The mutant prevention concentration (MPC) is defined as the lowest antimicrobial concentration required to inhibit the growth of the least susceptible bacterial cell based on an inoculum of ≥109 colony forming units (CFUs). The current protocol for MPC testing is technically demanding and time-consuming which limits its implementation into clinical microbiology laboratories. In an attempt to simplify the current MPC protocol we developed a modified MPC method, the microbroth dilution method, which requires two fewer days to complete than the current or traditional method. MPC values were consistent for all organisms and strains tested using both the traditional MPC method and the modified microbroth dilution MPC method.<p> Tigecycline is the first of a new class of compound glycylcyclines- with potent in vitro activity against Gram-positive organisms including penicillin-resistant and multi-drug resistant <i>Streptococcus pneumoniae</i> (SP) and methicillin-resistant <i>Staphylococcus aureus</i> (MRSA). We measured minimum inhibitory concentration (MIC) and MPC values for tigecycline against 47 clinical isolates of SP and found that the MPC90 values were >500 fold higher than the MIC90 values. To determine if MPC testing of tigecycline against SP is impacted by blood in the medium, we developed a new medium able to sustain the growth of SP without the need for blood; solidified Todd-Hewitt broth (sTHB). The MPC90 values of tigecycline against SP on sTHB were only 2 fold higher than the MIC90 values. When blood was added to the sTHB, the MPC90 values again became much greater than the MIC90 values (> 256 fold higher). MPC results for <i>Staphylococcus spp.</i> against tigecycline were not impacted by blood in the medium.<p> Benzalkonium chloride (BAK) is a cationic surface-acting agent that acts on bacterial cells by disrupting the intermolecular interaction of the lipid bilayer. To determine if the <i>fluoroquinolones gatifloxacin</i> (Gfx) and moxifloxacin (Mfx) are more active (lower MIC values) in the presence of BAK, we conducted MIC, MPC, and time-kill assays. MIC testing showed that in the presence of 3.125 to 50 µg/ml of BAK, the MIC of Gfx and Mfx decreased by 8- to 5000-fold against clinical isolates of methicillin-susceptible <i>Staphylococcus aureus</i> (MSSA), MRSA, Coagulase-negative <i>Staphylococci</i>(CNS), SP, <i>Escherichia coli</i> (EC), and <i>Pseudomonas aeruginosa</i> (PA). MPC testing showed that the presence of 7 to 10 µg/ml of BAK, the MPC of Gfx and Mfx decreased by 32- to 1000-fold against clinical isolates of MRSA. Conventional time-kill studies (using a bacterial load of 105 CFUs) showed that the killing activity of Gfx against clinical MRSA isolates was enhanced in the presence of BAK with a log10-reduction (percent kill) of 1.6 (76.08%) for Gfx alone at 180 minutes compared to a log10-redecution (percent kill) of 5.4 (100%) for Gfx plus BAK at 180 minutes.<p> Alexidine (Alx) is a bisbiguanide that has been used as an effective disinfectant in the dental industry and is potentially being developed for use as an antimicrobial agent for ocular infections. We conducted susceptibility testing of Alx using MIC testing, MPC testing, and time-kill assays against Gram-positive and Gram-negative pathogens. MIC testing showed that Alx is more active against Gram-positive pathogens than Gram-negative pathogens and showed better activity than the fluoroquinolones Gfx, Mfx, and levofloxacin (Lfx) against MRSA. The MPC values measured for MRSA and MSSA against Alx were non-reproducible using the traditional MPC method. Using the microbroth dilution MPC method, MPC90 values were found to be 32 fold higher than the MIC90 values. If the experimentally determined MPC values are true MPC values, initial MPC testing indicates that Alx may have a high likelihood for selecting for resistance, however, if the MPC values are not accurate it may be necessary to modify the MPC protocol in order to complete MPC testing of Alx against MRSA and MSSA. Conventional time-kill studies (using a bacterial load of 105 CFUs) measured bactericidal activity (> 3 log10-reduction) against MRSA, MSSA, SP, and PA.

The mutant prevention concentration (MPC) is defined as the lowest antimicrobial concentration required to inhibit the growth of the least susceptible bacterial cell based on an inoculum of ≥109 colony forming units (CFUs). The current protocol for MPC testing is technically demanding and time-consuming which limits its implementation into clinical microbiology laboratories. In an attempt to simplify the current MPC protocol we developed a modified MPC method, the microbroth dilution method, which requires two fewer days to complete than the current or traditional method. MPC values were consistent for all organisms and strains tested using both the traditional MPC method and the modified microbroth dilution MPC method.<p> Tigecycline is the first of a new class of compound glycylcyclines- with potent in vitro activity against Gram-positive organisms including penicillin-resistant and multi-drug resistant <i>Streptococcus pneumoniae</i> (SP) and methicillin-resistant <i>Staphylococcus aureus</i> (MRSA). We measured minimum inhibitory concentration (MIC) and MPC values for tigecycline against 47 clinical isolates of SP and found that the MPC90 values were >500 fold higher than the MIC90 values. To determine if MPC testing of tigecycline against SP is impacted by blood in the medium, we developed a new medium able to sustain the growth of SP without the need for blood; solidified Todd-Hewitt broth (sTHB). The MPC90 values of tigecycline against SP on sTHB were only 2 fold higher than the MIC90 values. When blood was added to the sTHB, the MPC90 values again became much greater than the MIC90 values (> 256 fold higher). MPC results for <i>Staphylococcus spp.</i> against tigecycline were not impacted by blood in the medium.<p> Benzalkonium chloride (BAK) is a cationic surface-acting agent that acts on bacterial cells by disrupting the intermolecular interaction of the lipid bilayer. To determine if the <i>fluoroquinolones gatifloxacin</i> (Gfx) and moxifloxacin (Mfx) are more active (lower MIC values) in the presence of BAK, we conducted MIC, MPC, and time-kill assays. MIC testing showed that in the presence of 3.125 to 50 µg/ml of BAK, the MIC of Gfx and Mfx decreased by 8- to 5000-fold against clinical isolates of methicillin-susceptible <i>Staphylococcus aureus</i> (MSSA), MRSA, Coagulase-negative <i>Staphylococci</i>(CNS), SP, <i>Escherichia coli</i> (EC), and <i>Pseudomonas aeruginosa</i> (PA). MPC testing showed that the presence of 7 to 10 µg/ml of BAK, the MPC of Gfx and Mfx decreased by 32- to 1000-fold against clinical isolates of MRSA. Conventional time-kill studies (using a bacterial load of 105 CFUs) showed that the killing activity of Gfx against clinical MRSA isolates was enhanced in the presence of BAK with a log10-reduction (percent kill) of 1.6 (76.08%) for Gfx alone at 180 minutes compared to a log10-redecution (percent kill) of 5.4 (100%) for Gfx plus BAK at 180 minutes.<p> Alexidine (Alx) is a bisbiguanide that has been used as an effective disinfectant in the dental industry and is potentially being developed for use as an antimicrobial agent for ocular infections. We conducted susceptibility testing of Alx using MIC testing, MPC testing, and time-kill assays against Gram-positive and Gram-negative pathogens. MIC testing showed that Alx is more active against Gram-positive pathogens than Gram-negative pathogens and showed better activity than the fluoroquinolones Gfx, Mfx, and levofloxacin (Lfx) against MRSA. The MPC values measured for MRSA and MSSA against Alx were non-reproducible using the traditional MPC method. Using the microbroth dilution MPC method, MPC90 values were found to be 32 fold higher than the MIC90 values. If the experimentally determined MPC values are true MPC values, initial MPC testing indicates that Alx may have a high likelihood for selecting for resistance, however, if the MPC values are not accurate it may be necessary to modify the MPC protocol in order to complete MPC testing of Alx against MRSA and MSSA. Conventional time-kill studies (using a bacterial load of 105 CFUs) measured bactericidal activity (> 3 log10-reduction) against MRSA, MSSA, SP, and PA.

