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Host-range specificity of a Bacillus thuringiensis (Bt) toxin as analyzed by protein engineering /

Haider, Syed Tanveer, January 1999 (has links)
Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1999. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 105-131).
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Obtenção de bioinseticida a partir de Bacillus thuringiensis var. israelensis e aplicação de bioensaios em culicídeos

Ernandes, Samara [UNESP] 14 June 2004 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2004-06-14Bitstream added on 2014-06-13T20:41:04Z : No. of bitstreams: 1 ernandes_e_dr_araiq.pdf: 1655685 bytes, checksum: 2507651f91c2bddaf96ba3bfc064bf83 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A bactéria Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) gera certas toxinas com ação inseticida que podem ser usadas no controle de doenças transmissíveis através de culicídeos, especialmente o Aedes aegypti, vetor da dengue. Este bioinseticida tem sido produzido através de fermentação submersa e, no Brasil, esta produção tem sido realizada através de pequenos centros de investigação e, mais recentemente, por uma pequena empresa. Para a implementação de um programa de controle de vetores viável através de bioinseticidas, alguns estudos sobre meio de cultura são essenciais para unir eficiência e baixos custos. Assim, tem-se utilizado resíduos ou subprodutos agroindustriais como fontes de nutrientes em meio de cultura. Neste estudo, alguns resíduos e subprodutos tais como água de maceração de milho (“milhocina”), um subproduto do processamento industrial do milho, “manipueira”, um subproduto do processamento da farinha de mandioca e sangue bovino oriundo de abatedouros foram avaliados com o intuito de se verificar a eficiência em processo fermentativo para obtenção de bioinseticidas. O crescimento celular foi avaliado por densidade óptica a 620 nm, a produção de esporo por plaqueamento em ágar nutriente e a CL 50 (Concentração letal média), por bioensaios contra larvas de 4º instar de Ae. aegypti. Foi verificado, em estudos com “manipueira”, que quando este subproduto é utilizado em baixa concentração, há o mesmo ou um melhor efeito do que quando se utiliza em concentração alta. A esterilização parece ser necessária ao processo fermentativo, pois quando se comparam ambos os meios de “manipueira”, um submetido à esterilização e outro sem este processo, o primeiro produziu mais esporos e uma melhor eficiência em bioensaios. Da mesma forma, quando o sangue de bovinos é acrescentado ao meio de “manipueira”, há um aumento... / The bacterium Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) generates certain toxins with pesticid action, which can be used on the control of transmissible diseases by culicides, specially Aedes aegypti, the dengue´s vector. This biopesticide has been produced by submerged fermentation and, in Brazil, this production has been made by very little research centers and, more recently, by a unique small enterprise. For the implementation of a viable vectors control program through bioinsecticides, some studies about culture media are essential in order to join efficiency and low costs. So, agroindustrial wastes or by-products have been utilized as nutrient source for the culture media production. In this study, some wastes and by-products like corn steep liquor (“milhocina”), a corn industrial processing byproduct, “manipueira”, a by-product from cassava flour processing and cattle blood proceeding from slaughterhouses were utilized as substrate in order to verify the efficiency on fermentative process to obtain bioinsecticides. Cellular growth was evaluated by optical density at 620 nm, spore production by pour plate count and LC50 by bioassays against 4th instar larvae. It was verified, in studies with “manipueira”, that a low concentration of this byproduct has the same or better effect compared with high concentrations. The sterilization was a requisite to the fermentative process because when compared both sterilized and no sterilized “manipueira” media, the first yielded more spores and better efficiency in bioassays. Likewise, when cattle blood is added to “manipueira” media, there is an increase on the spores number and effectiveness against Ae. aegypti larvae. It was compared a traditional nitrogen source, peptone, with “manipueira”, with and without salts and glucose, tested separately and joined. In both media, salts had an importance, but the glucose didn´t seem necessary.
