Orientador: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Banca: Maria José Valarini / Banca: Norma Gouvêa Rumjanek / Banca: Lúcia Maria Carareto Alves / Banca: Fátima Maria de Souza Moreira / Resumo: O nitrogênio é o nutriente requerido em maior quantidade para a cultura da soja. Avanços nas pesquisas de melhoramento genético vegetal e microbiologia do solo permitiram expandir o uso de inoculantes comerciais contendo estirpes de Bradyrhizobium japonicum e Bradyrhizobium elkanii. Estas bactérias infectam as raízes da planta e induzem a formação de nódulos, que abrigam a forma bacterióide, diferenciada da bactéria, responsável pela fixação simbiótica do nitrogênio. Informações sobre processos bioquímicos envolvidos no metabolismo da relação simbiótica podem ser adquiridas através de análises globais de expressão gênica. Para esta finalidade, destaca-se a tecnologia de microarranjo de DNA para detecção de genes diferencialmente expressos em larga escala. O objetivo geral deste trabalho foi identificar genes diferencialmente expressos, por meio de microarranjos de DNA, em Bradyrhizobium elkanii SEMIA 587 cultivada em diferentes meios de cultura, RDM (Rhizobia Defined Medium), TY (Triptone-Yeast Medium) e YMB (Yeast-Mannitol Medium), e em bacterióides isolados de nódulos de soja em diferentes períodos de desenvolvimento, 13, 28 e 48 dias após inoculação. Para esta finalidade, a partir do seqüenciamento de DNA genômico de B. elkanii, um microarranjo (Be587) foi gerado contendo 2654 genes. Em meio RDM, a bactéria confrontou-se com a necessidade de se adaptar e sintetizar suas subunidades formadoras de macromoléculas a partir de uma única fonte de carbono, refletindo em um metabolismo mais ativo nas fases lag e log. Por outro lado, em meio TY, as células cultivadas na presença de uma boa fonte de carbono e energia cresceram rapidamente esgotando os recursos disponíveis no meio, 8 o que pode ter causado uma situação de estresse que se refletiu na identificação... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nitrogen is the most required nutrient by soybean culture. Advanced researches in genetic plant breeding and soil microbiology allowed the expansion in commercial inoculants applications containing strains of Bradyrhizobium japonicum and Bradyrhizobium elkanii. These bacteria infect plant roots and induce nodule formation which home the differentiated bacteria, named bacteroid. The bacteroid in turn is responsible for symbiotic nitrogen fixation. Biochemical knowledge about processes of symbiotic regulation can be acquired by global analysis of gene expression. To achieve such information, the DNA microarray technology, used for detection of differentially expressed genes in large scale, was used. The purpose of this work was identificate differentially expressed genes of Bradyrhizobium elkanii SEMIA 587, grown under different media conditions, such as RDM (Rhizobia Defined Medium), TY (Triptone- Yeast Medium) and YMB (Yeast-Mannitol Medium), and in bacteroids from soybean nodules at different developmental stages, 13, 28 e 49 days after inoculation. For this purpose, the DNA microarray Be587 with 2654 genes was generated from B. elkanii genomic DNA. In RDM medium the bacterium was confronted with the need of adaptation and building of macromolecules subunits from a single carbon source, what was reflected in a more active metabolism in lag and log phases. In turn, in TY medium with good carbon and energy sources the cells grew fastly and exhaust the medium sources available. Such condition can submitted the bacterial cells to a stress condition that reflected in the identification of higher number differentially expressed genes. At different bacteroids stages, the analysis detected genes related to nodulation and 10 nitrogen fixation regulation more than structural genes. Inasmuch, an organic nitrogen recycle might be involved... (Complete abstract, click electronic access below) / Doutor

