(EN) Proteins are the important biologically active substances for the organism, their qualitative and quantitative composition determines thein function in the organism. Protein analysis in biological material is an important part of biological and medical research. This dissertation is focused on the optimalization of sample preparation - the biological materials - namely the pre-analytical phase of sample processing and their preparation for their own analases and also introducing new procedures in theie praparation. The conditions of individual analysis approaches were always optimized by means of one- dimensional and two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. The obtained results were statistically evaluated and other possible approaches to futher research were outlined. The main biological material studied was human saliva with regard to oral health. Comparative study of human saliva was performed (human saliva obtained from caries-free and caries-susceptible people). The saliva composition of individual fractions was investigated with regard to oral health. The study was carried out to compare differences in the abundances of proteins in the saliva of caries-free and caries-susceptible persons, based on label-free mass spectrometry quantification, and to perform a gender...

Les techniques d'imagerie optique, dans la gamme de longueurs d'onde visible et proche infrarouge, permettent d'examiner très facilement les tissus biologiques de manière non invasive. Toutefois la forte diffusion des tissus biologiques limite fortement leur examen en profondeur. Examinés en rétrodiffusion (examen de la peau ou du col de l'uterus par exemple), non seulement les mesures sont polluées par la réflexion spéculaire, mais l'information sur la source volumique du signal est également perdue du fait de la forte diffusion. La prise en compte de la diffusion dans le modèle de propagation de la lumière permet d'évaluer cette distribution volumique du signal lumineux en fonction des propriétés optiques du milieu. Pour sophistiquer l'approche, nous introduisons un filtrage polarimétrique, basé sur l'utilisation de la lumière polarisée elliptiquement, particulièrement approprié à la géométrie de rétrodiffusion, permettant avant tout un sondage sélectif en profondeur tout en s'affranchissant de la réflexion spéculaire. Cette technique permet ainsi d'examiner les tissus à l'échelle mésoscopique (jusqu'à l'échelle du millimètre). / Optical imaging techniques using the visible and near-infrared wavelengths allow an easy and non-invasive way of analysing biological tissues. However, the high scattering of biological tissues significantly limits the depth of examination. Backscattering examination (of skin or of the cervix for example) shows not only that the measurements are polluted by mirror reflection, but also that information about the source of the signal is lost as a result of the high scattering. Including scattering in the light propagation model allows the evaluation of the volume distribution of the light signal as a function of the optical properties of the medium. In order to make the approach more sophisticated, we introduced a polarimetric filtering that uses elliptically polarised light. This is not only particularly appropriate for backscattering geometry, but also allows firstly to probe at selected depths and secondly to eliminate mirror reflection. Thus, this technique allows the examination of tissues at a mesoscopic scale (up to the milimeter scale).

Καθώς η εξέλιξη της βιοϊατρικής επιστήμης και τεχνολογίας είναι συνεχής και ραγδαία, η έρευνα επικεντρώνεται τόσο στη βελτίωση των κλινικών τεχνικών όσο και στην ανάπτυξη νέων με κυριότερο σκοπό την ακριβέστερη και ασφαλέστερη διάγνωση και θεραπεία. Στην παρούσα διπλωματική εργασία, μελετάται η χρήση δύο περιοχών του φάσματος, των μικροκυματικών και των ηχητικών συχνοτήτων για διαγνωστικές λειτουργικές εφαρμογές εγκεφάλου. Παρόλο που η χρήση των υπερήχων έχει αξιοποιηθεί στην κλινική εφαρμογή, οι αναφορές για τη χρήση των ηχητικών κυμάτων στις βιοιατρικές εφαρμογές είναι περιορισμένες στη διεθνή βιβλιογραφία. Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετάται η ανάπτυξη ενός συστήματος για διαγνωστικές εφαρμογές εγκεφάλου στις ηχητικές συχνότητες. Στα δύο πρώτα κεφάλαια περιγράφονται οι βασικές αρχές που διέπουν την επιστήμη του ήχου (ακουστική) αλλά και οι φυσικές αρχές αλληλεπίδρασης των ηχητικών κυμάτων με τους βιολογικούς ιστούς (δημιουργία και εξέλιξη των φυσικών φαινομένων ανάκλασης, διάθλασης, μετάδοσης και απορρόφησης της ηχητικής δέσμης). Πιο συγκεκριμένα μοντελοποιείται και μελετάται θεωρητικά το πρόβλημα της αλληλεπίδρασης των ηχητικών κυμάτων με τον ανθρώπινο εγκέφαλο. Στο τρίτο κεφάλαιο παρατίθεται η θεωρητική ανάλυση και οι βασικές αρχές της προτεινόμενης μεθόδου για μέτρηση της εγκεφαλικής δραστηριότητας στις ηχητικές συχνότητες καθώς και τα βασικά στοιχεία της πρακτικής της υλοποίησης που περιλαμβάνουν ανάλυση του πιεζοηλεκτρικού φαινομένου και των αντίστοιχων μετατροπέων καθώς και το αντίστοιχο σύστημα λήψης ηχητικών σημάτων. Τα μικροκύματα έχουν χρησιμοποιηθεί σε πλήθος διαγνωστικών και θεραπευτικών τεχνικών τόσο σε επίπεδο έρευνας όσο και στην κλινική πράξη. Στην παρούσα εργασία πραγματοποιείται θεωρητική μελέτη δύο πολυσυχνοτικών κυρτών προσαρμόσιμων μικροταινιακών τυπωμένων κεραιών για χρήση τους με συστήματα ευαίσθητων δεκτών μικροκυματικής ραδιομετρίας. Στο κεφάλαιο 4 περιγράφονται η βασική τεχνολογία και οι βασικές αρχές λειτουργίας της παθητικής μεθόδου διάγνωσης με μικροκύματα, της μικροκυματικής ραδιομετρίας. Οι προτεινόμενες κυρτές κεραίες μοντελοποιήθηκαν (κεφάλαιο 5) και μελετήθηκαν με τη βοήθεια του ηλεκτρομαγνητικού προσομοιωτικού λογισμικού πακέτου HFSS που χρησιμοποιεί τη μέθοδο των πεπερασμένων στοιχείων. Παρουσιάζονται αναλυτικά οι ιδιότητες εστίασης των κεραιων αυτών σε δύο διαφορετικά μοντέλα κεφαλιού στος εύρος συχνοτήτων 2 – 3.5 GHz. / As the evolution in the field of biomedical science and technology is continuous, the research focuses mainly on the improvement of existent clinical techniques and the development of new ones, aiming to the most accurate and safe diagnosis and treatment. In the present thesis, the usage of two frequency bands is investigated, the microwave and sound frequencies for diagnostic functional brain applications. Despite the fact that ultrasounds have been utilized in clinical practice, the references regarding the application of sound frequencies in medical diagnosis are restrained in international literature. In the present thesis the development of a system for diagnostic brain applications operating at sound frequencies is studied. In the first two chapters the basic principles of acoustics and the physical principles of the interaction of sound waves with biological tissue (including physical phenomena of reflection, diffraction, transmission and absorption of sound) are described. More specifically, the problem of the interaction of sound waves with the human brain tissues is theoretically modeled and studied. In the third chapter theoretical analysis and basic principles of the suggested method are given together with the basic points of its practical implementation that include analysis of the piezoelectric phenomenon, the respective piezoelectric transducers and sound signal receiver. Microwaves have been used in many diagnostic and therapeutic techniques both at research level and in clinical practice. Herein, a theoretical study of two multi-frequency conformal microstrip patch antennas is performed, in order to use them in conjunction with sensitive microwave radiometry receivers. In chapter 4 the basic technology and the basic operation principles of the passive diagnostic method with microwaves (microwave radiometry) are described. The suggested conformal antennas are modeled (chapter 5) and studied using the electromagnetic simulation tool HFSS that implements the finite element method (FEM). The properties of these antennas and their focusing ability on specific brain areas are presented at 2 – 3.5 GHz in two different head models.

