In recent years, the gram positive rods have been reported with an increasing frequency as nosocomial pathogens. The recognition those microorganisms as etiological agents of serious infections, such as bacterial sepsis, endocarditis, and catheter infections, have increased, especially in imunocompromised patients. Treatment of these infections has been problematic because the increase in resistance to antibiotics. Graves and sometimes fatal clinical outcomes due to combination of clinical and microbiologic difficulties, including an inappropriate therapy, the difficulty in identifying these organism and failure to recognize their significance, have been reported. Identification of gram positive rods often causes problems. The aim of this study was to propose the serial biochemical probes to identify in comparison with the trade system API Coryne and determine the antimicrobial susceptibility of Gram positive rods isolated from different clinical specimens of patients from the University of Santa Maria Hospital. Between January and December 2005, 50 Gram positive rods strains were isolated. The organisms were identified by conventional biochemical tests and the antimicrobial susceptibility testing was performed by disk-diffusion. Blood-culture 72% (n=36) was the most frequent source. The more prevalent microorganisms were coryneforms 48% (n=24) and Bacillus species, 44% (n=22). Antibiotic susceptibility tests showed good sensibility to vancomycin, linezolid, ciprofloxacin, imipenem and meropenem. However, 6% (n=3) of microorganisms isolated were multi-drug-resistant, included vancomycin, confirmed by the E-test. In our study we demonstrated the efficiency of the suggest battery, with similar efficacy as trade system, as a tool to identification of aerobic gram positive rod isolated from clinical sources. / Os bacilos Gram positivos, nos últimos anos, têm sido relatados com crescente freqüência como patógenos nosocomiais. O seu reconhecimento como agentes etiológicos de infecções sérias, tais como, sepsis bacteriana, endocardite e infecções em cateteres têm aumentado principalmente em pacientes imunocomprometidos. O tratamento destas infecções tornou-se problemático devido à elevação de sua resistência frente aos antibióticos comercialmente disponíveis. Graves e às vezes fatais conseqüências ocorrem devido à combinação de dificuldades clínicas e microbiológicas, incluindo falha na identificação, reconhecimento de sua importância e terapia inapropriada. A identificação dos bacilos Gram positivos freqüentemente causa problemas. No período de janeiro a dezembro de 2005 foram isoladas 50 cepas de bacilos Gram positivos de pacientes atendidos no Hospital Universitário de Santa Maria. Estes microrganismos foram identificados através de uma bateria proposta de provas bioquímicas convencionais em comparação com o sistema comercial API Coryne. Para a determinação da sensibilidade a antimicrobianos foi utilizada a metodologia de discodifusão. O maior número de isolamentos foi proveniente de hemoculturas 72% (n=36). Destacaram-se os corineformes 48% (n=24), entre eles o gênero Corynebacterium, e as espécies de Bacillus 44% (n=22). As bactérias pertencentes a este estudo demostraram boa sensibilidade frente à vancomicina, linezolida, ciprofloxacina, imipenem e meropenem. Entretanto 6% (n=3) destas cepas apresentaram multirresistência aos antimicrobianos testados, inclusive à vancomicina, confirmada pelo E-test. A bateria de provas bioquímicas sugerida para a identificação dos BGPs isolados de espécimes clínicos mostrou-se eficiente, com desempenho similar ao comercial disponível, porém mais barata.