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A emergÃncia de mocroorganismos resistente a multidrogas, tais como Staphylococcus aureus as resistentes a meticilina, Enterococcus resistente a vancomicina, e Mycobacterium tuberculosis resistente a drogas, tem incitado esforÃospara desenvolver e pesquisar novas classes de antibiÃticos que possam ter utilidade clÃnica. Nos Ãltimos anos, uma variedade de antibiÃticos de baixo peso molecular tÃm sido isolados de diversas espÃcies animais. Estes agentes incluem peptÃdeos, lipÃdios, e alcalÃides, exibem atividade antibiÃtica contra micrÃbios do meio ambiente e considera-se que desempenhem um papel na imunidade inata. Compostos com largo espectro de atividade antimicrobiana que sÃo sintetizados pelas glÃndulas granulares presentes na pele de anuras (rÃs e sapos) tÃm recebido uma crescente atenÃÃo como agentes terapÃuticos em potencial. NÃs relatamos aqui a descoberta de um antibiÃtico esteroidal de atividade de largo espectro, bufadienolÃdeos, chamados hellebrigenin, telocinobufagin, marinobufagin e bufalin de Bufo schneideri, um sapo Brasileiro, com atividade inibitÃria diferenciada contra sete microorganismos e nenhuma atividade contra Pseudomonas aeruginosa. A secreÃÃo da pele do sapo foi obtida porcompressÃo manual das glÃndulas paracnemis e tibial. Tr~e peptÃdeos com estruta possivelmente relacionada com uma potente atividade inibitÃria para bactÃria gram positiva, Staphylococcus aureus e uma potente proteÃna com forte atividade antimicrobiana contra Pseudomonas aeruginosa (MIC = 9,64 microg/ml) foi isolada com secreÃÃes da pele de Leptodactylus pentadactylus estimuladas por adrenalina obtidas por injeÃÃo subcutÃnea de 500 micro l (100 microg/ml) e caracterizada. Os bufadienolÃdeos foram obtidos com separaÃÃo em CLAE de fase reversa sendo executado utilizando-se uma coluna C-18 (15 micro m, 100 Ao, Shim-pack PREP 250 mm x 25 mm) com um gradiente de 0-40 % de acetonitrila/Ãgua e 0,05 % de Ãcido trifluoroacÃtico. AnÃlise de NMR de alta resoluÃÃo das amostras purificadas por aplicaÃÃo de seqÃÃncia de pulsos modernos tais como 1H, 1H-COSY e NOESY, e determinaÃÃo da correlaÃÃo heteronuclear dos carbono-hidrogÃnio ligados diretamente 1H, 13C-COSY (HETCOR) e via detecÃÃo do hidrogÃnio inversa (HMQC), bem como o seqÃenciamento a longa distÃncia, COLOC e HMBC, permitindo assim sua identificaÃÃo como um esterÃide do tipo bufodienolÃdeo. A proteÃna de L. pentadactylus foi purificada por cromatografia em Sephacryl S-400 (460 mm x 6 mm) eluÃda com um tampÃo (Tris â HCl 0,05 N) e sua pureza foi avaliada poreletroforese em condiÃÃes desnayurantes e nÃo desnaturantes.A proteÃna total foi determinada pelo mÃtodo de Bradford usando albumina soro bovina como padrÃo. O isolamento dos peptÃdeos foi efetuado usando-se o exsudato liofilizado e redissolvendo em Ãgua bidestilada/TFA 0,05 % (20:1; P:V) e corrido numa coluna C18 de fase reversa em CLAE (15 micro m, 100 Ao, Shim-pack PREP 250 mm x 25 mm) eluÃda com um gradiente linear de 5 - 80% em 103 min num fluxo de 5 ml/min com acetonitrila/Ãgua e Ãcido trifluoroacÃtico 0.05 %. A atividade antimicrobiana de todas as amostras foi monitorada pelos mÃtodos de Bauer â Kirby e placa de microdiluiÃÃo padrÃousando Escherichia coli ATCC 25922, Enterobacter aerogenes ATCC 1304, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Salmonella choleraesus choleraesus var typhi ATCC 6534, Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538 P e Pseudomonas aeruginosa HUWC 1. No primeiro mÃtodo, cada placa com agar MÃeller âHinton apÃs promover incubaÃÃo por 24 h a 35 ÂC. As zonas claras na superfÃcie do agar foram tomadas como indicativoda atividade antibacteriana. O diÃmetro destas foram mensuradas e a atividade foi expressa em Ãrea das zonas claras (mm2). As incubaÃÃes com os microorganismos foram feitas em caldo de B.H.I. por diferentes tempos atà 24 h a 35ÂC e estimada a influÃncia da desnaturaÃÃo na atividade das amostras protÃicas. ApÃs incubaÃÃo, na absorbÃncia de 492 nm cada poÃo foi determinado usando-se um Detector Shimadzu UV â VS modelo SPD - 10A VP. A mÃnima concentraÃÃo inibitÃria (MICs) se possÃvel foi determinada pelo mÃtodo da microdiluiÃÃo padrÃo. Todos os procedimentos foram executados de acordo com os manuais de instruÃÃo do Comità National de PadronizaÃÃo para LaboratÃrios ClÃnicos (Wayne, PA, USA). A hemÃlise induzida por amostras foi determinada por incubaÃÃo de uma suspensÃo 5% (v/v) de hemÃcias humanas dos tipos antigÃnicos A e O, rato e caprinos em tampÃo fosfato - salina com quantidades apropriadas das amostras a 37 ÂC atà 24 h. O sobrenadante foi mensurado em densidade optical a 541 nm. Esta foi comparada a uma suspensÃo tratada com detergente a 0,1 % com agitaÃÃo enÃrgica e definido o % de hemÃlise. Todos os compostos manifestaram