Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-14T11:25:50Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 17567 bytes, checksum: 5e91367d9657bfdf1b270599b24d4f36 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-14T11:25:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 17567 bytes, checksum: 5e91367d9657bfdf1b270599b24d4f36 (MD5) Previous issue date: 2004-08-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Métodos alternativos ao uso de ionóforos têm sido sugeridos para a manipulação da fermentação ruminal. Ácidos orgânicos têm sido utilizados com sucesso para esse objetivo, mas a baixa disponibilidade destes compostos pode inviabilizar a sua aplicação in vivo. Entretanto, o uso de substratos baratos e de alta disponibilidade para a produção de ácido propiônico e outros produtos fermentativos usados como substratos gliconeogênicos pode reduzir este problema. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar bactérias produtoras de ácido propiônico do rúmen de bovinos que fossem capazes de usar soro de queijo como substrato para a fermentação. Dezenove bactérias foram isoladas do rúmen de bovinos capazes de fermentar lactose e converter lactato em ácido propiônico. Um dos dezenove isolados, isolado P01, apresentou elevada produção de biomassa e alto rendimento de propionato, sendo selecionado para posterior caracterização. O isolado P01 foi caracterizado como bactéria Gram-positiva, de forma esférica e que apresenta arranjos em diplococos ou cadeias longas. O isolado P01 apresentou velocidade específica de crescimento em lactato de aproximadamente 0,300 h -1 , utilizou vários substratos (lactose, sacarose, celobiose, maltose, xilose e glicose) como fonte de carbono e mostrou-se resistente a altas concentrações de lactose, lactato e ácido propiônico. Esse microrganismo foi capaz de crescer mesmo em concentrações de até 160 μmol/L de monensina ou lasalocida. O isolado P01 produziu até 17,8 g/L de ácido propiônico e 11,2 g/L de acético a partir de soro de queijo ultrafiltrado contendo cerca de 4,0 % de sólidos (36 g/L de lactose). A incorporação de soro fermentado ao líquido de rúmen aumentou a digestibilidade de forrageiras em até 11 %, elevou a concentração de ácidos orgânicos totais em até 15 % e reduziu a relação acetato/propionato em cerca de 23 %. A presença do soro fermentado não teve efeito significativo sobre a concentração de proteína microbiana, mas promoveu o aumento da produção de amônia in vitro. / Organic acids have been used as an alternative to ionophores to manipulate ruminal fermentation, but some organic acids tested as feed additives are not readily available and their application in vivo may be limited. However, the use of abundant, low-cost substrates to produce propionic acid and other fermentation products that are used as gluconeogenic substrates by the ruminant could lessen this problem. This work aimed to isolate and characterize propionic acid-producing bacteria from the rumen of cattle that used cheese whey as substrate for fermentation. Nineteen bacteria were isolated from the bovine rumen that could convert lactose and lactate to propionic acid as their major fermentation product. The isolate showing the greatest biomass and propionate production (isolate P01) was selected for further characterization. The isolate P01 was Gram-positive cocci, arranged as diplococcus or in long chains. The isolate P01 had a growth rate in lactate and lactose around 0,300 h -1 , could use several sugars as carbon source (sucrose, cellobiose, maltose, xylose e glucose), and was not severely affected by high concentrations of substrates (lactose and lactate) or propionic acid. The isolate P01 grew at concentrations of monensin and lasalocid that inhibited other Gram-positive ruminal bacteria, and even concentrations as high as 160 μmol/L did not prevent cell xiiigrowth. The isolate P01 fermented cheese whey containing approximately 36 g/L of lactose and produced up to 17,8 g and 11,2 g per liter of propionate and acetic acid, respectively. Addition of fermented cheese whey (10% ratio) to ruminal fluid increased forage digestibility by 11 %, decreased the acetate to propionate ratio up to 23 % and increased total volatile fatty acids approximately 15 %. The fermented cheese whey had no significative impact on microbial protein concentration, but increased ammonia production in vitro. These results indicate that isolate P01 can ferment cheese whey lactose and the fermented product generated might improve ruminal fermentation in vitro.