Enterococcus são cocos gram-positivos que ocorrem isolados, aos pares (diplococos) ou em cadeias e pertencem à microbiota intestinal de uma grande variedade de hospedeiros, de mamíferos a insetos. Enterococcus foram originalmente considerados organismos de pouca importância clínica, mas têm se revelado importantes patógenos nosocomiais. O fato dos Enterococcus possuírem formas de resistência intrínseca e adquirida a vários antibióticos dificulta o tratamento de infecções causadas por eles. Enterococcus faecalis é geralmente a espécie predominante entre os enterococos isolados, sendo de 80% a 90% das amostras clínicas. O surgimento de Enterococcus resistentes à vancomicina (VRE- do inglês vancomycin resistant enterococci) reduziu significativamente as opções de tratamento. O objetivo deste estudo foi identificar e comparar amostras de E. faecalis resistentes à vancomicina (VREfs) isolados em pacientes nos anos de 2009 e 2011, durante um programa de vigilância no Hospital Risoleta Tolentino Neves, em Belo Horizonte, MG. A identificação das espécies foi feita por multiplex-PCR com primers espécie-específicos e os E. faecalis foram selecionados para estudo. Foram realizadas a pesquisa da presença dos genes elrA, cylLL, esp e gelE, a determinação do genótipo responsável pela resistência e a caracterização do transposon que contém o gene de resistência, todos por meio de PCR. Foi também realizada a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) de acordo com o CLSI (2013) para vancomicina, linezolida, tigeciclina e daptomicina e testes para resistência a altas concentrações de aminoglicosídeos. Por fim, a tipagem das amostras foi feita através de eletroforese em campo pulsado (PFGE- do inglês Pulsed Field Gel Eletroforesis) e MLST (Multilocus sequence typing). Foi encontrado que 22,2% dos VRE isolados em 2009 e 61,7% dos isolados em 2011 pertencem à espécie E. faecalis e estes foram utilizados no estudo. Houve surgimento de resistência à tigeciclina nos isolados de 2011, sendo 10 isolados resistentes, logo após o início do uso deste antimicrobiano no hospital. Foi encontrado um isolado de 2011 com resistência intermediária à linezolida. Todos os isolados foram sensíveis à daptomicina e altamente resistentes à vancomicina, com CIM maior que 256 &mu;g/mL. Essa alta resistência à vancomicina é condizente com o genótipo Vana, encontrado em todas as amostras. O perfil de virulência prevalente nos VREfs em 2009 era elrA+gelE+, sendo dos pulsotipos A1 e A4 e ST103. Apenas um isolado de 2009, com pulsotipo A1 apresentou o perfil de virulência cyl+elrA+gelE+. Em 2011, o perfil de virulência prevalente foi cyl+esp+elrA+gelE+, sendo que os 12 isolados com esse perfil pertenciam aos pulsotipos B e C e ST6, que ocorreram somente em isolados de 2011. Onze amostras de 2011 apresentaram o perfil elrA+gelE+ e foram classificadas no pulsotipo A e seis amostras tem perfil cyl+elrA+gelE+ e são dos pulsotipos B e D. Resultados de PFGE mostram a inserção no hospital da linhagem ST6, um clone multirresistente amplamente disseminado em hospitais da Itália, Portugal, Espanha e Estados Unidos. Concluiu-se que houve mudanças no perfil de E. faecalis resistentes à vancomicina no hospital, ao longo dos dois anos, com aumento de resistência e linhagens mais virulentas, sendo estes motivos de preocupação. / Enterococci are Gram-positive cocci occurring isolated, in pairs (diplococci) or chains and belong to the intestinal tract of a wide variety of hosts, from mammalian to insect. Enterococcus organisms were originally considered of little clinical importance, but have proved important nosocomial pathogens. The fact that Enterococcus possess intrinsic and acquired resistance to multiple antibiotics complicates the treatment of infections caused by them. Enterococcus faecalis is usually the predominant species among enterococci isolates, with 80% to 90% of the clinical samples. The emergence of vancomycin-resistant Enterococcus (VRE) significantly reduced the treatment options. The aim of this study was to identify and compare samples of vancomycin- resistant E. faecalis (VREfs) in patients in the years 2009 and 2011, during a surveillance program in Hospital Risoleta Tolentino Neves, Belo Horizonte, MG. Species identification was done by multiplex-PCR with primers species-specific and E. faecalis were selected for this study. Tests were conducted for the presence of genes elrA, cylLL, esp and gelE, the determination of the genotype responsible for the resistance and characterization of transposon containing the resistance gene, all by PCR. The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined according to the CLSI (2013) to vancomycin, linezolid, daptomycin and tigecycline and tests for resistance to high concentrations of aminoglycosides. Finally, the samples typing was performed by pulsed field gel electrophoresis (PFGE) and multilocus sequence typing (MLST). It was found that 22.2 % of VRE isolates in 2009 and 61.7 % of isolates in 2011 belong to the species E. faecalis and these were used in the study. There was emergence of tigecycline resistance in 2011, with 10 resistant isolates, after the introduction of this drug in the hospital. One isolate from 2011 showed intermediate resistance to linezolid. All isolates were sensitive to daptomycin and highly vancomycin resistant, with MICs greater than 256 mg / mL. This high resistance to vancomycin is consistent with the vanA genotype found in all samples. The virulence profile prevalent in VREfs in 2009 was elrA+gelE+, belonging to the pulsotypes A1 and A4 and ST103. Only one isolate from 2009, presented pulsotype A1 and the virulence profile cyl+elrA+gelE+. In 2011, the prevalent virulence profile was cyl+esp+elrA+gelE+, and the 12 isolates with this profile belonged to pulsotypes B and C and ST6, which occurred only in 2011 isolates. Eleven isolates from 2011 have the profile elrA+gelE+ and were classified as pulsotype A, six isolates have profile cyl+elrA+gelE+ and are of pulsotypes B and D. PFGE results show the insertion of ST6 lineage in the hospital, a multiresistant clone widely disseminated in hospitals in Italy, Portugal, Spain and the United States. It was concluded that there were changes in the profile of E. faecalis resistant to vancomycin in the hospital over the two years, with increased resistance and more virulent strains, which are of concern.

