da prote?na recombinante homog?nea podem ser obtidos a partir de 1 g de c?lulas de E. coli Rosetta(DE3). As an?lises por seq?enciamento N-terminal de amino?cidos e espectrometria de massas proveram evid?ncias para a identidade e pureza da prote?na recombinante. A an?lise por cromatografia l?quida de fase reversa demonstrou que o conte?do de deamidados e sulf?xidos foi similar ao padr?o comercial, e nenhuma forma heterog?nea da prote?na rhIFN-β1ser17 foi detectada. A an?lise por cromatografia l?quida de exclus?o molecular demonstrou a aus?ncia de agregados de alta massa molecular e de d?meros. O protocolo desenvolvido poder? ser utilizado para a produ??o do biossimilar pelas ind?strias farmac?uticas e deste modo, diminuir os custos do Minist?rio da Sa?de e dos consumidores com este biof?rmaco.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 437675.pdf: 3014292 bytes, checksum: 10c5c967edfd4e61677f7867c8186a73 (MD5) Previous issue date: 2011-12-09 / Tuberculosis (TB) is an infectious disease mainly caused by Mycobacterium tuberculosis, which currently infects one-third of the world s population. Despite the availability of the Bacille Calmette-Gu?rin vaccine and effective short-course chemotherapy, the increasing global burden of TB has been linked to the co-infection with HIV, the emergence of multi, extensively and now totally drug-resistant strains. Furthermore, the capacity of M. tuberculosis to remain viable within infected hosts in a long-term asymptomatic infection is an additional problem for the control of TB. Nucleotides biosynthesis pathways provide promising molecular targets for the development of new vaccines and therapeutic strategies to control the global incidence of TB. Uracil phosphoribosyltransferase (UPRT) catalyzes the conversion of uracil and 5'-phosphoribosyl-a- 1'-pyrophosphate (PRPP) to uridine 5'-monophosphate (UMP) and pyrophosphate (PPi). UPRT plays an important role in the pyrimidine salvage pathway since its product (UMP) is a common precursor of all pyrimidine nucleotides. This work presents cloning, recombinant expression in Escherichia coli, and purification of the upp-encoded M. tuberculosis UPRT (MtUPRT). Mass spectrometry analysis and N-terminal amino acid sequencing confirmed the identity of homogeneous MtUPRT. The molecular mass of the native MtUPRT was shown to follow a monomer-tetramer association model by analytical ultracentrifugation. This enzyme did not show a pronounced regulation by GTP as this nucleotide did not affect enzyme kinetic parameters, and its binding was not detected by isothermal titration calorimetry (ITC). Initial velocity and ITC studies suggested that catalysis proceeds through a sequential ordered mechanism, in which PRPP binds first, followed by uracil binding, and PPi is the first product to be released, followed by UMP. ITC also showed that PRPP and UMP binding are thermodynamically favorable processes. The pH-rate profiles indicated that groups with pK values of 5.7 and 8.1 are important for catalytic activity and a group with a pK value of 9.45 is involved in PRPP binding. Pre-steady-state kinetic data suggested that product release is not the rate-limiting step of the reaction catalyzed by MtUPRT. Kinetic fluorescence studies demonstrated two forms of enzyme in solution of which only one can bind to PRPP. Knockout of the upp gene showed that this gene is not essential for M. tuberculosis H37Rv in the employed experimental conditions and the absence of upp gene did not affect the mycobacterium growth. UPRT is expressed in both high and low oxygen conditions of M. tuberculosis H37Ra growth. MtUPRT is inhibited by an active metabolite of isoxyl, which does not seem to inhibit RNA polymerase, adenine phosphoribosyltransferase and hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase. Minimum inhibitory concentration of isoxyl for M. tuberculosis mutant for upp gene, complemented and wild type strains was 12.8 μg/mL, meaning