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In vitro assays were conducted to develop a method to estimate activity of bacterial enzymes in the rumen and the effect of changes in pH (5.5, 6.0, 6.5 and 7.0) and concentration of soluble carbohydrates (0, 100, 200 and 300 mg / dl) on adhesion to forage particles and ruminal bacterial fibrolytic activity. To evaluate the enzymatic extraction methods, samples of ryegrass (Lolium multiflorum) were incubated in a bovine rumen during 24-h and used to obtain enzymatic extracts through different extraction methods: sonication, sonication + lyzozyme, lyzozyme and without previous treatment (control). Then, the enzymatic extract was incubated with carboxymethylcelullose (CMC) and measured the reducing liberated sugars. The enzymatic extraction method did not affect significantly the enzymatic activity, but the standard deviation was lower when extraction only was through sonication. In another methodological assay, the effect of the reaction time between enzymatic extract and substrate on relative enzymatic activity (nmol of reducing sugars/ g DM of sample residue/ min) was tested. The relative activity decreased exponentially with time and stabilized after 240-min of incubation. To evaluate the effects of pH and concentration of sugars on bacterial attachment to feed particles and his degradability, samples of ryegrass (Lolium multiflorum) or cynodon (Cynodon dactilon) were incubated in vitro for 24-h in mediums with different pH (5,5; 6,0; 6,5 or 7,0) or different initial concentrations of glucose (0, 100, 200 and 300 mg/dl). The DM and phosphorus content (phosphorus was assumed be of bacterial origin) were determined in the fermentation residue. In ryegrass samples degradability and the residual phosphorus content were higher than in cynodon (P<0.01) and both factors were affected linearly and positively by pH (<0.01). The increase of soluble carbohydrates concentration exerted linear and negative effects on bacterial attachment (P<0.01), but it did not affected forage degradability. The effect of pH and sugar concentration was evaluated on fibrolityc enzyme activity in residues of the samples incubated in the rumen for 24-h and extracted through sonication. The enzymatic extract was incubated for 240-min with xylan or CMC in reaction mediums with different pH or sugar concentrations. In average, the activity of the enzymes extracted from the ryegrass residue was superior to the cynodon ones (P<0.01). On the other hand, the effect of both factors varied among assays and with the sample type, e.g. in different assays was observed that the pH effect was linear (P<0.05), quadratic (P<0.05) or even do not adjusted to none of the regressions. In the same way, the effect of presence of different concentrations of sugars in the medium on enzyme activity was quadratic mainly (P<0.01). In conclusion, the bacterial attachment to the forage particles was related directly to pH and inversely with concentration of soluble sugars in the incubation medium. However, these effects were less evident on enzymatic fibrolytic activity. / Ensaios in vitro foram conduzidos com o objetivo de desenvolver um método para estimar atividade de enzimas bacterianas do rúmen e avaliar os efeitos da alteração no pH e na concentração de carboidratos solúveis sobre a aderência às partículas de forragem e sobre a atividade fibrolítica bacteriana ruminal. Para avaliação de métodos de extração enzimática, amostras de azevém (lolium multiflorum) foram incubadas no rúmen de um bovino durante 24 horas e utilizadas para obtenção de extratos enzimáticos por diferentes métodos de extração: sonicação, sonicação + lisozima, lisozima e sem tratamento prévio (controle). O extrato enzimático foi então incubado com carboximetilcelulose (CMC) e medido a liberação de açúcares redutores. O método de extração de enzimas não afetou significativamente a atividade enzimática, mas o desvio padrão foi menor quando a extração foi somente por sonicação. Em outro ensaio metodológico foi testado o efeito do tempo de reação entre extrato enzimático e substrato sobre a atividade relativa das enzimas (nmol de açúcares redutores/g de matéria seca de resíduo de amostra/minuto). A atividade relativa diminuiu exponencialmente com o tempo, estabilizando-se a partir de 240 minutos de incubação. Para avaliar o efeito do pH e da concentração de açúcares sobre a aderência bacteriana às partículas de alimento e sobre a sua degradabilidade, amostras de azevém (Lolium multiflorum) ou cynodon (Cynodon dactilon) foram incubadas in vitro durante 24h em meios com diferentes pHs (5,5; 6,0; 6,5 ou 7,0) ou diferentes concentrações iniciais de glicose (0, 100, 200 e 300 mg/dl). No resíduo da fermentação foi determinado o teor de matéria seca e analisado o teor de P, assumindo-se ser de origem bacteriana. A degradabilidade e o teor de P residual foram mais altos nas amostras de azevém que de cynodon (P<0,01) e ambos fatores foram linearmente e positivamente afetados pelo pH (P<0,01). O aumento da concentração de carboidratos solúveis exerceu efeito linear e negativo sobre a aderência das bactérias (P<0,01), mas não afetou a degradação da forragem. O efeito do pH e da concentração de açúcares sobre a atividade enzimática fibrolítica foi avaliada no resíduo destas amostras forrageiras incubadas ruminalmente durante 24h e extraídas por sonicação. O extrato