Diante do aumento global da resistência microbiana, cada vez mais as combinações de antimicrobianos são utilizadas na tentativa de obter uma atividade sinérgica eficaz que possa ser utilizada na prática clínica. O objetivo deste trabalho foi comparar a atividade de polimixina B isoladamente e em combinação com tigeciclina e carbapenêmicos (ertapenem e meropenem), frente a isolados de Enterobacter sp. resistentes aos carbapenêmicos. Foram selecionados quatro isolados de Enterobacter sp. resistentes aos carbapenêmicos, sendo três isolados produtores de carbapenemases (KPC, NDM, OXA-48-like) e um não produtor de carbapenemases (NPC). A avaliação da atividade sinérgica antimicrobiana foi realizada por ensaio de time-kill com as seguintes concentrações de cada antimicrobiano: tigeciclina 1mg/L, meropenem 1mg/L e ertapenem 0,5mg/L, que correspondem aos pontos de corte de sensibilidade do CLSI (2016). Para polimixina B, foram utilizadas diferentes concentrações de acordo com o perfil de susceptibilidade do isolado: para os isolados sensíveis, utilizou-se 0,5x; 1x e 2x a CIM do isolado; para o isolado resistente, foram utilizados 0,5x; 1x e 2x o ponto de corte de sensibilidade do CLSI (2 mg/L). Foi considerada sinérgica a combinação com redução ≥ 2 logs do inoculo inicial em comparação ao antimicrobiano sozinho mais ativo. As combinações de polimixina B em diferentes concentrações (0,5; 1 e 2mg/L) com meropenem apresentaram atividade sinérgica para a cepa produtora de NDM (CIM polimixina B 1 mg/L; CIM meropenem 8 mg/L) As combinações de polimixina B com tigeciclina foram sinérgicas apenas na concentração de polimixina B de 0,125 mg/L para cepa produtora de OXA-48-like (CIM polimixina B 0,25 mg/L; CIM tigeciclina 2 mg/L) e na concentração de 1 mg/L para a cepa produtora de NDM. Para a cepa NPC (CIM polimixina B 0,5 mg/L; CIM tigeciclina 4 mg/L; CIM meropenem 4 mg/L), apenas a tripla combinação com polimixina B (1 mg/L), tigeciclina e meropenem apresentou atividade sinérgica. A combinação de dois carbapenêmicos não apresentou atividade sinérgica para nenhum isolado, porém, quando acrescentado tigeciclina ao esquema, observou-se sinergismo no isolado produtor de OXA-48-like, o que leva ao questionamento da efetividade da terapia “carbapenem suicida”. Para o isolado produtor de KPC e com padrão de resistência a polimixina B, nenhuma das combinações testadas apresentou sinergismo. Esta situação é bastante preocupante devido à alta prevalência de infecções por bactérias produtoras de KPC nos hospitais brasileiros, juntamente com as crescentes taxas de resistência as polimixinas. / Due to the increase in microbial resistance, combinations of antimicrobials are increasingly being used to improve the therapeutic response. The objective of this study was to compare the activity of polymyxin B alone and in combination with tigecycline and carbapenem (ertapenem and meropenem) against to carbapenem-resistant Enterobacter sp isolates. Four isolates were selected, three were carbapenemase-producing (KPC, NDM, OXA-48-like) and a non-carbapenemase-producing (NCP). The evaluation of synergistic antimicrobial activity was performed by time-kill assay with the following concentrations of each antimicrobial: tigecycline 1mg/L, meropenem 1mg/L and ertapenem 0.5mg/L, which correspond to the breakpoints of CLSI (2016). For polymyxin B, different concentrations were used according to the susceptibility profile of the isolate: for susceptible isolates, it was used 0.5x; 1x and 2x the MIC of the isolate, for the resistant isolates it was used 0.5x; 1x and 2x the breakpoint of CLSI (2 mg/L). The combination with reduction ≥ 2 logs of the initial inoculum compared to the most active antimicrobial alone was considered synergies. Combinations of polymyxin B at different concentrations (0.5; 1 and 2 mg/L) with meropenem showed synergistic activity for the NDM-producing isolate (MIC polymyxin B 1 mg/L, MIC meropenem 8 mg/L) Combinations of polymyxin B with tigecycline were synergistic only at the concentration of polymyxin B of 0.125 mg/L for the OXA-48-like-producing isolate (MIC polymyxin B 0.25 mg/L, MIC tigecycline 2 mg/L) and at the concentration of 1 mg/L for the NDM-producing isolate. For the NCP isolate (MIC polymyxin B 0.5 mg/L; MIC tigecycline 4 mg/L; MIC meropenem 4 mg/L), only the triple combination of polymyxin B (1 mg/L) plus tigecycline and meropenem presented synergistic activity. The combination of two carbapenems was not synergic for the four isolates; however, when tigecycline was added to the regimen, synergies for the OXA-48-like-producing isolate were observed. Therefore, the so called, "carbapenem suicide" therapy was not effective in vitro against our isolates. For the KPC-producing isolate that it is polymyxin B resistant, none of the combinations tested showed synergies. This situation is very worrisome due to high prevalence of infections by KPC-producing in the Brazilian hospitals, associate with the increasing rates of polymyxins resistance.