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Analise do efeito da radiação de microondas sobre Anagasta Kuhniella Zeller (1879) (Lepidoptera: Pyralidae) e seus dois agentes de controle biologico, Bracon hebertor (Say, 1836) (Hymenoptera: Braconidae) e Bacillus thuringiensis var. kurstaki (H:3a3b)

Fagundes, Giovanna Garcia 03 July 1998 (has links)
Orientador: Mohamed Habib / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-09-11T20:53:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fagundes_GiovannaGarcia_M.pdf: 3683842 bytes, checksum: bb3e2515d24b20fec15523274d67540b (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: O conceito de Manejo Integrado de Pragas (MIP) busca a utilização consciente de métodos de controle ambientalmente seguros e economicamente viáveis. Neste contexto, é de extrema importância o conhecimento das interações entre os agentes de controle a serem empregados, para garantir maior eficiência na implantação de tais programas. Tanto as microondas (300 a 300.000 MHz), como o Bacillus thuringiensis varo kurstaki e o ectoparasitóide Bracon hebetor (Say, 1836) vêm sendo estudados isoladamente como promissores agentes de controle de pragas em produtos armazenados. Este trabalho teve por objetivo analisar as respostas e relações do parasitóide Bracon hebetor, do seu hospedeiro natural, o piralídeo Anagasta kühniella Zeller (1879) e do entomopatógeno, B. thuringiensis varo kurstaki (Sorotipo H­3a:3b) à radiação de Microondas (2.450 MHz). o material entomológico foi coletado em moinho de farinha em Campinas, SP, e utilizado para dar início a criações laboratoriais . As condições adotadas neste trabalho foram de 25 ::!: 2 o C, 60 ::!: 10 % de umidade relativa (UR) e 12 horas de fotoperíodo. Para os biensaios de avaliação da sensibilidade de Bacillus thuringiensis varo Iwrstaki a microondas foram utilizadas amostras do produto Dipel (Abbot @), contendo o complexo esporo - cristal desta bactéria, 16.000 UII mg de virulência, formulação em pó molhável. Todos os bioensaios, envolvendo a utilização de radiação, foram realizados sob a potência máxima de um forno microondas Panasonic NN 7954 8H I K, operando na freqüência de 2.450 MHz. Tanto o piralídeo, como como o parasitóide, apresentaram uma relação positiva entre o aumento do tempo de exposição e a mortalidade, independentemente do estágio de vida avaliado. No caso de esporos de B. thur;ng;ens;s irradiados, esta relação foi visualizada no bioensaio realizado na concentração de 0,2%, a qual é próxima à CLso das larvas de terceiro estádio. Quanto à sensibilidade das diferentes fases de desenvolvimento de Anagasta kühn;ella à microondas observou-se a existência de um gradiente de sensibilidade entre os estágios de desenvolvimento do piralídeo : larvas de último estádio (TELso = 15,63 s) > larvas de terceiro estádio (TELso = 19,34 s) > adultos (TELso = 22,61 s) > ovos (TELso = 121,67 s), provavelmente decorrente de diferenças físico- químicas. Encontrou-se diferenças significativas quanto ao impacto de microondas nos diferentes estágios de desenvolvimento dos ovos de Anagasta kühn;ella (1 e 4 dias de idade) quando usado tempos de exposição subletais (10 e 30 segundos). Os ovos de 4 dias demonstraram ser mais sensíveis à radiação que os de 1 dia de idade. Já no caso das exposições letais (45, 60 e 90 segundos) não houve indício de diferenças nas duas etapas de desenvolvimento embrionário. As larvas que eclodiram dos ovos tratados com radiação não portavam nenhum tipo de alteração morfológica. Quanto à interferência do meio no impacto causado em larvas de último estádio por exposição à radiação não se constatou diferença significativa entre as larvas expostas diretamente (TELso = 15,63 s) e em meio de farinha de trigo integral (TELso = 16,28 s). A sintomatologia apresentada após o tratamento com radiação variou em função do tempo de exposição. Observou-se desde letargia, desfunção do sistema locomotor até dessecamento, escurecimento do tegumento e morte. A análise da influência da radiação na capacidade reprodutiva e na longevidade de adultos do piralídeo sobreviventes à exposição indicou que as microondas provocam alterações negativas em ambos os casos. Entretanto, a radiação não influiu na viabilidade dos ovos colocados pelas fêmeas tratadas. Os adultos de Bracon hebetor demonstraram um nível de tolerância à radiação de microondas bem maior (TELso = 106,57 s) que as larvas (TELso = 15,63 s) e adultos (TELso = 22,61 s) do seu piralídeo hospedeiro, Anagasta kühniella, enquanto as larvas do braconídeo (TELso = 20,31 s) aparentemente apresentam o mesmo nível de sensibilidade do píralídeo praga. A exposição do produto à base de Bacillus thuringiensis varo kurstaki