O presente trabalho visou identificar e caracterizar três cepas, BRA1, BRA3 e BRA5, isoladas do resíduo de bauxita da região Sul de Minas Gerais. Foi realizado o seqüenciamento do gene 16S RNA ribossomal utilizando dois pares de primers em que foi possível seqüenciar 1300pb de cada cepa isolada. Testes bioquímicos e metabólicos complementares foram realizados a fim de caracterizar os isolados. Os resultados indicaram que a cepa BRA1 foi identificada com 99,7% de similaridade com Bacillus cohnii e caracterizada como: Gram-positiva; redutora de nitrato, catalase, oxidase e amilase positiva; faixa de crescimento entre pH 7 e 10; tolerante às concentrações de 0 a 10% de NaCl, e; faixa de temperatura de 20 a 40ºC. A cepa BRA3 foi identificada com 99,7% de similaridade com Bacillus pseudofirmus e caracterizada como: Gram-positiva; catalase e amilase positiva; oxidase negativa e não redutora de nitrato; faixa de crescimento entre pH 7 e 10; tolerante às concentrações de 5 a 10% de NaCl, dependente do íon Na+ para crescimento, e; faixa de temperatura de 10 a 40ºC. Com os resultados da técnica de seqüenciamento, a cepa BRA5 foi identificada com 99,7% de similaridade com Bacilus clarkii e Bacillus polygoni. Após testes bioquímicos e fisiológicos, a cepa BRA5 ficou mais próxima às características bioquímicas do Bacillus clarkii, caracterizada como: Gram-positiva; catalase e oxidase positiva, redutora de nitrato e amilase negativa; faixa de crescimento entre pH 8 e 10; tolerante às concentrações de 5 a 10% de NaCl, dependente do íon Na+ para crescimento, e; faixa de temperatura de 20 a 40ºC. A utilização dos açúcares: glicose, frutose, sacarose e manitol pelas cepas foi positiva e os ácidos mais produzidos a partir das fontes de carbono foram os ácidos acético, isobutírico, isovalérico, entre outros. As cepas BRA1, BRA3 e BRA5 utilizando glicose como fonte de carbono foram capazes de diminuir o pH do meio de 10,5 para aproximadamente 9,3, 9,5 e 9, respectivamente. A identificação e caracterização dos isolados foram bem sucedidas e os resultados apresentados estão de acordo com os encontrados na literatura. / This study aimed to identify and characterize three strains BRA1, BRA3 and BRA5 isolated from bauxite residue in the Southern region of Minas Gerais. Sequencing of 16S ribosomal RNA gene was carried out using two pairs of primers, which allowed high quality sequencing of 1300pb from each isolated strain. Additional biochemical tests were conducted to characterize the strains. The results indicated that strain BRA1 was identified with 99.7% similarity with B. cohnii and characterized as: Gram-positive; positive for nitrate reduction, catalase, oxidase and amylase; growth range between pH 7 and 10; tolerant to concentrations of 0 to 10% NaCl, and; growth is observed between 20 and 40 °C. The strain BRA3 was identified with 99.7% similarity with Bacillus pseudofirmus and characterized as: Gram-positive; positive for catalase and amylase; negative for oxidase and nitrate reduction; growth range between pH 7 and 10; tolerant to concentrations of 5 to 10% NaCl, Na+ ion dependent for growth, and; growth is observed between 10 and 40 °C. In the results of the sequencing analysis, strain BRA5 was identified with 99.7% similarity with Bacillus clarkii and Bacillus polygoni. After biochemical and physiological tests, the strain BRA5 was closest to the biochemical characteristics of Bacillus clarkii, characterized as Gram-positive; positive for catalase and oxidase, non-nitrate reduction, and amylase; growth range between pH 8 and 10; tolerant to concentrations of 5 to 10% NaCl, Na + ion dependent for growth, and; growth is observed between 20 and 40 °C. The use of sugars: glucose, fructose, sucrose and mannitol was positive and the higher amount of acids produced from the carbon sources were acetic, isobutyric, isovaleric, among others. Strains BRA1, BRA3 and BRA5 using glucose as a carbon source were able to decrease the medium pH 10.5 to approximately 9.3, 9.5 and 9, respectively. The identification and characterization of isolates were successful and the results presented are consistent with those found in the literature. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