Diante do aumento global da resistência microbiana, cada vez mais as combinações de antimicrobianos são utilizadas na tentativa de obter uma atividade sinérgica eficaz que possa ser utilizada na prática clínica. O objetivo deste trabalho foi comparar a atividade de polimixina B isoladamente e em combinação com tigeciclina e carbapenêmicos (ertapenem e meropenem), frente a isolados de Enterobacter sp. resistentes aos carbapenêmicos. Foram selecionados quatro isolados de Enterobacter sp. resistentes aos carbapenêmicos, sendo três isolados produtores de carbapenemases (KPC, NDM, OXA-48-like) e um não produtor de carbapenemases (NPC). A avaliação da atividade sinérgica antimicrobiana foi realizada por ensaio de time-kill com as seguintes concentrações de cada antimicrobiano: tigeciclina 1mg/L, meropenem 1mg/L e ertapenem 0,5mg/L, que correspondem aos pontos de corte de sensibilidade do CLSI (2016). Para polimixina B, foram utilizadas diferentes concentrações de acordo com o perfil de susceptibilidade do isolado: para os isolados sensíveis, utilizou-se 0,5x; 1x e 2x a CIM do isolado; para o isolado resistente, foram utilizados 0,5x; 1x e 2x o ponto de corte de sensibilidade do CLSI (2 mg/L). Foi considerada sinérgica a combinação com redução ≥ 2 logs do inoculo inicial em comparação ao antimicrobiano sozinho mais ativo. As combinações de polimixina B em diferentes concentrações (0,5; 1 e 2mg/L) com meropenem apresentaram atividade sinérgica para a cepa produtora de NDM (CIM polimixina B 1 mg/L; CIM meropenem 8 mg/L) As combinações de polimixina B com tigeciclina foram sinérgicas apenas na concentração de polimixina B de 0,125 mg/L para cepa produtora de OXA-48-like (CIM polimixina B 0,25 mg/L; CIM tigeciclina 2 mg/L) e na concentração de 1 mg/L para a cepa produtora de NDM. Para a cepa NPC (CIM polimixina B 0,5 mg/L; CIM tigeciclina 4 mg/L; CIM meropenem 4 mg/L), apenas a tripla combinação com polimixina B (1 mg/L), tigeciclina e meropenem apresentou atividade sinérgica. A combinação de dois carbapenêmicos não apresentou atividade sinérgica para nenhum isolado, porém, quando acrescentado tigeciclina ao esquema, observou-se sinergismo no isolado produtor de OXA-48-like, o que leva ao questionamento da efetividade da terapia “carbapenem suicida”. Para o isolado produtor de KPC e com padrão de resistência a polimixina B, nenhuma das combinações testadas apresentou sinergismo. Esta situação é bastante preocupante devido à alta prevalência de infecções por bactérias produtoras de KPC nos hospitais brasileiros, juntamente com as crescentes taxas de resistência as polimixinas. / Due to the increase in microbial resistance, combinations of antimicrobials are increasingly being used to improve the therapeutic response. The objective of this study was to compare the activity of polymyxin B alone and in combination with tigecycline and carbapenem (ertapenem and meropenem) against to carbapenem-resistant Enterobacter sp isolates. Four isolates were selected, three were carbapenemase-producing (KPC, NDM, OXA-48-like) and a non-carbapenemase-producing (NCP). The evaluation of synergistic antimicrobial activity was performed by time-kill assay with the following concentrations of each antimicrobial: tigecycline 1mg/L, meropenem 1mg/L and ertapenem 0.5mg/L, which correspond to the breakpoints of CLSI (2016). For polymyxin B, different concentrations were used according to the susceptibility profile of the isolate: for susceptible isolates, it was used 0.5x; 1x and 2x the MIC of the isolate, for the resistant isolates it was used 0.5x; 1x and 2x the breakpoint of CLSI (2 mg/L). The combination with reduction ≥ 2 logs of the initial inoculum compared to the most active antimicrobial alone was considered synergies. Combinations of polymyxin B at different concentrations (0.5; 1 and 2 mg/L) with meropenem showed synergistic activity for the NDM-producing isolate (MIC polymyxin B 1 mg/L, MIC meropenem 8 mg/L) Combinations of polymyxin B with tigecycline were synergistic only at the concentration of polymyxin B of 0.125 mg/L for the OXA-48-like-producing isolate (MIC polymyxin B 0.25 mg/L, MIC tigecycline 2 mg/L) and at the concentration of 1 mg/L for the NDM-producing isolate. For the NCP isolate (MIC polymyxin B 0.5 mg/L; MIC tigecycline 4 mg/L; MIC meropenem 4 mg/L), only the triple combination of polymyxin B (1 mg/L) plus tigecycline and meropenem presented synergistic activity. The combination of two carbapenems was not synergic for the four isolates; however, when tigecycline was added to the regimen, synergies for the OXA-48-like-producing isolate were observed. Therefore, the so called, "carbapenem suicide" therapy was not effective in vitro against our isolates. For the KPC-producing isolate that it is polymyxin B resistant, none of the combinations tested showed synergies. This situation is very worrisome due to high prevalence of infections by KPC-producing in the Brazilian hospitals, associate with the increasing rates of polymyxins resistance.

Enterobactérias como Klebsiella pneumoniae e Enterobacter spp. estão entre as principais causas de infecções hospitalares e estão frequentemente associadas à produção da enzima Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC). A emergência de isolados produtores desta e de outras carbapenemases é um grave problema de saúde pública uma vez que as opções terapêuticas tornam-se extremamente limitadas. As polimixinas frequentemente constituem uma das poucas opções disponíveis, porém têm sido associadas a menor eficácia clínica, maior mortalidade e toxicidade. Além disso, há descrição in vitro da emergência de subpopulações heterorresistentes de isolados expostos a esta droga. Neste contexto, muitos estudos têm avaliado a terapia combinada como alternativa e a utilização das polimixinas com outras classes de antimicrobianos tem mostrado resultados mais eficazes em comparação às monoterapias no tratamento de infecções causadas por bactérias multirresistentes, como aquelas produtoras KPC. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho de combinações entre polimixina B (PMB) com a tigeciclina (TGC) e com os carbapenêmicos imipenem (IPM) e meropenem (MEM) contra enterobactérias produtoras de KPC-2 pelo método de Time Kill Curves - TKC (Curva de Tempo-Morte). Os isolados foram previamente caracterizados como produtores de KPC-2 e incluíram seis clones de três espécies distintas, sendo dois isolados de K. pneumoniae (KP), dois de Enterobacter cloacae (EC) e dois de Serratia marcescens (SM), provenientes de banco de amostras. A PMB foi testada em concentrações de 0,5, 1,0 e 2,0 μg/mL, enquanto os carbapenêmicos e TGC foram testados a uma concentração fixa de 4,0 e 1,0 μg/mL, respectivamente. Os tubos contendo o inóculo e antibióticos foram incubados a 35 °C e uma alíquota foi semeada em placa de ágar sangue nos tempos: 0, 0,25, 1, 2, 4, 8, 12 e 24 horas, para a contagem das colônias. Os resultados foram interpretados conforme as seguintes definições: i) atividade bactericida = redução ≥ 3 log10 na contagem total de unidades formadoras de colônia (UFC)/mL comparado ao inóculo inicial; ii) atividade bacteriostática = manutenção ou redução < 3 log10 na contagem total de UFC/mL comparado ao inóculo original; iii) sinergismo = diminuição ≥ 2 log10 na contagem total de UFC/mL entre a combinação de antimicrobianos e o agente mais ativo, após 24 horas de incubação. De acordo com nossos resultados, IPM, MEM e TGC não apresentaram efeito bacteriostático ou bactericida quando testados como única droga contra todos os