à radiação de microondas, nas concentrações letais (2,6%) e sub-Ietais (0,02%) não influiu no seu potencial patogênico. Entretanto, na concentração próxima à letal mediana (CLso) observou-se que o aumento do tempo de exposição à radiação diminuiu a patogenicidade da bactéria. Sendo assim, a radiação de microondas apresentou-se como um método de controle bastante promissor para Anagasta kühniella criada em farinha de trigo integral. Pode ser empregado em ecossistemas de armazemagem deste produto em associação ao ectoparasitóide Bracon hebetor e ao Bacillus thuringiensis varo kurstaki / Abstract: The application of Integrated Pest Management (IPM) means the utilization of efficient control methods which are ecologically safe and economicaly viable. Therefore, it is extremaly important to gather more information about the possible interactions between the different control agents, aimimg to optimize such a method. Microwaves (300 a 300.000 MHz), as well as Bacillus thuringiensis and the ectoparasitoid Bracon hebetor (Say, 1836) are being studied individually by some institutions, as promissing control agents of some stored product pests. The present work was developed to study and evaluate the relations among the parasite Bracon hebetor, his natural host, Anagasta kühniella Zeller (1879), the entomopathogen Bacillus thuringiensis' varo kurstaki (H- 3a:3b) and microwaves radiation. The mother culture of the pyralid and braconid species were initiated from live material collected from flour mills in Campinas municipality, state of São Paulo. The cultures were maintained and experiments were realized under controlled laboratory condítions of 25 :t 2° C, 60 :t 10 % R.H. and 12 hours of photoperiod. To evaluate the tolerance of B. thuringiensis to microwave radiation samples of the commercial product Dipel (Abbot) were utilized. This product contains 16,000 IUI mg and formulated as a wettable powder. The radiation treatments were undertaken utilizing the maximum potency of a domestic Panasonic microwave oven (NN 7954 BH/K, 2450 MHz). The mortality rate among the different developmental stages of the two insect species was observed to be positively related with the radiation exposure time. Among the Anagasta kühniella developmental stages, while the last instar larvae showed to be more sensitive to radiation (median letal exposure time, LET 50 = 15,63 s), the egg stage showed to be more resistant (LETso= 121,67 s). The third instar larvae, as well the adult stage, revealed a moderate sensitivity (LETso= 19,34 s and 22,61 s, respectively). Within the egg stage of Anagasta kühniella the full grow embryo showed to be more sensitive than newly deposited eggs. The impact of the direct exposition to microwaves on the full grow Anagasta kühniella larvae (LET so= 15,63 s) did not differ when compared with those larvae imbeded in their natural diet, whole wheat flour (LETso = 16,28 s). The sequence and intensity of the external symptoms, showed to be directly related to the duration time in which larvae of Anagasta kühniella were exposed to the microwave radiation. Letargy and locomotion desfunctions were the initial alterations. Dehydration and body wall darkening , reaching dark brown, were observed before death. The radiation also showed to be harmful to the adult stage of the same pyralidae species, reducing longevity as well as reproductive capacity. Bracon hebetor adults showed to be more resistant to radiation (LETso ::: 106,57 s) when compared to Anagasta kühniella adults (LETso = 22,61 s) and larvae (LET50 = 15,63 s). Samples of Bacillus thuringiensis var kurstaki were exposed to different times of microwaves radiation (2450 MHz) and were ofered to third instar larvae of Anagasta kühniella in three different concentrations (0.02 %, 0.2% and 2.6%). This electromagnetic wave did not present any interference in the patogenicity of the entomopathogen in the extrem concentrations (0.02 and 2.6%). However, in the 0.2% concentration, next to LCso of the larvae, the patogenicity of Bacillus thuringiensis was altered by the time of exposure to the radiation. Finally, radiation by microwaves could be considered as a promissing method, efficient and compatible with biological control ones, to participate in IPM programs of the Mediterranean Flour Moth, Anagasta kühniella / Mestrado / Parasitologia / Mestre em Ciências Biológicas
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The expression of Bt Cry1Ac in transformed cotton under abiotic stress

Martins, Celia Marilia. January 2006 (has links)
Thesis (M.Sc.(Plant Pathology))--University of Pretoria, 2006. / Includes bibliographical references. Available on the Internet via the World Wide Web.