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Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / Os produtos farmacêuticos que requerem a característica de esterilidade devem ser submetidos ao Ensaio de Esterilidade que deve ser realizado em áreas limpas, a fim de evitar resultados falso-positivos. A legislação brasileira recomenda a identificação de microrganismos provenientes dos Ensaios e do ambiente onde estes foram realizados. A dificuldade da identificação de vários gêneros bacterianos por metodologias fenotípicas têm sido relatada em vários estudos e mostram a necessidade da utilização de metodologias moleculares para esta finalidade. Neste estudo foi realizada a caracterização fenotípica (API e VITEK BioMerieux) e genotípica (análise da sequência do gene 16S rRNA) de 58 estirpes de cocos Gram positivos não fermentadores da glicose, provenientes de produtos farmacêuticos estéreis e ambiente controlado. O resultado da caracterização fenotípica realizada utilizando o sistema VITEK demonstrou que 100% das identificações foram equivocadas quanto ao gênero e espécie bacteriana. O sistema API identificou corretamente 69% das estirpes quanto ao gênero bacteriano quando comparado com a análise da sequência do gene 16S rRNA. Vinte e cinco estirpes foram submetidas ao sistema VITEK 2 e 68% dessas foram identificados corretamente quanto ao gênero bacteriano. A análise da sequência do gene 16S rRNA mostrou-se eficiente na determinação do gênero e mostrou a diversidade bacteriana deste grupo de organismos. Entre os cocos Gram positivos não fermentadores da glicose analisados foram identificados os gêneros Micrococcus, Kocuria, Demetria, Macrococcus, Arthrobacter, Dietzia, Janibacter e Brachybacterium. Essa análise também mostrou que 8,6% das estirpes avaliadas podem representar espécies ainda não descritas. Esta metodologia possibilita a diferenciação de quase todas as espécies do gênero encontrado com mais frequência, o Micrococcus, exceto o Micrococcus yunnanesis e Micrococcus luteus. Essas espécies também não puderam ser diferenciadas pela análise da sequência de segmentos de genes conservados (rpoB, gyrB, groEL and recA). Os equívocos das identificações fenotípicas alertam para a necessidade da implementação de metodologias moleculares para concluir a identificação correta de estirpes bacterianas provenientes de testes de esterilidade e ambientes controlados. / Sterile pharmaceutical products must be submitted to sterility testing to be carried out in clean rooms, in order to avoid false positive results. Brazilian law recommends the identification of microorganisms from sterility tests and the environment where these tests were performed. It has been reported in several studies difficulty in identifying various genera using phenotypic methods. This suggests the need of molecular methods which are more suitable for this purpose. In this study we performed phenotypic (API and VITEK systems (BioMerieux)) and genotypic (sequence analysis of 16S rRNA) characterization of 58 strains of Gram positive cocci non-fermenting glucose, from pharmaceuticals sterile and controlled environment. The results of phenotypic characterization performed using the VITEK system showed that 100% of the identifications of bacterial genus and species were misleading. The API system correctly identified the bacterial genus of 69% of the strains compared with the sequence analysis of 16S rRNA. Twenty-five strains were identified with the Vitek 2 system and 68% of the strains were identified with the correct bacterial genus. Sequence analysis of 16S rRNA gene was effective in determining the bacterial genus and also showed bacterial diversity of this group of organisms. Among the glucose non-fermenting Gram-positive cocci analyzed, the identified genera were: Micrococcus, Kocuria, Demetria, Macrococcus, Arthrobacter, Dietzia, Janibacter and, Brachybacterium. This analysis also showed that 8.6% of the strains tested may represent species not yet described. This methodology allowed the differentiation of almost all species of the genus Micrococcus, except Micrococcus yunnanesis and Micrococcus luteus. These species were also not differentiated by sequence analysis of fragments of housekeeping genes (rpoB, gyrB, groEL and recA). The mistake phenotypic identifications highlight the need of the implementation of molecular methods to achieve the correct identification of bacterial strains from sterility testing and controlled environments.