isolados produtores de KPC-2. Todas as combinações de antibióticos mostraram sinergismo com atividade bactericida ou, pelo menos, um efeito bacteriostático para todos os isolados testados, sendo as combinações mais efetivas aquelas onde a de PMB foi usada nas concentrações de 1,0 e 2,0 μg/mL e combinada aos carbapenêmicos. Embora tenham sido observadas concentrações inibitórias mínimas elevadas para PMB contra os isolados de SM, para ambas as cepas houve sinergismo quando a PMB foi combinada a IPM e MEM. Nossos resultados confirmam a superioridade das combinações de antimicrobianos em comparação às monoterapias e sugerem que, a PMB combinada com carbapenêmicos ou TCG pode ser uma opção terapêutica eficaz para o tratamento de infecções causadas por isolados de enterobactérias produtores de KPC-2. / Enterobacteria such as Klebsiella pneumoniae and Enterobacter spp. are among the leading causes of nosocomial infections and are often associated with Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) production. The emergence of KPC and other carbapenemases is a serious public health problem due to the limited therapeutic. Polymyxins often constitute one of the few options available, but it have been associated with lower clinical efficacy, toxicity and increased mortality. Moreover, several studies have demonstrated the emergence of heteroresistant subpopulations when isolates are exposed to this drug. In this context, some authors have evaluated the combined therapy as an alternative and the use of polymyxins with other classes of antibiotics have shown to be more effective compared to the monotherapies for the treatment of infections caused by multiresistant bacteria. Therefore, the aim of this study was to evaluate the performance of polymyxin B (PMB) with carbapenems imipenem (IPM) and meropenem (MEM) and tigecycline (TGC) combinations against KPC-2 producing Enterobacteriaceae by Time Kill Curves method. Isolates were previously characterized as KPC-2 producing comprising six distinct clones that included: two K. pneumoniae (KP), two Enterobacter cloacae (EC) and two Serratia marcescens (SM). PMB was tested at concentrations 0,5, 1,0 and 2,0 μg/mL, whereas carbapenems and TGC were tested at a fixed concentration of 4.0 and 1.0 μg/mL, respectively. Tubes with inoculum and antibiotics were incubated at 35 °C and an aliquot was plated on blood agar plates at times: 0, 0.25, 1, 2, 4, 8, 12 and 24 hours for counting colonies. The results were interpreted according to the following definitions: i) bactericidal activity = ≥ 3 log10 reduction in total count of colony forming units (CFU)/mL compared to the initial inoculum; ii) bacteriostatic activity = maintenance or reduction < 3 log10 in total count of CFU/mL compared to the original inoculum; iii) synergism = ≥ 2 log10 decrease in total count of CFU/ml between the combination and the most active antimicrobial agent after 24 hours of incubation. According to our results, IPM, MEM and TGC showed no bacteriostatic or bactericidal effects when tested as a single drug against all KPC-2-producing isolates. All combinations of antibiotics showed synergism with bactericidal activity or at least, a bacteriostatic effect for all the six isolates. The more effective combinations were those that PMB was used at 1,0 and 2,0 μg/mL, combined with carbapenems. Although high minimum inhibitory concentrations were observed for PMB against isolates of SM, for both strains, synergism was observed when PMB was combined with IPM and MEM. Our results confirm the superiority of antimicrobial combinations compared to monotherapies and suggest that PMB combined with carbapenem or TCG can be an effective therapeutic option for the treatment of infections caused by KPC-2-producing Enterobacteriaceae.

Diante do aumento global da resistência microbiana, cada vez mais as combinações de antimicrobianos são utilizadas na tentativa de obter uma atividade sinérgica eficaz que possa ser utilizada na prática clínica. O objetivo deste trabalho foi comparar a atividade de polimixina B isoladamente e em combinação com tigeciclina e carbapenêmicos (ertapenem e meropenem), frente a isolados de Enterobacter sp. resistentes aos carbapenêmicos. Foram selecionados quatro isolados de Enterobacter sp. resistentes aos carbapenêmicos, sendo três isolados produtores de carbapenemases (KPC, NDM, OXA-48-like) e um não produtor de carbapenemases (NPC). A avaliação da atividade sinérgica antimicrobiana foi realizada por ensaio de time-kill com as seguintes concentrações de cada antimicrobiano: tigeciclina 1mg/L, meropenem 1mg/L e ertapenem 0,5mg/L, que correspondem aos pontos de corte de sensibilidade do CLSI (2016). Para polimixina B, foram utilizadas diferentes concentrações de acordo com o perfil de susceptibilidade do isolado: para os isolados sensíveis, utilizou-se 0,5x; 1x e 2x a CIM do isolado; para o isolado resistente, foram utilizados 0,5x; 1x e 2x o ponto de corte de sensibilidade do CLSI (2 mg/L). Foi considerada sinérgica a combinação com redução ≥ 2 logs do inoculo inicial em comparação ao antimicrobiano sozinho mais ativo. As combinações de polimixina B em diferentes concentrações (0,5; 1 e 2mg/L) com meropenem apresentaram atividade sinérgica para a cepa produtora de NDM (CIM polimixina B 1 mg/L; CIM meropenem 8 mg/L) As combinações de polimixina B com tigeciclina foram sinérgicas apenas na concentração de polimixina B de 0,125 mg/L para cepa produtora de OXA-48-like (CIM polimixina B 0,25 mg/L; CIM tigeciclina 2 mg/L) e na concentração de 1 mg/L para a cepa produtora de NDM. Para a cepa NPC (CIM polimixina B 0,5 mg/L; CIM tigeciclina 4 mg/L; CIM meropenem 4 mg/L), apenas a tripla combinação com polimixina B (1 mg/L), tigeciclina e meropenem apresentou atividade sinérgica. A combinação de dois carbapenêmicos não apresentou atividade sinérgica para nenhum isolado, porém, quando acrescentado tigeciclina ao esquema, observou-se sinergismo no isolado produtor de OXA-48-like, o que leva ao questionamento da efetividade da terapia “carbapenem suicida”. Para o isolado produtor de KPC e com padrão de resistência a polimixina B, nenhuma das combinações testadas apresentou sinergismo. Esta situação é bastante preocupante devido à alta prevalência de infecções por bactérias produtoras de KPC nos hospitais brasileiros, juntamente com as crescentes taxas de resistência as polimixinas. / Due to the increase in microbial resistance, combinations of antimicrobials are increasingly being used to improve the therapeutic response. The objective of this study was to compare the activity of polymyxin B alone and in combination with tigecycline and carbapenem (ertapenem and meropenem) against to carbapenem-resistant Enterobacter sp isolates. Four isolates were selected, three were carbapenemase-producing (KPC, NDM, OXA-48-like) and a non-carbapenemase-producing (NCP). The evaluation of synergistic antimicrobial activity was performed by time-kill assay with the following concentrations of each antimicrobial: tigecycline 1mg/L, meropenem 1mg/L and ertapenem 0.5mg/L, which correspond to the breakpoints of CLSI (2016). For polymyxin B, different concentrations were used according to the susceptibility profile of the isolate: for susceptible isolates, it was used 0.5x; 1x and 2x the MIC of the isolate, for the resistant isolates it was used 0.5x; 1x and 2x the breakpoint of CLSI (2 mg/L). The combination with reduction ≥ 2 logs of the initial inoculum compared to the most active antimicrobial alone was considered synergies. Combinations of polymyxin B