Κατά την επαφή επιφανειών, όπως οι βαλβίδες καρδιάς ή και άλλοι ιστοί, με βιολογικά υγρά, υπό προϋποθέσεις, εναποτίθενται άλατα φωσφορικού ασβεστίου, λόγω του υφιστάμενου υπερκορεσμού με αποτέλεσμα τη μείωση της λειτουργικότητάς τους. Οι αυξημένες περιπτώσεις ασβεστοποίησης αορτικών αλλά και βιοπροσθετικών βαλβίδων καρδιάς, έχει καταστήσει επιτακτική ανάγκη τη μελέτη και τη κατανόηση του μηχανισμού του σχηματισμού των εναποθέσεων. Στην παρούσα διατριβή, έγινε φυσικοχημικός χαρακτηρισμός παθολογικών εναποθέσεων που απομονώθηκαν από ανθρώπινες φυσικές και βιοπροσθετικές βαλβίδες καρδιάς. Ο χαρακτηρισμός έδειξε ότι οι εναποθέσεις αποτελούνται από κρυσταλλικές φάσεις φωσφορικού ασβεστίου. Έγινε ταυτοποίηση της κρυσταλλικής φάσης που είχε εναποτεθεί στις φυσικές και βιοπροσθετικές βαλβίδες ασθενών με χρήση αναλυτικών μεθόδων (XRD, FT-IR, SEM) και συγκρίθηκαν τα αποτελέσματα. Η μορφολογική εξέταση έδειξε κυρίως την παρουσία απατιτικών (υδροξυαπατίτης με υποκαταστάσεις ανθρακικών ιόντων και ιόντων νατρίου) πρισματικών μικροκρυστάλλων. Επίσης, ταυτοποιήθηκε η παρουσία του θερμοδυναμικά ασταθέστερου φωσφορικού οκτασβεστίου (OCP). Η χημική σύσταση των εναποθέσεων στις ασβεστοποιημένες βαλβίδες ασθενών προσδιορίστηκε διαλύοντας συγκεκριμένη ποσότητα στερεού σε διάλυμα HCl 0.1Ν. Έγινε ανάλυση ιόντων ασβεστίου, νατρίου, μαγνησίου με ατομική απορρόφηση και φωσφορικών ιόντων φασματοφωτομετρικά. Οι λόγοι των γραμμομοριακών συγκεντρώσεων Ca/P των στερεών υπολογίστηκαν από τη χημική ανάλυση. Οι γραμμομοριακοί λόγοι των βιοπροσθετικών βαλβίδων βρέθηκαν Ca/P~1.55 ± 0.25, ενώ οι γραμμομοριακοί λόγοι των φυσικών βαλβίδων βρέθηκαν Ca/P ~ 1.80 ± 0.20. Στα πλαίσια της εκπόνησης της παρούσας διατριβής, μελετήθηκε η κινητική της ασβεστοποίησης in vitro σε χοίρειες αορτικές βαλβίδες καρδιάς (γλωχίνες & τοιχώματα) και σε βόειο περικάρδιο. Έγινε μελέτη του σχηματισμού των εναποθέσεων φωσφορικού ασβεστίου σε υπέρκορα διαλύματά του. Όλα τα πειράματα στην παρούσα εργασία έγιναν σε θερμοκρασία 37 οC, pH 7.4 ± 0.1 και ιοντική ισχύ 0.15 Μ ρυθμισμένη με ΝaCl. Για την μέτρηση του ρυθμού κρυσταλλικής ανάπτυξης και άλλων παραμέτρων όπως ο χρόνος επαγωγής, η μορφολογία και η στοιχειομετρική σύσταση των σχηματιζόμενων κρυστάλλων χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος του σταθερού υπερκορεσμού (σταθερή σύσταση υπέρκορων διαλυμάτων). O ρυθμός κρυστάλλωσης του φωσφορικού οκτασβεστίου (Ca4H(PO4)3•2.5H2O, OCP) στις γλωχίνες βρέθηκε ότι ήταν μεγαλύτερος σε σύγκριση με τον αντίστοιχο ρυθμό σχηματισμού του ιδίου άλατος στα αορτικά τοιχώματα και στο βόειο περικάρδιο. Η πρώτης τάξεως εξάρτηση του ρυθμού κρυστάλλωσης από τον σχετικό υπερκορεσμό έδειξε ότι το καθορίζον την ταχύτητα στάδιο είναι η επιφανειακή διάχυση. Η κρυσταλλική φάση που σχηματίσθηκε με ετερογενή πυρηνογένεση στους ιστούς ταυτοποιήθηκε με τη βοήθεια αναλυτικών μεθόδων όπως η περίθλαση ακτίνων Χ (XRD) και η ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM). Η μορφολογική εξέταση των εναποθέσεων στους ιστούς έδειξε τον σχηματισμό πλακoειδών και φυλλόμορφων κρυστάλλων φωσφορικού οκτασβεστίου (OCP) καθώς και πρισματικών μικροκρυστάλλων του θερμοδυναμικά σταθερότερου υδροξυαπατίτη (Ca5(PO4)3OH, HAP), ο σχηματισμός των οποίων αποδόθηκε στην υδρόλυση του OCP. Η σχέση υποστρώματος (ιστών) και της κρυσταλλικής φάσης η οποία κρυσταλλώθηκε στην επιφάνειά τους, διερευνήθηκε και με τη μελέτη του ηλεκτροστατικού δυναμικού των επιφανειών. Οι αντίστοιχες μετρήσεις έγιναν με τη μέθοδο του δυναμικού ροής (streaming potential) σε ειδική κυψελλίδα η οποία κατασκευάσθηκε για τον σκοπό αυτό. Στις μετρήσεις που έγιναν, οι ιστοί, τόσο άνευ αλλά και με εναποθέσεις φωσφορικού ασβεστίου, αποτέλεσαν την σταθερή φάση ενώ κινουμένη φάση ήταν ηλεκτρολυτικό διάλυμα ΚΝΟ3 ή NaCl. Πραγματοποιήθηκαν για πρώτη φορά σε συστήματα αυτού του είδους, μετρήσεις δυναμικού ροής και υπολογίσθηκαν οι τιμές των αντιστοίχων επιφανειακών δυναμικών (δυναμικά ζ) σε ιστούς, προ και μετά την ασβεστοποίησή τους με άλατα του φωσφορικού ασβεστίου. Η αύξηση της ιονικής ισχύος είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του δυναμικού επιφάνειας ιστών που εξετάστηκαν. Το δυναμικό ροής ήταν ανάλογο της εφαρμοζόμενης πίεσης και από τα διαγράμματα δυναμικού ροής-πίεσης συμπεραίνεται ότι η επιφάνεια των ιστών (περικαρδίου και γλωχίνων) έχει αρνητικό επιφανειακό φορτίο ενώ ασβεστοποίηση των ιστών αυτών έδωσε αρνητικότερες τιμές του ζ δυναμικού τους. Με δεδομένο ότι στην τιμή του pH ισορροπίας που έγιναν οι μετρήσεις, τόσο η επιφάνεια του υποστρώματος όσο και η κρυσταλλική φάση έχουν μικρό αρνητικό φορτίο και δεν φαίνεται οι ηλεκτροστατικές δυνάμεις κρυστάλλων-υποστρωμάτων που εξετάσθηκαν να παίζουν σημαντικό ρόλο. Οι μετρήσεις που έγιναν σε υψηλές τιμές της ιοντικής ισχύος, έδειξαν αύξηση του αρνητικού επιφανειακού φορτίου για το σύνθετο υλικό υπόστρωμα-ΗΑΡ. Η συνάφεια υποστρώματος-κρυσταλλικής φάσης είναι πιθανώς δομικής φύσης. Οι συνεχώς αυξανόμενες απαιτήσεις για την παρασκευή βιοϋλικών έχουν ως αποτέλεσμα το συνεχώς αυξανόμενο ενδιαφέρον για τη σύνθεση