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Estudos da utilização de sangue de abatedouros como substrato fermentativo para produção de Bacillus thuringiensis por fermentação submersa

Ernandes, Samara [UNESP] January 1998 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 1998Bitstream added on 2014-06-13T20:50:02Z : No. of bitstreams: 1 ernandes_s_me_araiq.pdf: 3011608 bytes, checksum: 7296c8f780cd8e98400ae8e9f3ecfc09 (MD5) / Not available
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Expressão de GFP em Bacillus thuringiensis S76 uma estirpe selvagem ativa para Lepidoptera

Parente, Ana Flávia Alves 11 1900 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2009-12-01T17:24:45Z No. of bitstreams: 1 2007_AnaFlaviaAlvesParente.pdf: 2148290 bytes, checksum: 127fe8fbcd02590fb2f21a2a1e84641d (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2009-12-01T23:35:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_AnaFlaviaAlvesParente.pdf: 2148290 bytes, checksum: 127fe8fbcd02590fb2f21a2a1e84641d (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-01T23:35:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_AnaFlaviaAlvesParente.pdf: 2148290 bytes, checksum: 127fe8fbcd02590fb2f21a2a1e84641d (MD5) Previous issue date: 2007-11 / B. thuringiensis é um importante entomopatógeno amplamente estudado e empregado como agente de controle biológico, ainda assim, a ecologia desse microrganismo é pouco explorada. Apesar da crescente utilização na agricultura desse agente, as interações com plantas são pouco conhecidas. Com o intuito de construir uma ferramenta eficaz para o rastreamento dessa bactéria, foi desenvolvida a estirpe S76GFP+ a partir de uma estirpe brasileira selvagem de B. thuringiensis. O vetor de expressão pAD43-25 contendo o gene gfpmut3a funcional, além do vetor parental, pAD123, contendo o mesmo gene, porém sem promotor foram transferidos para a estirpe S76, permitindo no primeiro caso a expressão constitutiva do gene durante o crescimento vegetativo. Adicionalmente, como controle, ambos vetores foram transferidos para uma estirpe acristalífera (Cry-). Células verdes brilhantes foram detectadas por microscopia de fluorescência, em ambas hospedeiras transformadas com o vetor pAD43-25, a partir de duas horas após a inoculação em meio líquido e que puderam ser observadas pelo restante do tempo de cultivo até o fim da esporulação. A estirpe S76GFP+ apresentou um discreto acréscimo no tempo de geração, embora não tenham sido observadas alterações morfológicas das colônias e células. Análises dos perfis protéico e plasmidial indicaram, respectivamente, a manutenção da expressão das proteínas Cry e do elenco dos plasmídeos residentes. Do nosso conhecimento, não apenas é o primeiro relato de visualização da emissão de fluorescência pela expressão de GFP em B. thuringiensis. Igualmente, é o primeiro relato de expressão de GFP em uma estirpe de B. thuringiensis selvagem. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Although extensively studied by its recognized potential as bioinseticide, B. thuringiensis ecology is poorly understood, and despite its increasing use, little is known regarding interactions between this microorganism and plants. Thus, a tractable marker for detection of this bacterium under specific environment and physiological conditions is a valuable tool. A plasmid (pAD43-25) bearing a functional gfp gene and the parental vector, bearing the promotorless gfp gene, were introduced in the Brazilian wild-type strain B. thuringiensis kurstaki S76, allowing, in the first case, the constitutive synthesis of GFP during vegetative growth. Additionally, both vectors were transferred to a Cry- B. thuringiensis host. Green bright cells could be detected, by fluorescence microscopy and in both hosts, since 2h after inoculation in liquid medium and could be seen throughout remaining cultivation time, until complete sporulation was accomplished. Strain S76GFP+ seems to grow slower than the remaining recombinants and parental cells, whereas no perceptible change in cell or colony morphologies was observed. Protein profile and plasmidial DNA analyses indicate, respectively, that this recombinant maintained Cry proteins expression and resident plasmid outline. To our knowledge, it is the first time fluorescence is detected in a B. thuringiensis strain, as well as, that GFP is expressed in a wild-type B. thuringiensis.