at different concentrations (0.5; 1 and 2 mg/L) with meropenem showed synergistic activity for the NDM-producing isolate (MIC polymyxin B 1 mg/L, MIC meropenem 8 mg/L) Combinations of polymyxin B with tigecycline were synergistic only at the concentration of polymyxin B of 0.125 mg/L for the OXA-48-like-producing isolate (MIC polymyxin B 0.25 mg/L, MIC tigecycline 2 mg/L) and at the concentration of 1 mg/L for the NDM-producing isolate. For the NCP isolate (MIC polymyxin B 0.5 mg/L; MIC tigecycline 4 mg/L; MIC meropenem 4 mg/L), only the triple combination of polymyxin B (1 mg/L) plus tigecycline and meropenem presented synergistic activity. The combination of two carbapenems was not synergic for the four isolates; however, when tigecycline was added to the regimen, synergies for the OXA-48-like-producing isolate were observed. Therefore, the so called, "carbapenem suicide" therapy was not effective in vitro against our isolates. For the KPC-producing isolate that it is polymyxin B resistant, none of the combinations tested showed synergies. This situation is very worrisome due to high prevalence of infections by KPC-producing in the Brazilian hospitals, associate with the increasing rates of polymyxins resistance.

Enterobactérias como Klebsiella pneumoniae e Enterobacter spp. estão entre as principais causas de infecções hospitalares e estão frequentemente associadas à produção da enzima Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC). A emergência de isolados produtores desta e de outras carbapenemases é um grave problema de saúde pública uma vez que as opções terapêuticas tornam-se extremamente limitadas. As polimixinas frequentemente constituem uma das poucas opções disponíveis, porém têm sido associadas a menor eficácia clínica, maior mortalidade e toxicidade. Além disso, há descrição in vitro da emergência de subpopulações heterorresistentes de isolados expostos a esta droga. Neste contexto, muitos estudos têm avaliado a terapia combinada como alternativa e a utilização das polimixinas com outras classes de antimicrobianos tem mostrado resultados mais eficazes em comparação às monoterapias no tratamento de infecções causadas por bactérias multirresistentes, como aquelas produtoras KPC. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho de combinações entre polimixina B (PMB) com a tigeciclina (TGC) e com os carbapenêmicos imipenem (IPM) e meropenem (MEM) contra enterobactérias produtoras de KPC-2 pelo método de Time Kill Curves - TKC (Curva de Tempo-Morte). Os isolados foram previamente caracterizados como produtores de KPC-2 e incluíram seis clones de três espécies distintas, sendo dois isolados de K. pneumoniae (KP), dois de Enterobacter cloacae (EC) e dois de Serratia marcescens (SM), provenientes de banco de amostras. A PMB foi testada em concentrações de 0,5, 1,0 e 2,0 μg/mL, enquanto os carbapenêmicos e TGC foram testados a uma concentração fixa de 4,0 e 1,0 μg/mL, respectivamente. Os tubos contendo o inóculo e antibióticos foram incubados a 35 °C e uma alíquota foi semeada em placa de ágar sangue nos tempos: 0, 0,25, 1, 2, 4, 8, 12 e 24 horas, para a contagem das colônias. Os resultados foram interpretados conforme as seguintes definições: i) atividade bactericida = redução ≥ 3 log10 na contagem total de unidades formadoras de colônia (UFC)/mL comparado ao inóculo inicial; ii) atividade bacteriostática = manutenção ou redução < 3 log10 na contagem total de UFC/mL comparado ao inóculo original; iii) sinergismo = diminuição ≥ 2 log10 na contagem total de UFC/mL entre a combinação de antimicrobianos e o agente mais ativo, após 24 horas de incubação. De acordo com nossos resultados, IPM, MEM e TGC não apresentaram efeito bacteriostático ou bactericida quando testados como única droga contra todos os isolados produtores de KPC-2. Todas as combinações de antibióticos mostraram sinergismo com atividade bactericida ou, pelo menos, um efeito bacteriostático para todos os isolados testados, sendo as combinações mais efetivas aquelas onde a de PMB foi usada nas concentrações de 1,0 e 2,0 μg/mL e combinada aos carbapenêmicos. Embora tenham sido observadas concentrações inibitórias mínimas elevadas para PMB contra os isolados de SM, para ambas as cepas houve sinergismo quando a PMB foi combinada a IPM e MEM. Nossos resultados confirmam a superioridade das combinações de antimicrobianos em comparação às monoterapias e sugerem que, a PMB combinada com carbapenêmicos ou TCG pode ser uma opção terapêutica eficaz para o tratamento de infecções causadas por isolados de enterobactérias produtores de KPC-2. / Enterobacteria such as Klebsiella pneumoniae and Enterobacter spp. are among the leading causes of nosocomial infections and are often associated with Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) production. The emergence of KPC and other carbapenemases is a serious public health problem due to the limited therapeutic. Polymyxins often constitute one of the few options available, but it have been associated with lower clinical efficacy, toxicity and increased mortality. Moreover, several studies have demonstrated the emergence of heteroresistant subpopulations when isolates are exposed to this drug. In this context, some authors have evaluated the combined therapy as an alternative and the use of polymyxins with other classes of antibiotics have shown to be more effective compared to the monotherapies for the treatment of infections caused by multiresistant bacteria. Therefore, the aim of this study was to evaluate the performance of polymyxin B (PMB) with carbapenems imipenem (IPM) and meropenem (MEM) and tigecycline (TGC) combinations against KPC-2 producing Enterobacteriaceae by Time Kill Curves method. Isolates were previously characterized as KPC-2 producing comprising six distinct clones that included: two K. pneumoniae (KP), two Enterobacter cloacae (EC) and two Serratia marcescens (SM). PMB was tested at concentrations 0,5, 1,0 and 2,0 μg/mL, whereas carbapenems and TGC were tested at a fixed concentration of 4.0 and 1.0 μg/mL, respectively. Tubes with inoculum and antibiotics were incubated at 35 °C and an aliquot was plated on blood agar plates at times: 0, 0.25, 1, 2, 4, 8, 12 and 24 hours for counting colonies. The results were interpreted according to the following definitions: i) bactericidal activity = ≥ 3 log10 reduction in total count of colony forming units (CFU)/mL compared to the initial inoculum; ii) bacteriostatic activity = maintenance or reduction < 3 log10 in total count of CFU/mL compared to the original inoculum; iii) synergism = ≥ 2 log10 decrease in total count of CFU/ml between the combination and the most active antimicrobial agent after 24 hours of incubation. According to our results, IPM, MEM and TGC showed no bacteriostatic or bactericidal effects when tested as a single drug against all KPC-2-producing isolates. All combinations of antibiotics showed synergism with bactericidal activity or at least, a bacteriostatic effect for all the six isolates. The more effective combinations were those that PMB was used at 1,0 and 2,0 μg/mL, combined with carbapenems. Although high minimum inhibitory concentrations were observed for PMB against isolates of SM, for both strains, synergism was observed when PMB was combined with IPM and MEM. Our results confirm the superiority of antimicrobial combinations compared to monotherapies and suggest that PMB combined with carbapenem or TCG can be an effective therapeutic option for the treatment of infections caused by KPC-2-producing Enterobacteriaceae.