και τη μελέτη βιοτσιμέντων, στα συστατικά των οποίων περιλαμβάνονται άλατα φωσφορικού ασβεστίου ή και ανθρακικού ασβεστίου. Tα βιοτσιμέντα έχουν πολλαπλές βιο-ιατρικές εφαρμογές λόγω της δυνατότητας απορρόφησης ή και τροποποίησης με την ενσωμάτωσή τους στα οστά. Μεταξύ των κρυσταλλικών φάσεων του φωσφορικού ασβεστίου, η θερμοδυναμικά σταθερότερη είναι ο HAP, ο οποίος είναι βασικό ανόργανο συστατικό των σκληρών ιστών των ανώτερων θηλαστικών και αποτελεί ένα πολύ καλό βιοσυμβατό υλικό. Παρασκευάστηκαν απατιτικά τσιμέντα φωσφορικού ασβεστίου με ανάμειξη α-φωσφορικού τριασβεστίου (α-Ca3(PO4)2, a-TCP) με υδατικό διάλυμα Na¬2HPO4 και μελετήθηκε η κινητική της κρυστάλλωσης ΗΑP στα απατιτικά τσιμέντα σε υπέρκορα διαλύματα φωσφορικού ασβεστίου, σε συνθήκες σταθερού υπερκορεσμού. Έγινε σειρά πειραμάτων στα οποία μετρήθηκε πρώτα η κινητική της κρυστάλλωσης συνθετικών καλά χαρακτηρισμένων κρυσταλλιτών HAP. Η σειρά αυτή των πειραμάτων ήταν το σύστημα αναφοράς. Πρόσθετες σειρές πειραμάτων έγιναν σε υπέρκορα διαλύματα με σύσταση τροποποιημένων προσομοιωμένων βιολογικών ρευστών (mSBF). Ο ρυθμός κρυστάλλωσης HAP σε φύτρα ΗΑΡ σε ηλεκτρολυτικό διάλυμα, ήταν μεγαλύτερος σε σύγκριση με τον αντίστοιχο ρυθμό σε προσομοιωμένο βιολογικό ρευστό (SBF), της αυτής ιοντικής ισχύος και υπερκορεσμού. Η εξάρτηση του ρυθμού κρυστάλλωσης από τον σχετικό υπερκορεσμό, βρέθηκε ότι ήταν πρώτης τάξεως, οδηγώντας και σε αυτή την περίπτωση στο συμπέρασμα, ότι η κρυστάλλωση και στις δύο περιπτώσεις ηλεκτρολυτικών διαλυμάτων γίνεται με μηχανισμό επιφανειακής διάχυσης. Κατά την σπορά των υπέρκορων διαλυμάτων με κρυσταλλίτες των βιοτσιμέντων το συμπέρασμα ως προς τον μηχανισμό κρυσταλλικής ανάπτυξης ήταν το ίδιο. Ο φυσικοχημικός χαρακτηρισμός τόσο των τσιμέντων όσο και της εναποτεθείσας κρυσταλλικής φάσης έγινε με αναλυτικές μεθόδους χαρακτηρισμού στερεών (XRD, FT-IR, SEM). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα τσιμέντα αποτελούνταν κατά κύριο λόγο από απατίτη με ποικίλη μορφολογία. Βρέθηκαν απατιτικοί κρύσταλλοι της τάξης μερικών δεκάδων nm, μεγάλοι πρισματικοί κρύσταλλοι (150-300 nm) καθώς και φυλλόμορφες πλάκες 1-2 μm. Παράλληλα, διερευνήθηκε η επίδραση και άλλων ανόργανων υποστρωμάτων που χρησιμοποιούνται ως βιοϋλικά, όπως είναι τα βιοτσιμέντα τα οποία παρασκευάζονται από μιγμάτα ανθρακικού και φωσφορικού ασβεστίου. Έγινε μελέτη της κινητικής της κρυστάλλωσης φωσφορικού οκτασβεστίου (ΟCP) με τη μέθοδο σταθερού υπερκορεσμού στους 37 oC σε pH 7.40 ± 0.1 και σε ιοντική ισχύ 0.15 Μ NaCl. Για την εκκίνηση της κρυσταλλικής ανάπτυξης σε σταθερά υπέρκορα διαλύματα φωσφορικού ασβεστίου χρησιμοποιήθηκαν το βιοτσιμέντο τύπου Α (μίγμα βατερίτη (CaCO3) και διένυδρου φωσφορικού ασβεστίου (CaHPO4•2H2O, DCPD)), και το βιοτσιμέντο τύπου Β (μίγμα βατερίτη (CaCO3), διένυδρου φωσφορικού ασβεστίου (CaHPO4•2H2O, DCPD) και 20% ανθρακικού στροντίου (SrCO3). Επιπλέον, για τη μελέτη της κινητικής της κρυστάλλωσης χρησιμοποιήθηκαν συνθετικοί κρύσταλλοι υδροξυαπατίτη (HAP) και φωσφορικού οκτασβεστίου (OCP), ως υλικά αναφοράς. Η παρουσία ανθρακικών ιόντων έδειξε πως επηρεάζει το ρυθμό κρυστάλλωσης και από την εξάρτηση του ρυθμού κρυστάλλωσης από τον σχετικό υπερκορεσμό συμπεραίνεται ότι η κρυστάλλωση γίνεται με μηχανισμό επιφανειακής διάχυσης. Η μορφολογική εξέταση στις περιπτώσεις κρυστάλλωσης OCP σε φύτρα κρυστάλλων OCP και βιοτσιμέντων (μίγμα CaCO3 και DCPD) έδειξε φυλλόμορφους σχηματισμούς φωσφορικού οκτασβεστίου (OCP), ενώ πλακοειδείς κρύσταλλοι φωσφορικού οκτασβεστίου (OCP) αναπτύχθηκαν σε φύτρα ΗΑΡ. Η συνάφεια μεταξύ ανθρακικών και φωσφορικών αλάτων του ασβεστίου είναι σημαντική για την κατανόηση της συμπεριφοράς και των ιδιοτήτων νέων βιοϋλικών που βασίζονται σ’αυτά τα υλικά. Έτσι, έγινε διερεύνηση της δυνατότητα χρήσεως διαφόρων πολυμορφικών φάσεων ανθρακικού ασβεστίου (CaCO3) ως βάσεων για την παρασκευή νέων βιοϋλικών. Μελετήθηκε ο ετερογενής σχηματισμός του φωσφορικού οκτασβεστίου (OCP) σε υποστρώματα ανθρακικού ασβεστίου, σε συνθήκες σταθερού υπερκορεσμού στους 37 oC σε pH 7.40 ± 0.1 και σε ιοντική ισχύ 0.15 Μ NaCl, χρησιμοποιώντας ως φύτρα σποράς κρυστάλλους ασβεστίτη καθώς και μίγμα κρυστάλλων αραγωνίτη-ασβεστίτη. H κρυστάλλωση του φωσφορικού οκτασβεστίου έλαβε χώρα μετά την πάροδο χρόνου επαγωγής, τ, στα δυο υποστρώματα CaCO3 που μελετήθηκαν και οι αρχικοί ρυθμοί κρυσταλλικής ανάπτυξης ανά μονάδα επιφάνειας βρέθηκαν ότι ήσαν ανεξάρτητοι της ποσότητας των κρυσταλλικών φύτρων, γεγονός που υποδηλώνει την επιλεκτική πυρηνογένεση του σχηματιζόμενου στερεού (ΟCP) στα υποστρώματα που εξετάσθηκαν (CaCO3). Η μορφολογική εξέταση της σχηματιζόμενης φάσης στα δυο υποστρώματα CaCO3 επιβεβαίωσε τον αποκλειστικό σχηματισμό χαρακτηριστικών φυλλόμορφων κρυσταλλιτών OCP, ενώ ο σταθερότερος θερμοδυναμικά υδροξυαπατίτης (HAP) δε σχηματίστηκε ούτε κατευθείαν, ούτε και μέσω υδρόλυσης του θερμοδυναμικά ασταθέστερου OCP, ο οποίος έδειξε να σταθεροποιείται αναπτυσσόμενος ετερογενώς σε ανθρακικά άλατα του ασβεστίου. Είναι γνωστό, ότι η παρουσία ξένων ουσιών ή ιόντων στα υπέρκορα διαλύματα παίζει σημαντικό ρόλο τόσο στην κινητική σχηματισμού του φωσφορικού ασβεστίου όσο και στα χαρακτηριστικά του κρυσταλλικού στερεού το οποίο αναπτύσσεται. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει ο ρόλος του στροντίου στην κινητική της βιολογικής ασβεστοποίησης, αφού όπως αναφέρεται στη βιβλιογραφία ενισχύει τη βιοενεργότητα και τη βιοσυμβατότητα των βιοϋλικών και μπορεί να βοηθήσει στην αντιμετώπιση της οστεοπόρωσης (π.χ. ρανελικό στρόντιο). Έγινε διερεύνηση της επίδρασης ιόντων στροντίου (Sr2+) στην κινητική κρυσταλλικής ανάπτυξης αλάτων φωσφορικού ασβεστίου σε υποστρώματα συνθετικών κρυστάλλων φωσφορικού οκτασβεστίου (OCP) και υδροξυαπατίτη (HAP) σε υπέρκορα διαλύματα φωσφορικού ασβεστίου. Η παρουσία των ιόντων στροντίου στα υπέρκορα διαλύματα φωσφορικού ασβεστίου έδειξε ότι ενσωματώθηκαν στο κρυσταλλικό πλέγμα τόσο του OCP όσο και του HAP, ενώ κινητικά επιβράδυνε τους ρυθμούς κρυστάλλωσης και των δύο αλάτων. Μεγαλύτερη μείωση του ρυθμού κρυσταλλικής ανάπτυξης μετρήθηκε στην περίπτωση του HAP. Επίσης, παρατηρήθηκαν αλλαγές στη μορφολογία των κρυστάλλων ενώ η παρουσία των ιόντων Sr2+ είχε ως αποτέλεσμα την επιβράδυνση της υδρολυτικής μετατροπής του θερμοδυναμικά ασταθέστερου OCP προς τον θερμοδυναμικά σταθερό HAP. Τέλος, μελετήθηκε η κινητική της διάλυσης των εναποθέσεων φωσφορικού ασβεστίου που απομονώθηκαν από ασβεστοποιημένες φυσικές βαλβίδες ασθενών, αλλά και συνθετικών καλά χαρακτηρισμένων κρυσταλλιτών HAP ως υλικού αναφοράς, σε ακόρεστα διαλύματα. Τα πειράματα έγιναν στους 37 oC, ιοντική ισχύ 0.15 Μ NaCl, σε pH 7.4 ± 0.1 και σε συνθήκες σταθερής ακορεστότητας. Η εξάρτηση του ρυθμού διάλυσης από την σχετική ακορεστότητα των διαλυμάτων εργασίας, η οποία βρέθηκε ότι ήταν δευτέρας τάξεως, έδειξε ότι η διάλυση και στα δύο υποστρώματα ελέγχεται από επιφανειακή διάχυση των δομικών μονάδων. Η διάλυση των παθολογικών εναποθέσεων σε φυσικές βαλβίδες καρδιάς σε συνθήκες σταθερής ακορεστότητας έδωσε σταθερές ταχύτητας σημαντικά μεγαλύτερες σε σύγκριση με τις αντίστοιχες τιμές που ελήφθησαν για συνθετικούς κρυστάλλους ΗΑΡ. Από τη μορφολογική εξέταση τόσο των κρυστάλλων των ασβεστούχων εναποθέσεων όσο και του ΗAP μετά τη διάλυση παρατηρήθηκαν διαφορές μόνο ως προς το μέγεθος των κρυσταλλιτών. Μετά την διάλυση, οι πρισματικοί κρυσταλλίτες του ΗΑΡ είχαν μικρότερο μέγεθος τόσο ως προς το μήκος τους όσο και ως προς το πάχος. / The formation of calcium phosphate deposits upon contact of biological fluids which are supersaturated with respect to a number of calcium phosphate phases, with tissues (e.g. heart valves, artery walls etc) is detrimental to the function of vital organs or of bioprosthetic materials replacing for damaged tissues. Understanding of the mechanisms underlying the formation of the calcium phosphate deposits, adhering tenaciously to functional tissues is of prime importance not only for the amelioration of health but also for the development of efficient and functional biomaterials. Ιn the present work pathological formations of native and bioprosthetic heart valves removed from patients were examined and showed that were consisted of calcium phosphate phases. The calcific deposits formed on native and bioprosthetic heart valves were characterized using solid characterization analytical methods (XRD, FT-IR, SEM) and the results were compared. The morphological examination showed mainly the presence of apatitic (HAP substituted by carbonate and sodium ions) nano-crystals. Τhe presence of the thermodynamically unstable OCP was, also, identified. The chemical composition of calcific deposits was determined by dissolving an amount of solid in solution of HCl 0.1N. The molar Ca/P ratios in the solids were calculated and found to be Ca/P ~ 1.55 ± 0.25 for bioprosthetic heart valves whereas for native heart valves Ca/P ~ 1.80 ± 0.20. This difference may be attributed to the different maturation of the solids in contact with the respective biological fluids. It seems that the longer the exposure of the solids with solutions containing ions which may replace for calcium in the crystal lattice, the higher the respective Ca/P molar ratio. Another purpose of the present work was the investigation of the heterogeneous nucleation of calcium phosphates on heart valve tissues and on synthetic biomaterials. The mechanistic investigation was done through the correlation of the measured rates of crystal growth as a function of the solution supersaturation and in relation with the substrates on which nucleation took place. The kinetics of calcification of porcine aortic valves (leaflets & walls) and bovine pericardium was investigated in vitro. More specifically, the formation of calcium phosphate deposits was studied at 37 0C, pH 7.4 ± 0.1 and ionic strength 0.15 M adjusted with NaCl, from supersaturated solutions. The solution composition was selected to simulate the respective conditions in plasma serum. These conditions were maintained throughout the experiments done in the present work. The kinetic was measured with the method of constant supersaturation. The