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Estirpes de Bacillus thuringiensis como promotoras de crescimento vegetal e no controle de pragas em diferentes culturas

Vaz, Luiza Arlete 13 June 2014 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-10-09T12:52:48Z No. of bitstreams: 1 2014_LuizaArleteVaz.pdf: 988616 bytes, checksum: f6befd6a494149874602850a3c353110 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-10-09T13:26:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_LuizaArleteVaz.pdf: 988616 bytes, checksum: f6befd6a494149874602850a3c353110 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:26:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_LuizaArleteVaz.pdf: 988616 bytes, checksum: f6befd6a494149874602850a3c353110 (MD5) / A produção agrícola pode ser influenciada por microrganismos endofíticos de diferentes maneiras, tanto pela produção de substâncias promotoras de crescimento vegetal, quanto pelo controle de pragas e doenças. Foram realizados ensaios de promoção de crescimento em casa de vegetação, utilizando as estirpes S1450, S1905, S2122 e S2124 de B. thuringiensis, tóxicas a insetos da Ordem Lepidóptera, cinco espécies vegetais (algodão, arroz, milho, repolho e soja) e dois métodos de inoculação (imersão de sementes e inoculação planta), utilizando uma concentração de 107 esporos.mL-1. Inicialmente, foram avaliados os parâmetros: Índice de Velocidade de Germinação (IVG), altura de plantas e número de folhas. Após 45 dias, as plantas foram avaliadas quanto ao comprimento da raiz, peso seco da raiz e peso seco da parte aérea e, também, a mortalidade das lagartas de S. frugiperda, P. xylostella e A. gemmatalis alimentadas com folhas das plantas utilizadas nos ensaios. Nos ensaios, foi possível observar que o método de inoculação mais eficiente na promoção de crescimento para todas as espécies testadas foi o imersão de sementes e com efeitos diferenciados em função da espécie de planta e da estirpe, com destaque para a estirpe S1905. Nos bioensaios com algodão, repolho e soja, em todos os tratamentos foi verificada uma baixa mortalidade das lagartas de S. frugiperda, P. xylostella e A. gemmatalis, possivelmente isso ocorreu em função da baixa concentração da bactéria na planta, o que não foi suficiente para causar mortalidade das lagartas. __________________________________________________________________________ ABSTRACT / Agricultural production can be influenced by endophytic microorganisms in different ways, either by the production of plant growth promoting substances, as for the control of pests and diseases. Trials to promote growth in the greenhouse were performed using the S1450, S1905, S2122 and S2124 B. thuringiensis toxic to insects of the Order Lepidoptera strains, five plant species (cotton, rice, corn, cabbage and soybeans) and two inoculation methods (immersing seeds and plant inoculation) using a concentration of 107 esporos.mL-1. Initially, the parameters were evaluated: Germination Speed Index (GSI), plant height and number of leaves. After 45 days, the plants were evaluated for root length, root dry weight and dry weight of shoots and also the mortality of S. frugiperda, P. xylostella and A. gemmatalis fed leaves of the plants used the tests. In trials, it was observed that the most efficient method of inoculation in promoting growth for all species tested was the soaking of seeds and adjusted according to the plant species and strain, especially the S1905 strain effects. In bioassays with cotton, cabbage and soybeans in all treatments was observed a low mortality of S. frugiperda, P. xylostella and A. gemmatalis, possibly this was due to the low concentration of bacteria in the plant, which was not enough to cause mortality of caterpillars.
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Modelagem molecular das δ-endotoxinas do Bacillus thuringiensis

Lucena, Wagner Alexandre January 2012 (has links)
Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria Gram-positiva entomotóxica usada no controle de insetos-praga e vetores de doenças há mais de 60 anos. Desde a introdução das plantas cultivadas expressando genes de Bt, ficou demonstrado que cultivares-Bt constituem uma importante ferramenta no aumento da produtividade e diminuição no uso de pesticidas químicos. O sucesso do Bt advém da produção das δ-endotoxinas (Cry). Estas toxinas compartilham um mecanismo de ação semelhante, com pelo menos, alguns aspectos em comum. A atividade das Cry é baseada nas clivagens N e C-terminais, ligação a receptores (i.e. caderinas) e mudanças conformacionais. O objetivo deste trabalho foi estudar aspectos estruturais das δ-endotoxinas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry3Aa, Cry8Ea1, Cry8Ka1, Cry8Ka5 e Cry1Ia12 usando ferramentas de modelagem molecular por homologia, dinâmica molecular (DM) e docking molecular. Oito toxinas Cry e duas caderinas (CAD) foram modeladas. Quatro toxinas (Cry1Aa, Cry1Ac, Cry3Aa e Cry8Ea1) foram usadas para construir 8 sistemas que foram submetidos a simulações de DM de 50 ns utilizando o pacote GROMACS e o campo de