moderado ou nenhuma atividade hemolÃtica. A proteÃna de L. pentadactylus apresentou uma concentraÃÃo hemolÃtica mÃnima de 2,09 x 10-4, 1,34x10-2, 1,07x10-1 e 1,34x10-2 microgramas para rato, caprino, tipos antigÃnicos humanos A e O humanos respectivamente. Sob refrigeraÃÃo estes valores decrescem. Para analisar interrelaÃÃo entre a assimetria e mecanismos, estimativa de parÃmetros cinÃticos foram obtidos pelos modelos matemÃticos de equaÃÃes de Gompertz e regressÃo nÃo linear, ANOVA e teste de comparaÃÃo mÃltipla de Tukey / A emergÃncia de mocroorganismos resistente a multidrogas, tais como Staphylococcus aureus as resistentes a meticilina, Enterococcus resistente a vancomicina, e Mycobacterium tuberculosis resistente a drogas, tem incitado esforÃospara desenvolver e pesquisar novas classes de antibiÃticos que possam ter utilidade clÃnica. Nos Ãltimos anos, uma variedade de antibiÃticos de baixo peso molecular tÃm sido isolados de diversas espÃcies animais. Estes agentes incluem peptÃdeos, lipÃdios, e alcalÃides, exibem atividade antibiÃtica contra micrÃbios do meio ambiente e considera-se que desempenhem um papel na imunidade inata. Compostos com largo espectro de atividade antimicrobiana que sÃo sintetizados pelas glÃndulas granulares presentes na pele de anuras (rÃs e sapos) tÃm recebido uma crescente atenÃÃo como agentes terapÃuticos em potencial. NÃs relatamos aqui a descoberta de um antibiÃtico esteroidal de atividade de largo espectro, bufadienolÃdeos, chamados hellebrigenin, telocinobufagin, marinobufagin e bufalin de Bufo schneideri, um sapo Brasileiro, com atividade inibitÃria diferenciada contra sete microorganismos e nenhuma atividade contra Pseudomonas aeruginosa. A secreÃÃo da pele do sapo foi obtida porcompressÃo manual das glÃndulas paracnemis e tibial. Tr~e peptÃdeos com estruta possivelmente relacionada com uma potente atividade inibitÃria para bactÃria gram positiva, Staphylococcus aureus e uma potente proteÃna com forte atividade antimicrobiana contra Pseudomonas aeruginosa (MIC = 9,64 microg/ml) foi isolada com secreÃÃes da pele de Leptodactylus pentadactylus estimuladas por adrenalina obtidas por injeÃÃo subcutÃnea de 500 micro l (100 microg/ml) e caracterizada. Os bufadienolÃdeos foram obtidos com separaÃÃo em CLAE de fase reversa sendo executado utilizando-se uma coluna C-18 (15 micro m, 100 Ao, Shim-pack PREP 250 mm x 25 mm) com um gradiente de 0-40 % de acetonitrila/Ãgua e 0,05 % de Ãcido trifluoroacÃtico. AnÃlise de NMR de alta resoluÃÃo das amostras purificadas por aplicaÃÃo de seqÃÃncia de pulsos modernos tais como 1H, 1H-COSY e NOESY, e determinaÃÃo da correlaÃÃo heteronuclear dos carbono-hidrogÃnio ligados diretamente 1H, 13C-COSY (HETCOR) e via detecÃÃo do hidrogÃnio inversa (HMQC), bem como o seqÃenciamento a longa distÃncia, COLOC e HMBC, permitindo assim sua identificaÃÃo como um esterÃide do tipo bufodienolÃdeo. A proteÃna de L. pentadactylus foi purificada por cromatografia em Sephacryl S-400 (460 mm x 6 mm) eluÃda com um tampÃo (Tris â HCl 0,05 N) e sua pureza foi avaliada poreletroforese em condiÃÃes desnayurantes e nÃo desnaturantes.A proteÃna total foi determinada pelo mÃtodo de Bradford usando albumina soro bovina como padrÃo. O isolamento dos peptÃdeos foi efetuado usando-se o exsudato liofilizado e redissolvendo em Ãgua bidestilada/TFA 0,05 % (20:1; P:V) e corrido numa coluna C18 de fase reversa em CLAE (15 micro m, 100 Ao, Shim-pack PREP 250 mm x 25 mm) eluÃda com um gradiente linear de 5 - 80% em 103 min num fluxo de 5 ml/min com acetonitrila/Ãgua e Ãcido trifluoroacÃtico 0.05 %. A atividade antimicrobiana de todas as amostras foi monitorada pelos mÃtodos de Bauer â Kirby e placa de microdiluiÃÃo padrÃousando Escherichia coli ATCC 25922, Enterobacter aerogenes ATCC 1304, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Salmonella choleraesus choleraesus var typhi ATCC 6534, Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538 P e Pseudomonas aeruginosa HUWC 1. No primeiro mÃtodo, cada placa com agar MÃeller âHinton apÃs promover incubaÃÃo por 24 h a 35 ÂC. As zonas claras na superfÃcie do agar foram tomadas como indicativoda atividade antibacteriana. O diÃmetro destas foram mensuradas e a atividade foi expressa em Ãrea das zonas claras (mm2). As incubaÃÃes com os microorganismos foram feitas em caldo de B.H.I. por diferentes tempos atà 24 h a 35ÂC e estimada a