that the absence of the upp gene did not affect M. tuberculosis sensitivity to isoxyl. Altogether, these data may be useful for a better understanding about the nucleotide biosynthesis pathway in M. tuberculosis and as a framework on which to base efforts towards the development of efficient prophylactic and therapeutic strategies to decrease the global incidence of this pathogen. / A tuberculose (TB) ? uma doen?a infecciosa causada principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis, o qual atualmente infecta um ter?o da popula??o mundial. Apesar da disponibilidade da vacina Bacille Calmette-Gu?rin e da eficaz quimioterapia de curta dura??o, o aumento na incid?ncia global da TB est? relacionado ? co-infec??o com o HIV e ao surgimento de cepas multi, extensivamente e agora totalmente resistente a drogas. Al?m disto, a capacidade do M. tuberculosis de permanecer vi?vel dentro do hospedeiro infectado por longo per?odo em uma infec??o assintom?tica ? um problema adicional para o controle da TB. As rotas de bioss?ntese de nucleot?deos fornecem alvos moleculares promissores para o desenvolvimento de novas vacinas e estrat?gias terap?uticas para controlar a incid?ncia global de TB no mundo. A uracil fosforribosil transferase (UPRT) catalisa a convers?o de uracil e 5 - fosforribosil-a-1 -pirofosfato (PRPP) a uridina 5 -monofosfato (UMP) e pirofosfato (PPi). A UPRT tem um papel importante na rota de salvamento das pirimidinas j? que seu produto (UMP) ? o precursor comum de todos os nucleot?deos pirim?dicos. Este trabalho apresenta a clonagem, express?o recombinante em E. coli, e a purifica??o da UPRT de M. tuberculosis codificada pelo gene upp (MtUPRT). Adicionalmente, foram realizadas an?lises de espectrometria de massas e sequenciamento N-terminal que confirmaram a identidade da MtUPRT homog?nea. A massa molecular da MtUPRT nativa seguiu um modelo de associa??o mon?mero-tetr?mero por ultracentrifuga??o anal?tica. Esta enzima n?o mostrou uma regula??o pronunciada por GTP j? que este nucleot?deo n?o afetou os par?metros cin?ticos da enzima, e a sua liga??o n?o foi detectada por calorimetria de titula??o isot?rmica (ITC). A velocidade inicial e os estudos de ITC sugeriram que a cat?lise procede atrav?s de um mecanismo ordenado sequencial, no qual o PRPP liga primeiramente, seguido pela liga??o de uracil, e PPi ? o primeiro produto a ser liberado, seguido pelo UMP. ITC tamb?m mostrou que a liga??o de PRPP e UMP s?o processos termodinamicamente favor?veis. O perfil de pH indicou que grupamentos com os valores de pK pr?ximos de 5,7 e 8,1 s?o importantes para a atividade catal?tica e um grupamento com valor de pK pr?ximo a 9,45 est? envolvido na liga??o do PRPP. Dados de cin?tica no estado pr?-estacion?rio sugeriram que a libera??o de produto n?o ? a etapa limitante da rea??o catalisada pela MtUPRT. Estudos de fluoresc?ncia demonstraram a exist?ncia de duas formas da enzima em solu??o, das quais apenas uma pode ligar ao PRPP. O nocaute do gene upp demonstrou que este gene n?o ? essencial para o M. tuberculosis H37Rv nas condi??es empregadas no experimento e a aus?ncia do gene upp n?o afetou o crescimento micobacteriano. A UPRT mostrou ser expressa tanto em altas como em baixas concentra??es de oxig?nio. A MtUPRT foi inibida por um metab?lito ativo do isoxyl, que n?o parece inibir as enzimas RNA polimerase, adenina fosforribosil transferase e hipoxantinaguanina fosforribosil transferase. A concentra??o inibit?ria m?nima de isoxyl para as cepas de M. tuberculosis mutante para o gene upp, complementada e tipo selvagem foi de 12,8 μg/mL, o que significa que a aus?ncia do gene upp n?o afetou a sensibilidade do M. tuberculosis ao isoxyl. Assim, estes dados podem ser ?teis para um melhor entendimento sobre a via de bioss?ntese de nucleot?deos em M. tuberculosis e podem servir como base para o desenvolvimento de estrat?gias terap?uticas e preventivas eficientes para diminuir a incid?ncia global deste pat?geno.