rate of crystal growth of OCP on heart valve leaflets was higher in comparison with the respective rate on aortic walls and on bovine pericardium. The dependence of the rate of OCP crystal growth on the relative supersaturation was first order, suggesting a surface diffusion controlled process. The crystalline phase formed was characterized by physicοchemical solid characterization methods (XRD, SEM). The mineralogical analysis confirmed the exclusive formation of the transient OCP phase, which was stabilized kinetically because of the maintenance of the solution supersaturation. The morphological examination showed the formation of plate like OCP crystallites (Ca4H(PO4)3•2.5H2O, OCP), which hydrolyzed with time yielding prismatic nano-crystals of the thermodynamically more stable hydroxyapatite (Ca5(PO4)3OH, HAP). Moreover, the effect of the formation of deposits on the tissues investigated on their surface potential was investigated, through measurements of the streaming potential of the surfaces with and without deposits. To our knowledge it is the first time this electrokinetic methodology was applied to investigate mineralized tissues. A home made apparatus was used after the appropriate modifications. A special cell was prepared in which the electrolyte solution was forced to flow over the immobile tissue surface. The surface potentials (zeta potential) of non calcified and calcified tissues were calculated from the electrokinetic measurements. The measurements were conducted over a wide range of concentrations of potassium nitrate (KNO3) and sodium chloride (NaCl) electrolyte solutions. The increase in ionic strength resulted to the decrease in the zeta potential values of the examined tissues. The potential flow was proportional to the applied pressure and from the graph of potential flow as a function of the applied pressure it was concluded that the surfaces of tissues (pericardium and leaflets) were negatively charged. The presence of calcific deposits resulted to more negative values of zeta potential. The fast growing demand for the development of biomaterials has led to increased interest for the development and study of calcium phosphate and/or calcium carbonate biocements. Biocements have multiple bio-medical applications due to their resorbability and/or bioactivity and biocompatibility properties. Among calcium phosphates, the thermodynamically most stable HAP is the major component of hard tissues of higher mammals and an excellent biocompatible material. Apatitic cements of calcium phosphate were prepared by mixing a- tricalcium phosphate (α-Ca3(PO4)2, a-TCP) with aqueous disodium hydrogen phosphate solution (Na¬2HPO4). The kinetics of crystal growth of HAP from calcium phosphate supersaturated solutions on the apatitic cements was investigated at conditions of constant solution supersaturation. Synthetic HAP crystals were used as reference materials. In addition, experiments were carried out in supersaturated solutions of modified simulated body fluid (m-SBF). The crystal growth rate of HAP was found to be higher in the aqueous solutions than in the m-SBF solution. The kinetics measurements showed that in both cases the crystal growth of HAP was a surface diffusion controlled process. The physicochemical characterization of the cements and the crystal growth phase was examined by solid phase characterization methods (XRD, FT-IR, SEM). The morphological examination showed that the cements consisted mainly of apatite with variable morphology. Small apatitic nano-crystals, larger prismatic crystals (150-300 nm) and leaf-like plates 1-2μm. The effect of another type of inorganic substrates, suggested for use as biomaterials was, also, investigated. These included biocements of mixtures of calcium phosphate and calcium carbonate. The investigation of the kinetics of crystal growth of OCP was carried out at conditions of constant solution supersaturation. The crystal growth was initiated by introduction of different types of inoculating solids. Specifically, biocement A refers to a mixture of vaterite (CaCO3) and dicalcium dihydrogen phosphate dihydrate (CaHPO4•2H2O) and biocement B to vaterite (CaCO3), dicalcium dihydrogen phosphate (CaHPO4•2H2O) and 20% of SrCO3 mixture. Synthetic HAP and OCP crystals were used as reference materials. The presence of carbonate ions showed that they had a significant effect on the rate of crystal growth of OCP. From the growth rate dependence on the relative supersaturation, it was concluded that in all cases the mechanism was the same for all substrates and it was surface diffusion controlled. The morphological examination of the deposits on the OCP seed crystals and on biocements showed the formation of the leaf-like OCP crystallites, while plate-like OCP crystals were formed on the HAP seed crystals. The compatibility between minerals like calcium carbonate and calcium phosphate is an issue of key importance for understanding the behavior and properties of implants and for the design of new