enzimático foi incubado durante 240 minutos com xilana ou CMC em meios de reação a diferentes pHs ou concentração de açúcares. Em média, a atividade de enzimas extraídas de resíduo de azevém foi superior à atividade daquelas oriundas de cynodon (P<0,01). No entanto, o efeito de ambos fatores variou entre ensaios e com o tipo de amostra. Por exemplo, em diferentes ensaios foi observado que o efeito de pH foi linear (P<0,05), quadrático (P<0,05) ou mesmo não foi ajustado à nenhuma destas regressões. Da mesma forma, a presença de diferentes concentrações de açúcares no meio exerceu efeito, na maioria das vezes quadrático, sobre a atividade enzimática (P<0,01). Em conclusão, a aderência bacteriana às partículas de forragem foi diretamente relacionada com o pH e inversamente relacionada com a concentração de açúcares solúveis no meio de incubação. Estes efeitos, contudo, foram menos evidentes sobre a atividade enzimática fibrolítica.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In vitro assays were conducted to evaluate the use of potential markers of bacterial adherence to particles of forage, in which samples of ryegrass (Lolium multiflorum), Cynodon spp., alfalfa (Medicago sativa) and perennial peanut (Arachis pintoi) were incubated for 24 hours. In the residue of incubation were analyzed the digestibility of dry matter and concentrations of markers of adherence: N15, purines, phosphorus (P) and enzymatic activity and its variables. Incubations were performed to evaluate the degree of phosphorus solubilization from the forage samples over 24 hours and samples of ruminal digesta were collected in order to isolate rumen bacteria and analyzing the chemical composition of the liquid phase associated bacteria (LAB) and bacteria adhered to particle (BAP). It was also assessed whether methylcellulose, used in the extraction of the BAP process, interfere with the chemical composition of bacteria extracted. Data were analyzed using a model that included the type of sample or bacteria as a block (randomized blocks). The results of the solubility test indicated that at the first 3 hours of incubation the concentration of phosphorus in the samples dropped sharply and thereafter tended to remain constant. There was difference (P <0.05) in the chemical composition of the BAP and BAL in relation to concentration of nitrogen, purine, DAPA and phosphorus. The data obtained from the trials evaluating the effect of methylcellulose on the chemical composition of bacteria associated with the liquid phase showed that the levels of nitrogen and purine when expressed in proportion of organic matter were not affected by treatment with methylcellulose (P> 0.05). However, a difference was observed in relation to the content of P (P <0.05). No correlation was observed between digestibility and bacterial adhesion markers and between the markers indicated correlation between N15 and reducing sugars with the substrate carboxymethylcellulose (P = 0.001), and N15 with reducing sugars substrate xylan (P <0.0001). In conclusion, the chemical composition of the liquid phase bacteria associated differs from the adherent bacteria and particulate material in general was not affected by treatment with methylcellulose. The concentration of the tested markers showed no consistent correlation between themselves or with the degradability of forage samples. The exception was the relationship between N15 and enzymatic activity, indicating that the isotope was incorporated mainly in bacterial enzymatic proteins / Foram conduzidos ensaios de digestibilidade in vitro com o objetivo de avaliar o uso de potenciais marcadores de aderência bacteriana a partículas de forragens, nos quais foram incubadas amostras de azevém (Lolium multiflorum), Cynodon spp., alfafa (Medicago sativa) e amendoim forrageiro (Arachis pintoi) por 24 horas. Nos resíduos da incubação foram analisados a digestibilidade da matéria seca e a concentração dos marcadores de aderência: N15, purinas, fósforo (P) e atividade enzimática e suas variáveis. Foram realizadas incubações para avaliar o grau de solubilização do fósforo de amostras de forragem ao longo de 24 horas e coletas de digesta ruminal com o objetivo de isolar bactérias ruminais e analisar a composição química das bactérias associadas à fase líquida (BAL) e bactérias aderidas à partícula (BAP). Também foi avaliado se a metilcelulose, utilizada no processo de extração das BAP, interfere na composição química das bactérias extraídas. Os dados foram analisados utilizando modelos que incluíram o tipo de amostra ou de bactéria como bloco (blocos ao acaso). Os resultados do teste de solubilização do fósforo indicam que nas primeiras 3 horas de incubação as concentrações de fósforo nas amostras diminuíram de forma acentuada e após esse período tenderam a permanecer constantes. Verificou-se diferença (P<0,05) na composição química das BAP e BAL em relação aos teores de nitrogênio, purinas, DAPA e fósforo. Os dados obtidos