influÃncia da desnaturaÃÃo na atividade das amostras protÃicas. ApÃs incubaÃÃo, na absorbÃncia de 492 nm cada poÃo foi determinado usando-se um Detector Shimadzu UV â VS modelo SPD - 10A VP. A mÃnima concentraÃÃo inibitÃria (MICs) se possÃvel foi determinada pelo mÃtodo da microdiluiÃÃo padrÃo. Todos os procedimentos foram executados de acordo com os manuais de instruÃÃo do Comità National de PadronizaÃÃo para LaboratÃrios ClÃnicos (Wayne, PA, USA). A hemÃlise induzida por amostras foi determinada por incubaÃÃo de uma suspensÃo 5% (v/v) de hemÃcias humanas dos tipos antigÃnicos A e O, rato e caprinos em tampÃo fosfato - salina com quantidades apropriadas das amostras a 37 ÂC atà 24 h. O sobrenadante foi mensurado em densidade optical a 541 nm. Esta foi comparada a uma suspensÃo tratada com detergente a 0,1 % com agitaÃÃo enÃrgica e definido o % de hemÃlise. Todos os compostos manifestaram moderado ou nenhuma atividade hemolÃtica. A proteÃna de L. pentadactylus apresentou uma concentraÃÃo hemolÃtica mÃnima de 2,09 x 10-4, 1,34x10-2, 1,07x10-1 e 1,34x10-2 microgramas para rato, caprino, tipos antigÃnicos humanos A e O humanos respectivamente. Sob refrigeraÃÃo estes valores decrescem. Para analisar interrelaÃÃo entre a assimetria e mecanismos, estimativa de parÃmetros cinÃticos foram obtidos pelos modelos matemÃticos de equaÃÃes de Gompertz e regressÃo nÃo linear, ANOVA e teste de comparaÃÃo mÃltipla de Tukey

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T04:53:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Negri_VictorAugusti_M.pdf: 12106388 bytes, checksum: d15b4a2052af5e412ac086681ebf3a4b (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Propionibacterium acidipropionici é uma bactéria gram-positiva que apresenta a capacidade de produzir ácido propiônico em sua via fermentativa, composto de grande importância na indústria petroquímica e alimentícia. Tendo-se em vista que esse ácido é hoje obtido através de derivados do petróleo, P. acidipropionici vem sendo apontada como uma potencial plataforma industrial na produção de ácido propiônico. Uma das características que enfatizam a sua utilização está a sua capacidade em fixar CO2 e direcioná-lo para a produção de ácido propiônico. Entretanto, pouco se sabe sobre esse fenômeno em propionibactérias. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar e estudar o metabolismo de assimilação de CO2 em P. acidipropionici, visando avaliar a relevância do mesmo na fermentação desta bactéria. Através da análise do genoma e resultados prévios de expressão global foram identificados potenciais genes envolvidos tanto na assimilação de CO2 quanto na produção de ácido propiônico, destacando-se a enzima piruvato carboxilase como uma importante candidata envolvida na fixação de CO2. Dados de expressão dessa enzima indicaram que a mesma tem sua expressão aumentada quando a bactéria é cultivada em glicerol como fonte de carbono, condição em que há uma maior produção de ácido propiônico. Outros genes que se destacaram foram os genes do metabolismo de biotina, cofator importante em enzimas fixadoras de dióxido de carbono. Foi descrito que os genes envolvidos na sua síntese estão ausentes em seu genoma e que os genes envolvidos em sua assimilação se mostraram diferencialmente expressos ao fim das fermentações em glicerol e glicose, indicando uma possível carência metabólica dessa vitamina. Adicionalmente, foi reportado que a assimilação de CO2 pode ocorrer em diferentes fontes de carbono, podendo apresentar até 25% de ácido propiônico e até 32% do ácido succínico, contendo pelo menos um carbono proveniente do CO2. Tais dados revelaram que a assimilação de CO2 é provavelmente um fenômeno recorrente e relevante em P. acidipropionici, o que reforça essa bactéria como uma promissora plataforma industrial. Por fim, experimentos realizados em biorreator indicaram que ambientes com alta disponibilidade de CO2 podem levar a um aumento expressivo da produção de ácido succínico, intermediário da via do ácido propiônico e também um importante produto de interesse da indústria química / Abstract: Propionibacterium acidipropionici is a gram-positive bacterium that has the ability to produce propionic acid through its fermentative pathway, a highly important compound in petrochemical and food industry. In view that nowadays this acid is obtained through petroleum derivatives, P. acidipropionici