materials with desired properties. Thus, it was investigated the possibility of using different polymorphs of calcium carbonate (CaCO3) as basis for the development of new biomaterials. The kinetics of heterogeneous nucleation of OCP on calcium carbonate substrates was studied at conditions of constant supersaturation. Stable calcium phosphate solutions, supersaturated with respect to OCP and HAP were inoculated with well characterized calcite seed crystals and mixed aragonite and calcite seed crystals. Past the suspension of the seed crystals in the supersaturated calcium phosphate solutions, OCP crystal growth started past induction time, τ, and the initial crystal growth rates per unit area were found to be independent on the amount of the seeds, suggesting that OCP nucleation occurs selectively on the inoculating solids of CaCO3. The morphological examination of the precipitating phase on both CaCO3 substrates confirmed the exclusive formation of typical leaf-like OCP crystals, while the thermodynamically stable (HAP) did not grow directly on the substrates neither through the hydrolysis of the unstable OCP. The role of strontium on the kinetics of biological calcification is of particular interest, since it is reported in literature that it enhances the bioactivity and biocompatibility of biomaterials and may have a potential use in the treatment of osteoporosis (e.g. strontium ranelate). The effect of the presence of strontium ions in supersaturated calcium phosphate solutions on the rates of crystal growth of OCP and HAP was investigated at constant solution supersaturation, taking care to account only for the dilution of the strontium in the supersaturated solutions. It was found that Sr2+ ions entered the crystal lattice of both HAP and OCP probably substituting for calcium ions. The inhibitory effect of strontium on the crystallization rate of both calcium phosphates was evident, although in the case of OCP inhibition was exhibited a less extent in comparison with HAP. The presence of strontium during the crystal growth of OCP and HAP induced morphology changes and seemed that it retarded the transformation of the unstable OCP into the thermodynamically more stable HAP. Finally, the dissolution kinetics of apatitic deposits from pathological formations on native heart valves removed from patients was investigated in vitro at conditions of constant undersaturation. The dissolution of synthetic HAP was studied as a reference material. The dependence of the dissolution rates on the relative undersaturation of both substrates was second order suggested a surface diffusion controlled process. A marked difference was found however in the rates of dissolution of the two materials tested. The heart valve calcific deposits dissolved with rates 10 fold faster than the corresponding value of the synthetic HAP crystals. Crystallites of smaller size were observed from the morphological examination of both calcific deposits and HAP crystals after dissolution.

Dizertační práce se zabývá věrohodností mechanického testování měkkých biologických tkání a predikčními schopnostmi různých modelů materiálů. Obě oblasti byly zkoumány užitím metody konečných prvků. První část práce je věnována úvodu do problému a popisu měkkých biologických tkání, které s problémem souvisí, a rešerši nynějšího způsobu jejich mechanického testování. Druhá část práce se zabývá hledáním optimálního nastavení experimentálního zařízení za použití počítačového modelování pomocí virtuální simulace mechanických testů. Výsledky analýzy potvrdily, že dvě úzké svorky po délce hrany, stejně jako běžně používané háčky, jsou použitelné pro dvouosé tahové zkoušky různých měkkých tkání za použití čtvercového vzorku. Použití svorek je proto časově úsporná, jednoduchá a spolehlivá alternativa, která není podřadná použití háčků. V práci byla rovněž provedena analýza, jejímž výsledkem jsou doporučení ohledně typu, počtu a velikosti uchycení pro různě velké vzorky. Třetí část práce zkoumá predikční schopnosti modelů materiálů měkkých tkání a závislosti těchto schopností. Lze shrnout, že výsledné mechanické chování proloženého modelu materiálu závisí na počátečních parametrech a že neexistují „ideální“ počáteční parametry při prokládání experimentálních dat. Navzdory absenci „ideálních“ počátečních parametrů je navržen v rámci možností nejefektivnější způsob aproximace experimentálních dat z mnoha jejich souborů. Dále je možné shrnout, že omezení hodnot parametrů modelu při prokládání experimentálních dat ústí v nepředvídatelný vliv na kvalitu aproximace. V závěrečné části práce byl analyzován předpoklad afinní a neafinní deformace modelů materiálů za účelem vysvětlení velkých rozporů mezi výsledky strukturně založených modelů a výsledky dvouosých testů při různých testovacích protokolech. Ačkoli byly zjištěny určité rozdíly mezi výsledky analyzovaných modelů, přece nebyly dostatečně významné, aby vysvětlily výše uvedené velké rozpory. V poslední části práce jsou zmíněny další možné oblasti výzkumu.