força GROMOS96 43a1. As Cry8Ka1, Cry8Ka5, Cry1Ia12 e suas 3 variantes foram comparadas a fim de estabelecer as relações entre as diferenças estruturais e as mudanças na toxicidade. As caderinas, Cry1Ab e Cry1Ac foram usadas nos cálculos de docking molecular. Os resíduos das Cry1A com RMSF alto são os mesmos identificados experimentalmente como sítios de reconhecimento/ligação aos receptores ou desempenham um papel na dinâmica de interação. Os dados mostraram que as flexibilidades global e local das Cry estudadas aumentaram nos sistemas sem a α-1 e isto pode estar relacionado com o mecanismo de ação. Este efeito se propaga por toda a superfície a não apenas na porção N-terminal, sugerindo o início de um processo de transição conformacional. Na Cry1Ac, a ausência da α-1 promove alterações estruturais na alça 2 (ligação a receptores GPI). Algumas mutações das Cry8Ka e Cry1Ia12 estão próximas dos sítios de ligação e podem estar contribuindo para as alterações nas toxicidades. Os mapas de interfaces resultantes dos dockings moleculares corresponderam aos dados experimentais. Neste trabalho foi possível observar novos aspectos do mecanismo de ação das toxinas Cry e suas interações com caderinas. / Bacillus thuringiensis (Bt) is a Gram-positive entomotoxic bacterium widely used to control crop pests and disease vectors. Since the introduction of transgenic plants expressing Bt genes, it has been demonstrated that Bt-crops constitute an important tool in the increase of productivity and in the decrease of the use of chemical pesticides. Its success comes from the production of the δ-endotoxins (Cry). These toxins share a molecular mechanism of similar action or, at least, some common aspects. Activity of Cry proteins is due to N- or C-terminal cleavages, binding to at least one membrane receptor (e.g. cadherins) and conformational changes. The aim of this work was to study structural aspects of Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry3Aa, Cry8Ea1, Cry8Ka1, Cry8Ka5 and Cry1Ia12 δ-endotoxins, using homology modeling, molecular dynamics (MD) and molecular docking. Eight Cry toxins and two cadherins (CAD) were modeled. Four toxins (Cry1Aa, Cry1Ac, Cry3Aa and Cry8Ea1) were used to construct eight systems (whole Cry toxins and α-1 removed proteins (Δα1)). Cry8Ka1, Cry8Ka5, Cry1Ia12 and their three variants were compared to analyze the contributions of each mutation. The cadherins and Cry1Ab and Cry1Ac were used on docking calculations. The Cry1A residues with high flexibility are the same identified as recognition/binding sites (apex of domain II and domain-II/IIIinterface) or to play a role on its dynamic. The data show that the global and local flexibilities of Cry toxins studied was increased by helix α-1withdrawal (Δα1) and it is closely related with the mode of action. This effect propagates on the surface and not only on the N-termini suggesting a complex process of conformational transition. Regarding Cry1Ac, the absence of helix α-1 triggers structural changes on loop2, which is related to binding GPI-receptors. Some Cry8Ka5 and Cry1Ia12 mutations are in the neighborhood of receptor-binding sites and this fact may imply alterations on binding affinity. It was possible to obtain a map of Cry/CAD interface by docking studies. Therefore, this work was able to obtain molecular level insights into the Cry activation mechanism and its interaction with CAD.
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Modelos caracterizando a interação entre as toxinas da família Cry1A de Bacillus thuringiensis e o receptor BT-R1 de Manduca sexta

Sá, Diogo Martins de 31 March 2015 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-03-02T13:00:39Z No. of bitstreams: 1 2015_DiogoMartinsdeSá.pdf: 8864026 bytes, checksum: 31e06adc819c9c1f38cd303d53cd3d41 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-03-02T20:41:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_DiogoMartinsdeSá.pdf: 8864026 bytes, checksum: 31e06adc819c9c1f38cd303d53cd3d41 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-02T20:41:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_DiogoMartinsdeSá.pdf: 8864026 bytes, checksum: 31e06adc819c9c1f38cd303d53cd3d41 (MD5) / O Bacillus thuringiensis é uma bactéria gram positiva pertencente ao grupo Bacillus cereus, mas se distingue de outras espécies deste grupo por produzir, durante a esporulação, inclusões cristalinas contendo predominantemente uma ou mais proteínas de ação inseticida (toxinas Cry e Cyt), também chamadas de δ-endotoxinas. Por definição, toxinas Cry exibem toxicidade experimentalmente verificável a um organismo alvo, ou possuem similaridade significativa de sequencia à uma toxina Cry já descrita. A toxicidade de Cry1Ab é amplamente relatada para larvas da mariposa Manduca sexta e estudos indicam que o domínio II é responsável pelo reconhecimento específico dessa toxina ao receptor no intestino do inseto. Cry1Aa, Cry1Ab e Cry1Ac possuem 82 a 90% de identidade de resíduos de aminoácidos e a interação dessas proteínas com receptores primários do tipo caderina é descrita como um importante