is being appointed as an important candidate as an industrial platform in propionic acid production. One of the characteristics that emphasize its use is the ability to fix CO2 and direct the assimilated carbon to the production of propionic acid. Little is known about this phenomenon in propionibacteria, however it¿s occurrence is described when the bacterium is cultivated in glycerol as its only carbon source. The present work had as objective to characterize and study the CO2 assimilation mechanism in P. acidipropionici, aiming to evaluate how relevant this mechanism is in its fermentative metabolism. Through genome analysis, genes and pathways potentially involved in this process were identified. The analysis highlights the enzyme pyruvate carboxylase, a propionic acid cycle¿s acting enzyme and little distributed in Propionibacteria, and the genes involved in biotin¿s metabolism, a vitamin that acts as an important cofactor in CO2 fixation reactions in bacteria. The biotin production pathway is not complete in P. acidipropionici, being observable in this project that in fact there is a deficiency in its growth in the absence of the same. Seeking trancriptional clues of the phenomenon and having glycerol as carbon source, a global gene expression analysis of the fermentation of P. acidipropionici was performed in glycerol, glucose and sugarcane juice in different points of bacterial growth (RNASeq). Interestingly, the most differentially expressed enzyme of the fermentative pathway in glycerol is the enzyme pyruvate carboxylase. The biotin related pathways are also differentially expressed at the final stages of the bacterium¿s fermentation, what can be related to a requirement of this vitamin at these stages. The supplementation of this vitamin was performed at the three studied carbon sources. However, no difference in growth or acids production was found. Aiming to explore in which situations the CO2 fixation happens, fermentations with six different carbon sources supplemented with carbon-13 containing sodium bicarbonate were performed. It was evaluated from this experiment that the CO2 assimilation occurs in all studied carbon sources, and that about 1/4 of the propionic acid total has a carbon that comes from the diluted bicarbonate. The generated data reveals that the phenomenon is relevant in P. acidipropionici. Lastly, the effect of sodium bicarbonate supplementation in P. acidipropionici fermentations having glycerol as carbon source was studied. As a result, an expressive increase in the production of succinic acid was observed, another fermentation final product in propionibacteria. Such phenomenon, therefore, could also be more explored for the production of this second acid, equally important in the industrial point of view / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Yes / In Escherichia coli, the biogenesis of both cytochrome bd-type quinol oxidases and periplasmic cytochromes requires the ATP-binding cassette-type cysteine/GSH transporter, CydDC. Recombinant CydDC was purified as a heterodimer and found to be an active ATPase both in soluble form with detergent and when reconstituted into a lipid environment. Two-dimensional crystals of CydDC were analyzed by electron cryomicroscopy, and the protein was shown to be made up of two non-identical domains corresponding to the putative CydD and CydC subunits, with dimensions characteristic of other ATP-binding cassette transporters. CydDC binds heme b. Detergent-solubilized CydDC appears to adopt at least two structural states, each associated with a characteristic level of bound heme. The purified protein in detergent showed a weak basal ATPase activity (approximately 100 nmol Pi/min/mg) that was stimulated ∼3-fold by various thiol compounds, suggesting that CydDC could act as a thiol transporter. The presence of heme (either intrinsic or added in the form of hemin) led to a further enhancement of thiol-stimulated ATPase activity, although a large excess of heme inhibited activity. Similar responses of the ATPase activity were observed with CydDC reconstituted into E. coli lipids. These results suggest that heme may have a regulatory role in CydDC-mediated transmembrane thiol transport. / This work was supported by Biotechnology and Biological Sciences Research Council grant BBS/B/14418 (Membrane Protein Structure Initiative).