Introdução: O Clostridium difficile é um bacilo Gram-positivo, anaeróbio estrito, formador de esporos, que produz toxinas que podem causar diarreia, colite pseudomembranosa, dilatação do cólon, sepse e até morte. Nos últimos anos o quadro clínico e epidemiológico das infecções por Clostridium difficile tem se modificado e as limitações das opções terapêuticas tornaram-se mais evidentes. Objetivo Primário: Comparar as metodologias de disco-difusão e ágar-diluição na detecção de sensibilidade/resistência de isolados de Clostridium difficile. Objetivos Secundários: Avaliar prospectivamente o perfil de sensibilidade/resistência de isolados clínicos hospitalares de Clostridium difficile provenientes de seis hospitais terciários da cidade de São Paulo e fornecer evidências para fundamentar o diagnóstico e o tratamento empírico das diarreias causadas por Clostridium difficile. Métodos: utilizamos os métodos de disco-difusão e ágar-diluição, de acordo com os critérios estabelecidos pelo CLSI e EUCAST. Resultados: Os coeficientes de correlação observados entre os diâmetros dos halos de inibição e Concentração Inibitória Mínima foram abaixo do esperado tornando inviável o método de disco-difusão para determinação de sensibilidade aos antimicrobianos nitazoxanida, teicoplanina e tigeciclina. Todas as 50 cepas deste estudo foram sensíveis ao metronidazol (MIC50 foi de 1 ?g/mL a MIC90 foi de 2 ug/mL). Para o método de disco-difusão, sugerimos que halos de inibição >= 33mm possam ser interpretados como sensíveis. Devido à moderada correlação, significância estatística e distribuição de halos de inibição das amostras próximos aos valores encontrados utilizando a cepa ATTC, sugere-se a utilização do método de disco-difusão para vancomicina, onde halos com diâmetro >= 22mm possam ser considerados como sensíveis pelo método. Para o moxifloxacino houve uma boa correlação entre as duas metodologias: discodifusão e de ágar-diluição (O coeficiente de Pearson foi de -0,84, e o valor de p foi menor que 0,00001), sugerindo que halos de inibição >= 18mm possam ser interpretados como sensíveis pela metodologia de disco-difusão. A nitazoxanida foi à droga que mostrou melhor atividade in vitro (MIC50 foi 0,06 ?g/mL e a MIC90 de 0,12 ug/mL). Por se mostrar uma droga com potente atividade in vitro (MIC50 e a MIC90 foi de 0,12 ug/mL), a tigeciclina poderia ser mais uma opção terapêutica em infecções por Clostridium difficile, dependendo de mais estudos para avaliar sua real eficácia clínica e segurança. Conclusão: Os resultados verificados neste estudo indicam a necessidade de mais estudos in vitro e clínicos para definir os limites de sensibilidade/resistência para a teicoplanina e a nitazoxanida, pois faltam critérios de interpretação tanto para disco-difusão quanto para ágar-diluição. Os resultados deste trabalho in vitro confirmaram a utilidade do metronidazol como uma droga eficaz no tratamento de infecção por Clostridium difficile. A nitazoxanida foi à droga que mostrou melhor atividade in vitro por método dilucional. Sugerimos a utilização do método de disco-difusão para: metronidazol, vancomicina e moxifloxacino. Os resultados desse trabalho sugerem que halos de inibição para metronidazol ( >= 33mm), moxifloxacino ( >= 18mm) e vancomicina ( >= 22mm) poderiam ser considerados como sensíveis pelo método de disco-difusão. O método de ágardiluição é um método de boa acurácia, porém trabalhoso para ser executado na rotina laboratorial / Introduction: Clostridium difficile is a Gram-positive bacillus, strictly anaerobic, spore-forming, which produces toxins that can cause diarrhea, colitis pseudomembranous, colon expansion, sepsis and even death. In recent years the clinical and epidemiological picture of infection by Clostridium difficile has been modified and limitations of therapeutic options have become more evident. Primary Objective: Comparing the methods of disk diffusion and agar dilution in the detection sensitivity/resistance isolates of Clostridium difficile. Secondary Objectives: Prospectively evaluate the profile of sensitivity/resistance of hospital clinical isolates of Clostridium difficile from six tertiary hospitals in São Paulo city and provide evidence to support the diagnosis and empirical treatment of diarrhea caused by Clostridium difficile. Methods: We use the disk diffusion method and agar dilution method, according to the established criteria by CLSI and EUCAST. Results: The observed correlation coefficients between the