<p dir="ltr">Mass spectrometry imaging (MSI) is a powerful technique for visualizing the distribution of molecules within biological samples. Advancements in MSI instrumentation and computational tools have enabled the impactful applications of this technique across various fields including clinical research, drug discovery, forensics, microbiology, and natural products. Nanospray desorption electrospray ionization (nano-DESI), an ambient localized liquid extraction ionization technique, has proven valuable to the MSI community. Nano-DESI has been used for imaging of various molecules in biological samples including drugs, metabolites, lipids, N-linked glycans, and proteins.</p><p dir="ltr">My research has been focused on expanding the sensitivity and specificity of nano-DESI for biomolecular imaging. One of the newly developed methods employs ammonium fluoride NH₄F as a solvent additive to enhance the sensitivity of nano-DESI for the analysis of lipids in negative ionization mode. Secondly, methods were developed for the spatial mapping of isobaric and isomeric species in biological tissues by implementing nano-DESI MSI on a triple quadrupole (QqQ) mass spectrometer. This work used multiple reaction monitoring (MRM) mode of a QqQ with unit mass resolution to separate isobaric lipid species that require high mass resolving power and imaging of isomeric low-abundance species in tissue sections. Next, I demonstrate nano-DESI as a liquid extraction technique for imaging of N-linked glycans within biological tissue sections. Lastly, the spatial distribution of eicosanoids and specialized pro-resolving mediators (SPMs) in a mouse model for acetaminophen-induced liver injury (AILI) provides insights into the inflammation and resolution phases of AILI. Collectively, these developments have advanced the sensitivity, chemical specificity, and molecular coverage of nano-DESI for imaging of different classes of molecules in biological tissues.</p>

[ES] La constante evolución de la tecnología y la búsqueda de nuevas aplicaciones que mejoren la vida de las personas ha llevado a la incorporación de estas tecnologías en el organismo. Las redes inalámbricas de área corporal (WBAN) son un buen ejemplo de esto, que consisten en redes de comunicaciones ubicadas en el propio cuerpo, tanto en la superficie como implantadas en su interior mediante el uso de dispositivos inalámbricos. Estas redes utilizan el cuerpo humano como medio de transmisión, por lo que debe evaluarse la influencia del mismo sobre la propagación. Además, las nuevas generaciones de comunicaciones móviles se están moviendo hacia el uso de frecuencias cada vez más altas, como las ondas milimétricas, que son más sensibles a la presencia de cualquier objeto en el entorno, incluidos los humanos. La investigación y el diseño de antenas y dispositivos que tengan en cuenta el cuerpo humano requiere pruebas en el entorno donde se supone que deben usarse. Los fantomas se convierten en una herramienta para evaluar la transmisión de señales electromagnéticas en un medio equivalente al cuerpo para evitar la experimentación en humanos o animales. Además de eso, se puede estudiar la influencia de estas ondas electromagnéticas sobre los propios tejidos en cuanto a la tasa de absorción específica (SAR). / [CA] L'evolució constant de la tecnologia i la recerca de noves aplicacions que milloren la vida de les persones ha portat a la incorporació d'aquestes tecnologies en l'organisme. Les xarxes sense fils d'àrea corporal (WBAN) són un bon exemple d'açò, que consisteixen en xarxes de comunicacions ubicades al propi cos, tant en la superfície com implantades en el seu interior mitjançant l'ús de dispositius sense fils. Aquestes xarxes empren el cos humà com a medi de transmissió, per la qual cosa se n'ha d'avaluar la influència sobre la propagació. A més, les noves generacions de comunicacions mòbils s'estan movent cap a l'ús de freqüències cada vegada més altes, com les ones mil·limètriques, que són més sensibles a la presència de qualsevol objecte en l'entorn, incloent-hi els humans. La investigació i el disseny d'antenes i dispositius que tinguen en compte el cos humà requereix proves en l'entorn on se suposa que han d'usar-se. Els fantomes esdevenen una eina per a avaluar la transmissió de senyals electromagnètics en un medi equivalent al cos per tal d'evitar l'experimentació en humans o animals. A més d'això, es pot estudiar la influència d'aquestes ones electromagnètiques sobre els teixits mateixos en relació amb la taxa d'absorció específica (SAR). / [EN] The constant evolution of technology and the search for new applications that improve people's lives has led to the arrival of the incorporation of these technologies in the organism. Wireless body area networks (WBANs) are a good example of this, consisting of communications networks located in the body itself, both on the surface and implanted inside it through the use of wireless devices. These networks use the human body as the transmitting medium, so its influence over the propagation has to be assessed. Besides, new generations of mobile communications are moving towards the use of higher frequencies, as the millimetre waves, which are more sensitive to the presence of any object in the environment, including humans. The research and design of antennas and devices that take into account the human body requires testing in the environment where these are supposed to be used. Phantoms become a tool for evaluating the transmission of electromagnetic signals in a body-equivalent medium in order to avoid experimentation on humans or animals. In addition to that, the influence of these electromagnetic waves over the tissues themselves can be studied with regard to the specific absorption rate (SAR). / This thesis has been possible thanks to the funding contribution of the Universitat Polit`ecnica de Val`encia through the PAID-01-16 programme. This work was also supported by the UPV-IIS La Fe programme (STUDER, 2016 and EMOTE, 2017). The research stay was supported by the European Union’s Erasmus+ funding programme under a traineeship grant. / Castelló Palacios, S. (2019). Wideband Electromagnetic Body Phantoms for the Evaluation of Wireless Communications in the Microwave Spectrum [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/132182