passo para a correta remoção da α-hélice 1 no domínio I e subsequente desencadeamento de eventos que levam à morte do inseto. Usando-se de modelagem por homologia e docking molecular, foram selecionados dois modelos descrevendo as interações entre o receptor de M. sexta, BT-R1, e a toxina Cry1Ab. Estes modelos foram submetidos à simulações por dinâmica molecular clássica e avaliados quanto a diversos aspectos de sua estrutura. Um total de 12 blocos de interação foram identificados para cada proteína e estudados quanto às suas propriedade biofísicas, cada qual constituído por uma região da sequência de aminoácidos de suas respectivas proteínas. As medidas de RMSD ao fim da dinâmica mostraram que os sítios de ligação ao receptor apresentam deformações menores que próprio receptor, indicando que a ligação à Cry1Ab estabiliza estas regiões. Mais que isso, os termos intermoleculares de energia de curta distância mostraram um declínio contínuo e uma tendência de atração entre as duas proteínas. Todas as ligações de hidrogênio e pontes salinas foram mapeadas e caracterizadas de acordo com sua persistência e distância média durante a dinâmica. Por último, foi avaliado o potencial eletrostático de cada bloco de interação, o que permitiu inferir as regiões que direcionam a ligação específica da toxina ao receptor. Para validar os modelos, foram sintetizados peptídeos correspondendo a cada bloco de interação para uma análise qualitativa utilizando ressonância plasmônica de superfície (SPR). Resultados preliminares de um dos modelos mostram que o loop 3, notório por sua função no reconhecimento ao receptor, é capaz de ligar-se a uma região nunca antes relatada dos receptores tipo caderina. Essa nova região possui um perfil de hidropaticidade similar ao do epitopo de um anticorpo específico ao loop 3 e, quando comparamos medidas entre pH 7,4 e pH 9,0 em experimentos de SPR, é possível observar uma ligação de mesma intensidade entre essas duas regiões usando-se 266 vezes menos concentração de analito em pH básico. O pH fisiológico do intestino de M. sexta é aproximadamente 9,0, o que indica que um dos modelos é capaz de reproduzir aspectos da interação in vivo. O prosseguimento deste trabalho, através de técnicas in silico e experimentos in vitro, deve indicar se ambos modelos são plausíveis de ocorrer, ou se um dos modelos é preterido. No geral, esses modelos permitiram observar o comportamento da toxina enquanto ligada ao receptor e contribuem para o entendimento de muitos dos experimentos in vitro realizados envolvendo as toxinas da família Cry1A e os receptores tipo caderina. / Cry1Ab is widely described as toxic to Manduca sexta larvae and extensive substitution of loop residues in domain II suggests that this region is responsible for specific binding to receptor. Cry1Aa, Cry1Ab, and Cry1Ac share 82 to 90% amino acid residue identity to one another and their interaction with cadherin-like receptors has been described as an important step for the correct removal of alpha-helix1 in domain I and subsequent events leading to the insect's death. After homology modeling and a selective protein docking, two models describing the interactions of Cry1Ab to the M. sexta cadherin-like receptor, BT-R1, were assessed using molecular dynamics simulations. A total of 12 binding regions were identified for each protein and their biophysical properties were further evaluated. Binding sites in the receptor were shown to have lower RMSD measures than the entire receptor, indicating that the binding of Cry1Ab stabilizes these regions. Also, Van der Waals and Coulomb short-range energy terms were measured for the receptor-toxin complex and showed an attraction tendency, with decreasing energy throughout the entire simulation. All intermolecular hydrogen bonds and salt bridges were identified and characterized according to persistence of existence and mean distances, respectively, as well as their participating residues. Lastly, electrostatic potential for each binding site was assessed, permitting to infer regions that guide specific binding of toxin to receptor. To further investigate the importance of each binding region and validate our model, we synthesized peptides corresponding to each of these regions. Result for one model show that loop 3, notorious for receptor recognition, binds a region previously unidentified in Manduca sexta cadherin-like receptor. This new toxin binding region shows the same hydropathicity profile of an antibody epitope previously described to bind specifically to loop 3. Most interestingly, binding occurs with over 266-fold less peptide concentration in pH 9.0 than in pH 7.4. The physiological pH in the insect midgut is approximately 9.0, which corroborates that at least one of the models reproduces in-vivo interaction. Ongoing work will show if both models are plausible to occur, or if one of them is preferable to the other. Overall, these models allowed the observation of the toxin's behavior when binding to BT-R1 and have helped explain many in vitro experiments concerning Cry1A and cadherin-like receptors.