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / The impact of tobacco smoking on human health is well documented. The influence of smoking on tooth loss and cardiovascular diseases was investigated in the current study via both epidemiology and in vitro studies. From analyzing the 2006 Behavioral Risk Factor Surveillance System (2006 BRFSS) database, we confirmed that smoking was significantly associated with the number of teeth lost in a dose-dependent manner and smoking cessation reduced the risk when compared to those subjects continuing to smoke. In addition, the virulence factors related to caries were compared between Streptococcus mutans and Streptococcus gordonii in response to cigarette smoking condensate (CSC) treatment. We observed that S. gordonii was more susceptible to CSC treatment than S. mutans. CSC significantly enhanced S. mutans sucrose-dependent and independent adherence. Western blot assays revealed that several bacterial surface proteins including glucosyltransferase (GTF), glucan-binding proteins and antigen I/II, were significantly upregulated for the treated S. mutans. These findings suggested that the oral environment with CSC may favor a cariogenic dominant composition, which may increase the risk for smokers to develop caries. We also found that smoking and oral health status modified each other and synergistically increased the risk of CVD and this joint effect was more pronounced among the youngest age group using the 2006 BRFSS database. To further understand the joint effect, we conducted an in vitro study to investigate bacterial attachment to fibronectin and endothelial cells in response to smoking condensate treatment. Our study clearly demonstrated CSC significantly enhanced S. mutans attachment to both soluble and immobilized fibronectin as well as endothelial cells. Furthermore, our data suggested that bacteria possessed several adhesins that bound to host tissues and endothelial cells also had multiple receptors for bacterial attachment. Among these adhesins, antigen I/II seemed essential for bacterial attachment to endothelial cells without CSC. The knowledge of bacterial attachment to host tissues in the presence of CSC may help in developing different preventive or therapeutic strategies against attachment and colonization of the host by S. mutans.

Pseudomonas aeruginosa is a metabolically versatile environmental bacterium that grows in extremely diverse habitats—from sea water to jet fuel—and is able to infect a large variety of organisms. It is a significant cause of human disease and is one of the most frequent healthcare-associated infections. P. aeruginosa uses a sophisticated gene regulatory network to adapt its growth strategy to these diverse environmental niches and the fluctuating conditions it encounters therein. The las and rhl “quorum sensing” (QS) intercellular communication systems play integral roles in this regulatory network and control the expression of factors important to the bacterium’s ecological fitness, including many secreted factors involved in nutrient acquisition, microbial competition, and virulence. These QS systems use diffusible acyl-homoserine lactone (AHL) signalling molecules to infer environmental parameters, including bacterial population density, and to coordinate behaviour across bacterial communities. This dissertation describes an investigation into the relationship between QS and small molecule primary metabolism, using metabolomic methods based on nuclear magnetic resonance spectroscopy and mass spectrometry. Analysis of extracellular metabolic profiles (the bacteria’s “metabolic footprint”) established that QS can modulate the uptake and excretion of primary metabolites and that this effect was strongest during the transition from exponential to stationary phase cell growth. Analysis of the cellular metabolome and proteome demonstrated that QS affected most major branches of primary metabolism, notably central carbon metabolism, amino acid metabolism and fatty acid metabolism. These data indicate that QS repressed acetogenesis and the oxidative C02-evolving portion of the TCA cycle, while inducing the glyoxylate bypass and arginine fermentation. QS also induced changes to fatty acid pools associated with lower membrane fluidity and higher chemical stability. Elevated levels of stress-associated polyamines were detected in QS mutants, which may be a consequence of a lack of QS-dependent adaptations. These findings suggest that wild-type QS directs metabolic adaptations to stationary phase stressors, including oxidative stress. Previous work, including several transcriptomic studies, has suggested that QS can play a role in primary metabolism. However, there has been no previous study of the global impact of AHL QS on the metabolome of P. aeruginosa. Research presented here demonstrates that QS induces a global readjustment in the primary metabolism and provides insight into QS- dependent metabolic changes during stationary-phase adaptation.

Sorghum plants excrete phenolic acids which reduce subsequent crop yields. These acids accumulate in field soil by combining with soil and clay particles to form stable complexes which remain until degraded by bacterial metabolism. The amount of phenolic acids in soil samples were obtained by gas chromatography measurements, while Azotobacter populations were obtained by plate counts in 40 sorghum field samples from Denton County, Texas. One can conclude that increasing the Azotobacter population in the soil increased the degradation rate of phenolic acids proportionally. It is proposed that seed inoculation will introduce selected strains of Azotobacter into the soil. The presence of Azotobacter should increase crop size in subsequent plantings.