Enterococcus são cocos gram-positivos que ocorrem isolados, aos pares (diplococos) ou em cadeias e pertencem à microbiota intestinal de uma grande variedade de hospedeiros, de mamíferos a insetos. Enterococcus foram originalmente considerados organismos de pouca importância clínica, mas têm se revelado importantes patógenos nosocomiais. O fato dos Enterococcus possuírem formas de resistência intrínseca e adquirida a vários antibióticos dificulta o tratamento de infecções causadas por eles. Enterococcus faecalis é geralmente a espécie predominante entre os enterococos isolados, sendo de 80% a 90% das amostras clínicas. O surgimento de Enterococcus resistentes à vancomicina (VRE- do inglês vancomycin resistant enterococci) reduziu significativamente as opções de tratamento. O objetivo deste estudo foi identificar e comparar amostras de E. faecalis resistentes à vancomicina (VREfs) isolados em pacientes nos anos de 2009 e 2011, durante um programa de vigilância no Hospital Risoleta Tolentino Neves, em Belo Horizonte, MG. A identificação das espécies foi feita por multiplex-PCR com primers espécie-específicos e os E. faecalis foram selecionados para estudo. Foram realizadas a pesquisa da presença dos genes elrA, cylLL, esp e gelE, a determinação do genótipo responsável pela resistência e a caracterização do transposon que contém o gene de resistência, todos por meio de PCR. Foi também realizada a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) de acordo com o CLSI (2013) para vancomicina, linezolida, tigeciclina e daptomicina e testes para resistência a altas concentrações de aminoglicosídeos. Por fim, a tipagem das amostras foi feita através de eletroforese em campo pulsado (PFGE- do inglês Pulsed Field Gel Eletroforesis) e MLST (Multilocus sequence typing). Foi encontrado que 22,2% dos VRE isolados em 2009 e 61,7% dos isolados em 2011 pertencem à espécie E. faecalis e estes foram utilizados no estudo. Houve surgimento de resistência à tigeciclina nos isolados de 2011, sendo 10 isolados resistentes, logo após o início do uso deste antimicrobiano no hospital. Foi encontrado um isolado de 2011 com resistência intermediária à linezolida. Todos os isolados foram sensíveis à daptomicina e altamente resistentes à vancomicina, com CIM maior que 256 &mu;g/mL. Essa alta resistência à vancomicina é condizente com o genótipo Vana, encontrado em todas as amostras. O perfil de virulência prevalente nos VREfs em 2009 era elrA+gelE+, sendo dos pulsotipos A1 e A4 e ST103. Apenas um isolado de 2009, com pulsotipo A1 apresentou o perfil de virulência cyl+elrA+gelE+. Em 2011, o perfil de virulência prevalente foi cyl+esp+elrA+gelE+, sendo que os 12 isolados com esse perfil pertenciam aos pulsotipos B e C e ST6, que ocorreram somente em isolados de 2011. Onze amostras de 2011 apresentaram o perfil elrA+gelE+ e foram classificadas no pulsotipo A e seis amostras tem perfil cyl+elrA+gelE+ e são dos pulsotipos B e D. Resultados de PFGE mostram a inserção no hospital da linhagem ST6, um clone multirresistente amplamente disseminado em hospitais da Itália, Portugal, Espanha e Estados Unidos. Concluiu-se que houve mudanças no perfil de E. faecalis resistentes à vancomicina no hospital, ao longo dos dois anos, com aumento de resistência e linhagens mais virulentas, sendo estes motivos de preocupação. / Enterococci are Gram-positive cocci occurring isolated, in pairs (diplococci) or chains and belong to the intestinal tract of a wide variety of hosts, from mammalian to insect. Enterococcus organisms were originally considered of little clinical importance, but have proved important nosocomial pathogens. The fact that Enterococcus possess intrinsic and acquired resistance to multiple antibiotics complicates the treatment of infections caused by them. Enterococcus faecalis is usually the predominant species among enterococci isolates, with 80% to 90% of the clinical samples. The emergence of vancomycin-resistant Enterococcus (VRE) significantly reduced the treatment options. The aim of this study was to identify and compare samples of vancomycin- resistant E. faecalis (VREfs) in patients in the years 2009 and 2011, during a surveillance program in Hospital Risoleta Tolentino Neves, Belo Horizonte, MG. Species identification was done by multiplex-PCR with primers species-specific and E. faecalis were selected for this study. Tests were conducted for the presence of genes elrA, cylLL, esp and gelE, the determination of the genotype responsible for the resistance and characterization of transposon containing the resistance gene, all by PCR. The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined according to the CLSI (2013) to vancomycin, linezolid, daptomycin and tigecycline and tests for resistance to high concentrations of aminoglycosides. Finally, the samples typing was performed by pulsed field gel electrophoresis (PFGE) and multilocus sequence typing (MLST). It was found that 22.2 % of VRE isolates in 2009 and 61.7 % of isolates in 2011 belong to the species E. faecalis and these were used in the study. There was emergence of tigecycline resistance in 2011, with 10 resistant isolates, after the introduction of this drug in the hospital. One isolate from 2011 showed intermediate resistance to linezolid. All isolates were sensitive to daptomycin and highly vancomycin resistant, with MICs greater than 256 mg / mL. This high resistance to vancomycin is consistent with the vanA genotype found in all samples. The virulence profile prevalent in VREfs in 2009 was elrA+gelE+, belonging to the pulsotypes A1 and A4 and ST103. Only one isolate from 2009, presented pulsotype A1 and the virulence profile cyl+elrA+gelE+. In 2011, the prevalent virulence profile was cyl+esp+elrA+gelE+, and the 12 isolates with this profile belonged to pulsotypes B and C and ST6, which occurred only in 2011 isolates. Eleven isolates from 2011 have the profile elrA+gelE+ and were classified as pulsotype A, six isolates have profile cyl+elrA+gelE+ and are of pulsotypes B and D. PFGE results show the insertion of ST6 lineage in the hospital, a multiresistant clone widely disseminated in hospitals in Italy, Portugal, Spain and the United States. It was concluded that there were changes in the profile of E. faecalis resistant to vancomycin in the hospital over the two years, with increased resistance and more virulent strains, which are of concern.