inhibitions diameter zone of the and Minimum Inhibitory Concentration were under expectations impeding the disk diffusion method for determining sensitivity to nitazoxanide antimicrobial, teicoplanin and tigecycline. All 50 strains of this study were sensitive to metronidazole (MIC50 was 1 Ug/ml to MIC90 was 2 ug/ml). For the method disk diffusion, we suggest that inhibition zones >= 33mm can be interpreted as sensitive. Due to the moderate correlation, statistical significance and distribution of zones of inhibition on samples of the next found values using the strain ATTC, we suggest using the disk diffusion method for vancomycin where halos diameter >= 22mm can be considered as sensitive by the method. There was a good correlation to moxifloxacin between the two methodologies: disk diffusion and agar dilution (Pearson\'s coefficient was -0.84 , and the \"p\" value was less than 0.00001), suggesting that inhibition zones >= 18mm can be interpreted as sensitive by disk diffusion method. Nitazoxanide was the drug that showed a better performance in vitro activity (MIC50 was 0.06 ?g/ml and MIC90 0.12 ug/ml). For a drug that shows potent activity in vitro (MIC50 and MIC90 was 0.12 ug/ml), the tigecycline could be a therapeutic option in infection by Clostridium difficile, depending on further studies to evaluate their real clinical efficacy and security. Conclusion: Obtained results in this study indicate the need for further studies in vitro and clinicians to define the limits of sensitivity/resistance to teicoplanin and nitazoxanide, so there is no interpretation criteria for both disk diffusion and for agar dilution. Results of this work in vitro study confirmed the utility of metronidazole as an effective drug in the treatment of infection by Clostridium difficile. Nitazoxanide was the drug that showed better performance in vitro by dilutional method. We suggest the use of disk diffusion method: metronidazole, vancomycin and moxifloxacin. This work suggest that inhibition zones for metronidazole ( >= 33mm), moxifloxacin ( >= 18mm) and vancomycin ( >= 22mm) could be considered as sensitive by disk diffusion method. The agar dilution method is a method to be accurate, but laborious to run in the laboratory routine

Introdução: O Clostridium difficile é um bacilo Gram-positivo, anaeróbio estrito, formador de esporos, que produz toxinas que podem causar diarreia, colite pseudomembranosa, dilatação do cólon, sepse e até morte. Nos últimos anos o quadro clínico e epidemiológico das infecções por Clostridium difficile tem se modificado e as limitações das opções terapêuticas tornaram-se mais evidentes. Objetivo Primário: Comparar as metodologias de disco-difusão e ágar-diluição na detecção de sensibilidade/resistência de isolados de Clostridium difficile. Objetivos Secundários: Avaliar prospectivamente o perfil de sensibilidade/resistência de isolados clínicos hospitalares de Clostridium difficile provenientes de seis hospitais terciários da cidade de São Paulo e fornecer evidências para fundamentar o diagnóstico e o tratamento empírico das diarreias causadas por Clostridium difficile. Métodos: utilizamos os métodos de disco-difusão e ágar-diluição, de acordo com os critérios estabelecidos pelo CLSI e EUCAST. Resultados: Os coeficientes de correlação observados entre os diâmetros dos halos de inibição e Concentração Inibitória Mínima foram abaixo do esperado tornando inviável o método de disco-difusão para determinação de sensibilidade aos antimicrobianos nitazoxanida, teicoplanina e tigeciclina. Todas as 50 cepas deste estudo foram sensíveis ao metronidazol (MIC50 foi de 1 ?g/mL a MIC90 foi de 2 ug/mL). Para o método de disco-difusão, sugerimos que halos de inibição >= 33mm possam ser interpretados como sensíveis. Devido à moderada correlação, significância estatística e distribuição de halos de inibição das amostras próximos aos valores encontrados utilizando a cepa ATTC, sugere-se a utilização do método de disco-difusão para vancomicina, onde halos com diâmetro >= 22mm possam ser considerados como sensíveis pelo método. Para o moxifloxacino houve uma boa correlação entre as duas metodologias: discodifusão e de ágar-diluição (O coeficiente de Pearson foi de -0,84, e o valor de p foi menor que 0,00001), sugerindo que halos de inibição >= 18mm possam ser interpretados como sensíveis pela metodologia de disco-difusão. A nitazoxanida foi à droga que mostrou melhor atividade in vitro (MIC50 foi 0,06 ?g/mL e a MIC90 de 0,12 