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Avaliação da bioatividade de bactérias entomopatogênicas sobre o desenvovimento pós-embrionário de Musca domestica (Linnaeus, 1758) (Diptera: Muscidae), em condições de laboratório

Ferreira, Vítor dos Santos Baía January 2015 (has links)
Made available in DSpace on 2016-03-28T12:45:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 vitor_ferreira_ioc_mest_2015.pdf: 1647160 bytes, checksum: 772b0b0b513c782442c3b14ee0949075 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-03-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Musca domestica é um díptero que apresenta sérios riscos à saúde pública e ambiental. Essa espécie transmite diversos patógenos, é causadora de miíases em humanos e animais além de causar prejuízos econômicos. O uso de inseticidas químicos causa danos ambientais e possui eficácia questionável em M. domestica. Inseticidas biológicos de origem bacteriana apresentam uma boa alternativa aos inseticidas químicos em relação aos impactos ambientais, as espécies Brevibacillus laterosporus, Bacillus thuringiensis e Lysinibacillus sphaericus demonstram ação inseticida em diversas ordens de insetos e podem apresentar atividade inseticida efetiva em M. domestica. Nove estirpes de bactérias foram testadas em M. domestica e destas três estirpes: BL102, BTI193A e BTK176 apresentaram valores de mortalidade maiores que 50% e por isso tiveram os efeitos subletais investigados. Em relação a massa das pupas, nenhuma das estirpes apresentou variação significativa na média da massa pupal, quando comparadas às médias dos controles puro e água O período de desenvolvimento também não se diferenciou de forma estatisticamente relevante dos dois controles em nenhum tratamento. As três estirpes testadas apresentaram mortalidade estatisticamente superior às mortalidades dos dois controles com LC50 nas concentrações de 12.40x108 UFC/mL para BTI193, 4.76x108 UFC/mL para BTK176 e 4.16x108 UFC/mL para BL102. As micrografias de transmissão demonstraram que todas as estirpes apresentam o perfil de danos celulares já descritos para essas espécies de bactérias entomopatogênicas, como elevada vacuolização do citoplasma, além de desorganização das organelas celulares, porém somente as estirpes de B. thuringiensis apresentaram deformação e interrupção das microvilosidades e conteúdo citoplasmático extravasado para o lúmen intestinal. Os resultados obtidos com de B. laterosporus e B. thuringiensis sugerem que essas estirpes são um agentes de controle biológico promissores para M. domestica Abstract: Musca domestica is a dipteran who presentes a serious risk to public and environmental health. This species carries diseases, causes myiasis in humans and animals and may cause economic losses. The use of chemical insecticides, beyond causing environmental damage, have questionable efficacy in M. domestica. Biologic insecticides of bacterial origin presents a good choice over chemical insecticides regarding environmental impact. Brevibacillus laterosporus, Bacillus thuringiensis and Lysinibacillus sphaericus species show insecticide action in several insect orders and may presente insecticide effectiveness in M. domestica. Nine strains of bacteria were tested for mortality where three strains: BL102, BTI193 and BTK176 showed values above 50%. These strains were submitted to sub lethal effects experiments. In relation to pupal weight, none of the strains showed statistical variation when compared to pure and water controls Development time was statistically undifferentiated from both controls in every treatment tested. All the tested strains showed statistically higher mortality when compared to both controls, showing LC50 concentrations of 12.40x108 CFU/mL for BTI193, 4.76x108 CFU/mL for BTK176 and 4.16x108 CFU/mL for BL102. Transmission micrographs showed that every strain presented cell damage profile established for these species of entomopathogenic bacteria, such as the high level of cytoplasm vacuolization and disorganization of cell organelles, however, only B. thuringiensis strains showed microvilli deformation and disruption and cytoplasmic content extruded into intestinal lumen. All these observations suggest that tested B. laterosporus and B. thuringiensis strains are promising agents to the biological control of M. domestica / Musca domestica is a dipteran who presentes a serious risk to public and environmental health. This species carries diseases, causes myiasis in humans and animals and may cause economic losses. The use of chemical insecticides, beyond causing environmental damage, have questionable efficacy in M. domestica . Biologic insecticides of bacterial origin presents a good choice over chemical insecticides regarding environmental impact . Brevibacillus laterosporus , Bacillus thuringiensis and Ly sinibacillus sphaericus species show insecticide action in several insect orders and may presente insecticide effectiveness in M. domestica . Nine strains of bacteria were tested for mortality where three strains: BL102, BTI193 and BTK176 showed values above 50% . These strains were submitted to sub lethal effects experiments . In relation to pupal weight , none of the strains showed statis ti cal variation when compared to pure and water controls. Development time was statis ti cally undifferentiated from bot h cont rols in every treatment tested. All the tested strains showed statis ti cally higher mortality when compared to both controls, showing LC50 concentrations of 12.40 x 10 8 CFU /mL for BTI193, 4.76 x 10 8 CFU /mL for BTK176 and 4.16 x 10 8 CFU /mL for BL102. Transmission microg raphs s howed that every strain presented cell damage profile established for these species of entomopathogenic bacteria, such as the high level of cytoplasm vacuolization and dis organization of ce ll organelles, however, only B. thurin giensis strains showed microvilli deformation and disruption and cytoplasmic content extruded into intestinal lumen. All these observations suggest that tested B. laterosporus and B. thuringiensis strain s are promising agent s to the biological control of M. domestica

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