L'Elastographie par Résonance Magnétique (ERM) est une technique d'imagerie permettant de caractériser in vivo les propriétés biomécaniques des tissus de façon non invasive. Dans ce contexte, la première partie de cette thèse s'intéresse à comparer les propriétés viscoélastiques obtenues par ERM avec une technique de rhéologie haute-fréquence, pouvant atteindre des fréquences de sollicitation mécanique communes à l'ERM, contrairement à ce qui est classiquement fait dans la littérature. Pour effectuer les mesures ERM, le dispositif d'excitation mécanique et la séquence IRM ont été développés et un algorithme de reconstruction des propriétés viscoélastiques, fondé sur l'inversion de l'équation de Helmholtz, a été implémenté et évalué en simulation. La comparaison ERM/rhéologie a ensuite été effectuée, d'abord sur des fantômes de plastisol présentant différentes propriétés viscoélastiques, puis sur des échantillons de foies bovins. Dans les deux cas, les résultats ont montré un bon accord entre les valeurs obtenues en ERM et celles issues de la rhéologie. Le second volet de ces travaux s'attache à présenter une nouvelle stratégie d'acquisition en ERM. Les séquences d'ERM conventionnelle utilisent des gradients oscillants afin d'encoder la propagation de l'onde. Ces gradients peuvent cependant restreindre les applications, en raison des limitations de leur fréquence de commutation et de leur amplitude maximale. Nous proposons ici d'encoder directement la propagation de l'onde à l'aide d'impulsions RF générées par la théorie du Contrôle Optimal (CO), combinées à un gradient constant. Une première expérience simple de contrôle de la phase par impulsions RF est présentée, consistant à créer des motifs de distribution spatiale de cette phase, en l'absence de propagation d'onde. Puis, des impulsions RF adaptées à l'ERM ont été générées : les images de phase obtenues ont été comparées avec celles acquises par ERM conventionnelle. Les propriétés viscoélastiques reconstruites dans les deux cas sont similaires, validant ainsi cette nouvelle méthode d'acquisition. / Magnetic Resonance Elastography is a non-invasive imaging method enabling in vivo characterization of viscoelastic properties of biological tissues. The first part of this thesis deals with the comparison of viscoelastic properties obtained with MRE and with a high-frequency rheometer having a large excitation frequency range. This large frequency range enables common frequency range to MRE, unlike the comparisons usually performed in the literature. To perform MRE measurements, the excitation device and the MRE sequence were developed and an algorithm reconstructing the viscoelastic properties based on an inversion of Helmholtz equation was implemented and evaluated through simulation. The comparison between MRE/rheology was then performed, first on plastisol phantoms with different viscoelastic properties, and then on bovine liver samples. In both cases, results show a very good agreement between values obtained with MRE and those coming from rheology. The second part of this work presents a new acquisition method for MRE. Conventional MRE sequences use oscillating gradients to encode the wave propagation into the phase image. However, these gradients can restrict MRE applications, as their switching frequencies as well as maximal amplitude are limited. The new acquisition strategy we propose in this thesis encodes the wave propagation directly with RF pulses generated with Optimal Control Theory (OCT), in combination with a constant gradient. An initial experiment of phase control with RF pulses is presented, consisting in creating non-trivial spatial phase patterns in MRI phase images, in the absence of wave propagation. Then, RF pulses adapted to the MRE problem are generated with OCT and phase images obtained with these pulses are compared with conventional MRE acquisitions. Viscoelastic properties reconstructed from these two techniques are similar, validating thus this new acquisition method.

Cette thèse traite des équations de Maxwell en domaine temporel. Le principal objectif est de proposer des méthodes de type éléments finis d'ordre élevé pour les équations de Maxwell et des schémas d'intégration en temps efficaces sur des maillages localement raffinés. Nous considérons des méthodes GDDT (Galerkine Discontinues en Domaine Temporel) s'appuyant sur une interpolation polynomiale d'ordre arbitrairement élevé des composantes du champ électromagnétique. Les méthodes GDDT pour les équations de Maxwell s'appuient le plus souvent sur des schémas d'intégration en temps explicites dont la condition de stabilité peut être très restrictive pour des maillages raffinés. Pour surmonter cette limitation, nous considérons des schémas en temps qui consistent à appliquer un schéma implicite localement, dans les régions raffinées, tout en préservant un schéma explicite sur le reste du maillage. Nous présentons une étude théorique complète et une comparaison de deux méthodes GDDT localement implicites. Des expériences numériques en 2D et 3D illustrent l'utilité des schémas proposés. Le traitement numérique de milieux de propagation complexes est également l'un des objectifs. Nous considérons l'interaction des ondes électromagnétiques avec les tissus biologiques qui est au cœur de nombreuses applications dans le domaine biomédical. La modélisation numérique nécessite alors de résoudre le système de Maxwell avec des modèles appropriés de dispersion. Nous formulons une méthode GDDT localement implicite pour le modèle de Debye et proposons une analyse théorique et numérique complète du schéma. / This work deals with the time-domain formulation of Maxwell's equations. The main objective is to propose high-order finite element type methods for the discretization of Maxwell's equations and efficient time integration methods on locally refined meshes. We consider Discontinuous Galerkin Time-Domain (DGTD) methods relying on an arbitrary high-order polynomial interpolation of the components of the electromagnetic field. Existing DGTD methods for Maxwell's equations often rely on explicit time integration schemes and are constrained by a stability condition that can be very restrictive on highly refined meshes. To overcome this limitation, we consider time integration schemes that consist in applying an implicit scheme locally i.e. in the refined regions of the mesh, while preserving an explicit scheme in the complementary part. We present a full theoretical study and a comparison of two locally implicit DGTD methods. Numerical experiments for 2D and 3D problems illustrate the usefulness of the proposed time integration schemes. The numerical treatment of complex propagation media is also one of the objectives. We consider the interaction of electromagnetic waves with biological tissues that is of interest to applications in biomedical domain. Numerical modeling then requires to solve the system of Maxwell's equations coupled to appropriate models of physical dispersion. We derive a locally implicit DGTD method for the Debye model and we achieve a full theoretical and numerical analysis of the resulting scheme.