No description available.

Due to the recent rise in antibiotic resistant pathogens, and the difficulties surrounding the quest for new antibiotics, many researchers have started revisiting antibiotic interactions in hopes of finding new treatment options. The primary outcome of this project was to examine the efficacy of concomitant antibiotic use under varying nutrient conditions, to identify variations in antibiotic interactions. Antibiotic interactions were studied, utilizing E. coli as a model bacterial system, grown in four different media types. E. coli cultures were treated with streptomycin, tobramycin, erythromycin, and amikacin individually and in a pairwise fashion at varying doses. We found that at least some antibiotic efficacies were dependent on the environmental nutrient conditions E. coli was grown in, as the antibiotics were not equally effective in all media types. E. coli grown in potato dextrose broth, in particular, showed extremely high tolerance to antibiotic inhibition. In addition, we observed several variations in antibiotic interactions, depending on the combination of antibiotics and environmental conditions utilized. It is predicted that differences in available nutrients is the primary cause of the observed discrepancies in antibiotic properties between media. The observation of changes in antibiotic efficacy under different environmental and nutrient conditions has serious implications for use of antibiotic combinations as drug treatments. Not all microenvironments within the human body have identical nutrient make-up. If the interactions antibiotics are reported to have in one environmental condition change under another, reckless prescription of combinations could lead to a serious adverse reaction. Thus, this is an important area for future in vitro and in vivo research.

Submitted by DIEGO FELIPE ALVES BATISTA null (diegofelipe_vet@hotmail.com) on 2017-07-23T15:53:00Z No. of bitstreams: 1 Tese final.pdf: 4005234 bytes, checksum: 457b822652d4193c9c8e25953f4d3dc1 (MD5) / Rejected by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: Incluir o número do processo de financiamento FAPESP nos agradecimentos da dissertação/tese. Corrija esta informação e realize uma nova submissão com o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2017-07-26T13:34:20Z (GMT) / Submitted by DIEGO FELIPE ALVES BATISTA null (diegofelipe_vet@hotmail.com) on 2017-07-26T14:07:28Z No. of bitstreams: 1 Tese_Diego_Felipe_Alves_Batista.pdf: 4004591 bytes, checksum: 1de74c2da3ba5ba3e56c6bcf6f9ba6f2 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-07-26T19:26:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 batista_dfa_dr_jabo.pdf: 4004591 bytes, checksum: 1de74c2da3ba5ba3e56c6bcf6f9ba6f2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-26T19:26:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 batista_dfa_dr_jabo.pdf: 4004591 bytes, checksum: 1de74c2da3ba5ba3e56c6bcf6f9ba6f2 (MD5) Previous issue date: 2017-07-04 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O tifo aviário, causado por Salmonella Gallinarum biotipo Gallinarum, é uma infecção caracterizada pela alta mortalidade nos lotes de aves suscetíveis acometidos, enquanto S. Gallinarum biotipo Pullorum, o agente da pulorose, infecta as aves de produção industrial com as quais desenvolve relação mais branda. Ainda é escasso o conhecimento sobre os mecanismos moleculares que sustentam essas diferentes interações patógeno-hospedeiro. Nesse estudo, objetivou-se investigar o efeito de deleção parcial das sequências codificantes dos genes idnT (transportador de L-idonato ou D-gluconato), idnO (5-cetogluconato redutase) e ccmH (heme liase necessária na montagem de citocromos do tipo C) sobre a patogenicidade de S. Gallinarum 287/91 (SG287/91), uma vez que seus ortólogos são pseudogenes conservados em S. Pullorum. Os clones mutantes SG∆idnTO, SG∆ccmH e SG∆ccmHidnTO foram obtidos por meio da técnica de mutação sítio-dirigida, denominada de recombinação Lambda-Red e testados em dois experimentos independentes com aves comerciais semipesadas de postura suscetíveis ao tifo aviário. No 1º experimento não se observou alteração da patogenicidade dos clones mutantes após inoculação oral, pois todos os animais infectados desenvolveram sinais clínicos típicos do tifo aviário e vieram a óbito ao longo de 12 dias pós-infecção (dpi). Apesar dos 100% de mortalidade, as infecções desenvolvidas pelos clones SG∆idnTO e SG∆ccmHidnTO levaram os animais a