ug/mL). Por se mostrar uma droga com potente atividade in vitro (MIC50 e a MIC90 foi de 0,12 ug/mL), a tigeciclina poderia ser mais uma opção terapêutica em infecções por Clostridium difficile, dependendo de mais estudos para avaliar sua real eficácia clínica e segurança. Conclusão: Os resultados verificados neste estudo indicam a necessidade de mais estudos in vitro e clínicos para definir os limites de sensibilidade/resistência para a teicoplanina e a nitazoxanida, pois faltam critérios de interpretação tanto para disco-difusão quanto para ágar-diluição. Os resultados deste trabalho in vitro confirmaram a utilidade do metronidazol como uma droga eficaz no tratamento de infecção por Clostridium difficile. A nitazoxanida foi à droga que mostrou melhor atividade in vitro por método dilucional. Sugerimos a utilização do método de disco-difusão para: metronidazol, vancomicina e moxifloxacino. Os resultados desse trabalho sugerem que halos de inibição para metronidazol ( >= 33mm), moxifloxacino ( >= 18mm) e vancomicina ( >= 22mm) poderiam ser considerados como sensíveis pelo método de disco-difusão. O método de ágardiluição é um método de boa acurácia, porém trabalhoso para ser executado na rotina laboratorial / Introduction: Clostridium difficile is a Gram-positive bacillus, strictly anaerobic, spore-forming, which produces toxins that can cause diarrhea, colitis pseudomembranous, colon expansion, sepsis and even death. In recent years the clinical and epidemiological picture of infection by Clostridium difficile has been modified and limitations of therapeutic options have become more evident. Primary Objective: Comparing the methods of disk diffusion and agar dilution in the detection sensitivity/resistance isolates of Clostridium difficile. Secondary Objectives: Prospectively evaluate the profile of sensitivity/resistance of hospital clinical isolates of Clostridium difficile from six tertiary hospitals in São Paulo city and provide evidence to support the diagnosis and empirical treatment of diarrhea caused by Clostridium difficile. Methods: We use the disk diffusion method and agar dilution method, according to the established criteria by CLSI and EUCAST. Results: The observed correlation coefficients between the inhibitions diameter zone of the and Minimum Inhibitory Concentration were under expectations impeding the disk diffusion method for determining sensitivity to nitazoxanide antimicrobial, teicoplanin and tigecycline. All 50 strains of this study were sensitive to metronidazole (MIC50 was 1 Ug/ml to MIC90 was 2 ug/ml). For the method disk diffusion, we suggest that inhibition zones >= 33mm can be interpreted as sensitive. Due to the moderate correlation, statistical significance and distribution of zones of inhibition on samples of the next found values using the strain ATTC, we suggest using the disk diffusion method for vancomycin where halos diameter >= 22mm can be considered as sensitive by the method. There was a good correlation to moxifloxacin between the two methodologies: disk diffusion and agar dilution (Pearson\'s coefficient was -0.84 , and the \"p\" value was less than 0.00001), suggesting that inhibition zones >= 18mm can be interpreted as sensitive by disk diffusion method. Nitazoxanide was the drug that showed a better performance in vitro activity (MIC50 was 0.06 ?g/ml and MIC90 0.12 ug/ml). For a drug that shows potent activity in vitro (MIC50 and MIC90 was 0.12 ug/ml), the tigecycline could be a therapeutic option in infection by Clostridium difficile, depending on further studies to evaluate their real clinical efficacy and security. Conclusion: Obtained results in this study indicate the need for further studies in vitro and clinicians to define the limits of sensitivity/resistance to teicoplanin and nitazoxanide, so there is no interpretation criteria for both disk diffusion and for agar dilution. Results of this work in vitro study confirmed the utility of metronidazole as an effective drug in the treatment of infection by Clostridium difficile. Nitazoxanide was the drug that showed better performance in vitro by dilutional method. We suggest the use of disk diffusion method: metronidazole, vancomycin and moxifloxacin. This work suggest that inhibition zones for metronidazole ( >= 33mm), moxifloxacin ( >= 18mm) and vancomycin ( >= 22mm) could be considered as sensitive by disk diffusion method. The agar dilution method is a method to be accurate, but laborious to run in the laboratory routine