Enterobactérias como Klebsiella pneumoniae e Enterobacter spp. estão entre as principais causas de infecções hospitalares e estão frequentemente associadas à produção da enzima Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC). A emergência de isolados produtores desta e de outras carbapenemases é um grave problema de saúde pública uma vez que as opções terapêuticas tornam-se extremamente limitadas. As polimixinas frequentemente constituem uma das poucas opções disponíveis, porém têm sido associadas a menor eficácia clínica, maior mortalidade e toxicidade. Além disso, há descrição in vitro da emergência de subpopulações heterorresistentes de isolados expostos a esta droga. Neste contexto, muitos estudos têm avaliado a terapia combinada como alternativa e a utilização das polimixinas com outras classes de antimicrobianos tem mostrado resultados mais eficazes em comparação às monoterapias no tratamento de infecções causadas por bactérias multirresistentes, como aquelas produtoras KPC. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho de combinações entre polimixina B (PMB) com a tigeciclina (TGC) e com os carbapenêmicos imipenem (IPM) e meropenem (MEM) contra enterobactérias produtoras de KPC-2 pelo método de Time Kill Curves - TKC (Curva de Tempo-Morte). Os isolados foram previamente caracterizados como produtores de KPC-2 e incluíram seis clones de três espécies distintas, sendo dois isolados de K. pneumoniae (KP), dois de Enterobacter cloacae (EC) e dois de Serratia marcescens (SM), provenientes de banco de amostras. A PMB foi testada em concentrações de 0,5, 1,0 e 2,0 μg/mL, enquanto os carbapenêmicos e TGC foram testados a uma concentração fixa de 4,0 e 1,0 μg/mL, respectivamente. Os tubos contendo o inóculo e antibióticos foram incubados a 35 °C e uma alíquota foi semeada em placa de ágar sangue nos tempos: 0, 0,25, 1, 2, 4, 8, 12 e 24 horas, para a contagem das colônias. Os resultados foram interpretados conforme as seguintes definições: i) atividade bactericida = redução ≥ 3 log10 na contagem total de unidades formadoras de colônia (UFC)/mL comparado ao inóculo inicial; ii) atividade bacteriostática = manutenção ou redução < 3 log10 na contagem total de UFC/mL comparado ao inóculo original; iii) sinergismo = diminuição ≥ 2 log10 na contagem total de UFC/mL entre a combinação de antimicrobianos e o agente mais ativo, após 24 horas de incubação. De acordo com nossos resultados, IPM, MEM e TGC não apresentaram efeito bacteriostático ou bactericida quando testados como única droga contra todos os isolados produtores de KPC-2. Todas as combinações de antibióticos mostraram sinergismo com atividade bactericida ou, pelo menos, um efeito bacteriostático para todos os isolados testados, sendo as combinações mais efetivas aquelas onde a de PMB foi usada nas concentrações de 1,0 e 2,0 μg/mL e combinada aos carbapenêmicos. Embora tenham sido observadas concentrações inibitórias mínimas elevadas para PMB contra os isolados de SM, para ambas as cepas houve sinergismo quando a PMB foi combinada a IPM e MEM. Nossos resultados confirmam a superioridade das combinações de antimicrobianos em comparação às monoterapias e sugerem que, a PMB combinada com carbapenêmicos ou TCG pode ser uma opção terapêutica eficaz para o tratamento de infecções causadas por isolados de enterobactérias produtores de KPC-2. / Enterobacteria such as Klebsiella pneumoniae and Enterobacter spp. are among the leading causes of nosocomial infections and are often associated with Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) production. The emergence of KPC and other carbapenemases is a serious public health problem due to the limited therapeutic. Polymyxins often constitute one of the few options available, but it have been associated with lower clinical efficacy, toxicity and increased mortality. Moreover, several studies have demonstrated the emergence of heteroresistant subpopulations when isolates are exposed to this drug. In this context, some authors have evaluated the combined therapy as an alternative and the use of polymyxins with other classes of antibiotics have shown to be more effective compared to the monotherapies for the treatment of infections caused by multiresistant bacteria. Therefore, the aim of this study was to evaluate the performance of polymyxin B (PMB) with carbapenems imipenem (IPM) and meropenem (MEM) and tigecycline (TGC) combinations against KPC-2 producing Enterobacteriaceae by Time Kill Curves method. Isolates were previously characterized as KPC-2 producing comprising six distinct clones that included: two K. pneumoniae (KP), two Enterobacter cloacae (EC) and two Serratia marcescens (SM). PMB was tested at concentrations 0,5, 1,0 and 2,0 μg/mL, whereas carbapenems and TGC were tested at a fixed concentration of 4.0 and 1.0 μg/mL, respectively. Tubes with inoculum and antibiotics were incubated at 35 °C and an aliquot was plated on blood agar plates at times: 0, 0.25, 1, 2, 4, 8, 12 and 24 hours for counting colonies. The results were interpreted according to the following definitions: i) bactericidal activity = ≥ 3 log10 reduction in total count of colony forming units (CFU)/mL compared to the initial inoculum; ii) bacteriostatic activity = maintenance or reduction < 3 log10 in total count of CFU/mL compared to the original inoculum; iii) synergism = ≥ 2 log10 decrease in total count of CFU/ml between the combination and the most active antimicrobial agent after 24 hours of incubation. According to our results, IPM, MEM and TGC showed no bacteriostatic or bactericidal effects when tested as a single drug against all KPC-2-producing isolates. All combinations of antibiotics showed synergism with bactericidal activity or at least, a bacteriostatic effect for all the six isolates. The more effective combinations were those that PMB was used at 1,0 and 2,0 μg/mL, combined with carbapenems. Although high minimum inhibitory concentrations were observed for PMB against isolates of SM, for both strains, synergism was observed when PMB was combined with IPM and MEM. Our results confirm the superiority of antimicrobial combinations compared to monotherapies and suggest that PMB combined with carbapenem or TCG can be an effective therapeutic option for the treatment of infections caused by KPC-2-producing Enterobacteriaceae.