óbito dentro de 48 horas desde o aparecimento dos sinais clínicos, enquanto SG287/91 o fez em 6 dias, sugerindo aumento da virulência dos clones mutantes. No 2º experimento observou-se que as mutantes invadiram o hospedeiro a partir do intestino, embora as quantidades recuperadas de SG∆idnTO e SG∆ccmHidnTO nos fígados e de SG∆idnTO nos baços, no 5º dpi, foram superiores a de SG287/91, reforçando a hipótese de aumento da virulência dos clones contendo a alteração idnTO. Apesar disso, os níveis de transcrição das citocinas CXCLi2 e IL6 produzidos à infecção por SG∆idnTO e SG∆ccmHidnTO não diferiram nas tonsilas cecais nos 1º e 3º dpi e nos baços no 3º dpi em relação à infecção por SG287/91. Somente SG∆ccmH inclinou-se a estimular a transcrição de CXCLi2 e IL6 nas tonsilas cecais no 1° dpi em relação ao grupo controle, enquanto SG287/91 tendeu a suprimi-la. Porém, não houve suporte estatístico para essa observação. Os níveis de mRNA do IFNγ estavam aumentados para todas as estirpes de S. Gallinarum, mutantes ou não, porém sem diferença estatística entre eles. Os resultados do presente estudo indicam que a ruptura nos genes idnTO, e em menor grau do gene ccmH, poderiam levar a perda de “fitness” em S. Gallinarum, lhes justificando a permanência no genoma desse micro-organismo, ao contrário do que ocorre com S. Pullorum. O estudo da patogenicidade de estirpe de S. Pullorum tendo reconstituídos os genes idnTO e ccmH no seu genoma poderia esclarecer os motivos pelos quais esses foram negativamente selecionados por esse micro-organismo. / Fowl typhoid, caused by Salmonella Gallinarum biovar Gallinarum, is an infectious disease which elicits high mortality into a flock of susceptible birds whereas S. Gallinarum biovar Pullorum, the aetiological agent of pullorum disease, infects poultry of commercial importance with which such a bacterium sets off a more permissive host-pathogen interaction. Little is known about the molecular mechanisms driving these distinct interplays with the host. Herein, we aimed at investigating the effect of partial deletions in the idnT (L-idonate / D-gluconate transporter), idnO (5-ketogluconase reductase) and ccmH (heme liase involved in the c-type cytochrome maturation) coding sequences on S. Gallinarum 287/91 (SG287/91) pathogenicity since they are conserved pseudogenes in S. Pullorum genomes. SG∆idnTO, SG∆ccmH and SG∆ccmHidnTO mutant strains were constructed through a one-step inactivation technique, known as Lambda-Red-mediated recombination, and tested on two independent experiments by using a commercial brown egg-producing layer line susceptible to fowl typhoid. On the experiment 1, no changing was observed in the pathogenicity of the mutant strains upon oral inoculation as the infected animals developed typical fowl typhoid clinical signs and died along 12 days post-infection (dpi). In spite of causing 100% mortality, SG∆idnTO and SG∆ccmHidnTO killed all the animals within 48 hours since the clinical signs appearance while SG287/91 did so in 6 days, indicating an increased virulence by these mutant strains. On the experiment 2 every mutant strain were able to invade the host system from the intestine albeit SG∆idnTO and SG∆ccmHidnTO were recovered from livers and SG∆idnTO alone from spleens at higher numbers than was SG287/91, supporting the hypothesis of increased virulence for those clones harbouring the idnTO mutation. Despite the results above, CXCLi2 and IL6 transcription levels during infection by SG∆idnTO and SG∆ccmHidnTO were similar to that induced by SG287/91 in caecal tonsils at 1 and 3 dpi and in spleens at 3 dpi. In contrast, SG∆ccmH trended to stimulate CXCLi2 and IL6 transcription in caecal tonsils at 1 dpi when compared to the negative, control group whereas SG287/91 tended to suppress it, but no statistical significance was found for such an observation. IFNγ mRNA were augmented for all S. Gallinarum strains, mutant or not, but without statistical difference amongst them. These findings indicate that gene decay into idnTO, and at a lesser extent, into ccmH sequences might lead to the loss of fitness by S. Gallinarum, raising an explanation for their maintenance on this bacterium chromosome when the opposite happens to S. Pullorum. Studying the pathogenicity of a S. Pullorum strain possessing both the idnTO and ccmH genes in its genome could bring to light the reasons whereby such genes were negatively selected by this microorganism. / FAPESP: 2013/22920-4 / FAPESP: 2013/26127-7