com os ensaios avaliando o efeito da metilcelulose na composição química das bactérias associadas à fase líquida demonstraram que os teores de nitrogênio e purinas quando expressos na proporção de matéria orgânica não foram afetados pelo tratamento com metilcelulose (P>0,05). No entanto, observou-se diferença em relação ao teor de P (P<0,05). Não foi observada correlação entre digestibilidadede e os marcadores de aderência bacteriana e entre os marcadores de aderência indicou correlação entre N15 e açúcares redutores com substrato carboximetilcelulose e (P=0,001), N15 e açúcares redutores com substrato xilano (P<0,0001). Concluiu-se que a composição química das bactérias associadas a fase líquida difere das bactérias aderidas a partículas de forragem e, em geral, não é afetada pelo tratamento com metilcelulose. A concentração dos marcadores testados não apresentou correlação consistente entre si ou com a degradabilidade das amostras de forragem. Exceção foi a relação entre N15 e atividade enzimática, indicando que o isótopo foi incorporado principalmente em proteínas enzimáticas bacterianas.

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O uso de leveduras, por exemplo, têm sido uma boa alternativa para tentar melhorar o ambiente ruminal e facilitar às adaptações da microbiota a nova dieta. O objetivo do estudo foi avaliar os efeitos da suplementação de uma associação de levedura viva e hidrolisada nos marcadores metabólicos e do fluído ruminal de vacas leiterias durante o período de transição. O experimento foi conduzido em um sistema semi-extensivo, utilizando-se 20 vacas da raça Holandesa, divididas igualmente em grupo controle (GC) e grupo Suplementado (GS). O GS recebeu adição diária de 28g/animal/dia da associação de levedura S. cerevisiae desde os 20 ± 2 dias pré-parto até o início da lactação (18 ± 3 dias). As coletas de amostras de fluído ruminal e de sangue foram realizadas no pré-parto, e durante seis dias após o parto. No liquido ruminal foi avaliado o pH, Tempo de redução do azul de metileno, contagem de protozoários e avaliação morfo-tintorial das bactérias. No soro sanguíneo foram determinadas as concentrações de ácidos graxos não esterificados (AGNE’s), albumina e ureia. No metabolismo energético, os AGNE’s diminuíram durante o período do colostro nos animais suplementados, assim como a albumina e ureia no período da lactação. Houve mudança no ambiente bacteriano ruminal nos animais suplementados, ocorrendo um predomínio de bactérias Gram negativas. No ambiente ruminal as bactérias Gram negativas aumentaram significativamente no GS durante a lactação. Concluiu-se que a suplementação com uma associação de levedura viva e hidrolisada em vacas durante o período de transição pode influenciar positivamente o metabolismo energético e proteico assim como o ambiente bacteriano ruminal no início da lactação. / The period of greatest susceptibility to disease in intensive milk production systems is during the transition period, which corresponds to three weeks before up to three weeks after delivery. The same is characterized by a negative energy balance due to body fat mobilization and changes in the rumen by the sudden introduction of grain in the diet. In order to reduce the effects of negative energy balance and increase milk production, some measures have been taken into account in nutritional management during the transition period. The use of yeast, for example, have been a good alternative to improve the rumen and facilitating adjustment of the microbiotato the new diet. The aim of the study was to evaluate the effects of association of live and hydrolyzed yeast in the metabolic markers and ruminal fluid examination of dairy cows during the transition period. The experiment was conducted in a semi extensive system, using 20 Holstein cows, divided equally into control group (CG) and Supplemented group (SG). The SG received daily addition of 28 g / animal / day of S. cerevisiae yeast association from 20 ± 2 days pre-calving until early lactation (18 ± 3 days). The collections of rumen fluid and blood samples were performed during labor, and for six days after delivery. In ruminal fluid was evaluated pH, time of blue methylene reduction, protozoa count and morpho-dye bacteria evaluation. Serum concentrations of non-esterified fatty acids (NEFA's), albumin and urea were determined. There was a change in rumen bacterial environment in the supplemented animals, experiencing a predominance of gram negative. The number of Gram negative bacteria increased significantly in GS during lactation. In energy metabolism, the NEFA's decreased over the period of colostrum in the supplemented animals as well as albumin and urea in the period of lactation. We conclude that supplementation of an association of live and hydrolyzed yeast to cows during the transition period can positively influence the energy and protein metabolism as well as the rumen bacterial environment in early lactation.