Th. Univ.--Lille 1, 1980. N°: 106.

Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) sont des polluants organiques persistants (POP) émis essentiellement par les activités humaines suite à la combustion incomplète de la matière organique (industrie, chauffage, trafic routier...). En raison de leur faible taux de dégradation, de leur toxicité et de leur bioaccumulation, les HAPs font l'objet de plusieurs études d'écotoxicologie. La présente thèse, entreprise dans ce contexte par le biais d'une étude microcosmique se propose d'évaluer l'impact des HAPs sur la microflore et la méiofaune et d'appliquer différentes techniques de bioremédiation (biostimulation, bioaugmentation et combinaison des deux techniques) dans le but de dégrader les HAPs. Nos résultats ont montré que les HAPs sont toxiques aussi bien pour la microflore que pour la méiofaune de la lagune de Bizerte. Sur la microflore, l'effet toxique de ces contaminants s'est manifesté par l'inhibition de l'activité bactérienne à l'interface eau–sédiment et par la modification profonde de la structure des communautés bactériennes. En ce qui concerne la méiofaune, les HAPs ont entrainé une altération de la structure des communautés nématologiques. En effet, nous avons pu caractériser des espèces indicatrices de pollution par les HAPs. Ainsi, l'espèce Spirinia parasitifera dont la densité s'accroît dans tous les microcosmes contaminés par les HAPs paraît être une espèce “opportuniste” à la pollution par les HAPs. Cependant, Oncholaimus campylocercoïdes, fortement dominante dans tous les microcosmes témoins, a diminué de densité dans tous les microcosmes contaminés et a été considérée comme HAP-sensible. En analysant la structure des communautés microbiennes et méiofaunistiques, nous avons observé que la méiofaune joue un rôle structurant dans le maintien d'une communauté microbienne peu sensible aux effets des HAPs. Ce rôle structurant a été moins prononcé dans le cas d'ajout des sels nutritifs par la technique de biostimulation ; technique qui a présenté des effets non significatifs vis-à-vis des communautés nématologiques et a semblé plus efficace dans la minéralisation des HAPs et par conséquent à la réduction de leur effet toxique sur les organismes benthiques. Ces résultats suggèrent que la bioremédiation serait une alternative prometteuse à la dégradation des HAPs. / Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are persistent organic pollutants (POP) emitted mainly by human activities due to the incomplete combustion of organic matter (industry, heating, traffic ...). Because of their low rate of degradation, their toxicity and their bioaccumulation, PAHs are main of concern in ecological studies. In this context, the objectives of this thesis were to assess the impact of PAHs on the benthic microflora and meiofauna and apply different techniques of bioremediation (biostimulation, bioaugmentation and combination of both treatments) in order to degrade PAHs, using experimental approach with microcosms.Our results showed that PAHs are toxic for microflora but also for meiofauna of Bizerta lagoon. The toxic effects of these contaminants were demonstrated by the inhibition of bacterial activity in the sediment/water interface and by profound changes in the structure of bacterial communities. PAHs provoked significant changes on meiofaunal community with the selection of nematode species that could be proposed as bioindicators of PAH pollution. Thus, Spirinia parasitifera which significantly (p<0.05) increased in PAH contaminated microcosms, suggesting that it is an "opportunistic» species to PAH pollution. In contrast, Oncholaimus campylocercoïdes, strongly dominant in control microcosms, decreased in PAH contaminated microcosms and seemed to be a ‘‘PAH-sensitive'' species.By analyzing the structure of microbial and meiofaunal community, we observed that the structural role of meiofauna on bacteria community structure was still evident even under PAH contamination despite the toxic effects on meiofauna. However, this structural role of meiofauna disappeared when nutrients were added to the sediment resulting in an almost complete removal of PAHs. Biostimulation seemed to be the most effective bioremediation strategy in the reduction of PAH toxic effects on benthic organisms. Overall, these results suggest that bioremediation using nutrient addition is a promising alternative technique for the degradation of PAHs in coastal polluted environments.

Les Kazakhs sont des consommateurs traditionnels de lait d'espèces non-conventionnelles comme la chamelle. Pour autant, les régions d'élevage camelin dans ce pays, bien que basées sur un mode extensif et un accès à des ressources naturelles, n'en sont pas moins fragilisées par les risques de pollution, l'environnement du pays étant affectées par la présence de métaux lourds, pesticides et radionucléides. L'objectif de la thèse a été (a) d'évaluer l'impact de cette pollution sur la qualité du lait de chamelle et du shubat (lait fermenté), et (b) d'évaluer les capacités de détoxification des produits laitiers.Pour aborder la question de l'impact de la pollution, plusieurs niveaux d'analyses ont été mis en œuvre:(i) A l'échelle régionale, des cartes d'indice de pollution ont été établies autour de 13 fermes de zones polluées (Almaty, Sud Kazakhstan, Atyraou et Kyzylorda) afin de comparer le niveau de pollution des différentes matrices (sol, eau, plante) selon la distance aux sources de pollution.(ii) A l'échelle des matrices environnementales (sol, plante, eau), deux métaux lourds majeurs (Pb et Cd) ont été déterminés dans les échantillons de sols (7,76-131,08 ppm et 0,08-0,39 ppm, respectivement), l'eau (Pb entre 5,9-13,6 ppm et Cd 0,05-0,25 ppm), les plantes (0,50-2,30 ppm et >0,05-0,56 ppm, respectivement). Un lien entre indice de pollution et métaux dans les sols a été observé, montrant l'impact de la proximité et de la nature des sources de polluants sur la contamination des sols. On observe également une corrélation étroite entre teneur en Pb et Cd au sein des différentes matrices. Cependant, les teneurs dans le sol sont indépendantes des teneurs dans l'eau ou les plantes. Les teneurs en pesticides dans l'eau sont inférieures à celles des normes internationales. Dans les fourrages, le DDT et ses dérivés ont été plus élevés que dans le sol. Cela signifie que les résidus de pesticides peuvent être également d'origine atmosphérique et donc inhalés par les animaux(iii) Dans le lait et le shubat, la concentration en métaux lourds dans cinq régions (Almaty, Atyraou, Kyzylorda, Taraz et Sud Kazakhstan) a été en moyenne faible en Cu (< 0,05 ppm), normale en Zn (près de 5 ppm) et Cd, mais un peu élevée pour Pb. Nos résultats ont été relativement élevés pour le DDT total dans le lait de toutes les régions sauf Kyzylorda et supérieurs pour le HCH total dans le lait des régions d'Almaty et d'Atyraou.(iv) Les relations entre environnement et lait ont été testées montrant l'absence de lien entre contamination de l'environnement en métaux lourds et celle du lait et shubat. Aucune relation non plus n'a été observée pour les pesticides, à l'exception du lindane et 4,4-DDD.Pour tester l'effet détoxifiant, il a été procédé en deux étapes. D'abord l'isolement et l'identification des souches de bactéries lactiques (BAL) du shubat afin de tester leur capacité à fixer Pb et Cd. Au total, 138 souches ont été isolées à partir de 25 échantillons laitiers. Une étude qualitative pour détecter la capacité des BAL à fixer les métaux lourds a été réalisée. Parmi 118 souches testées, seules 5,1% d'entre elles n'ont poussé ni sur Pb ni sur Cd, 36 % ayant eu la capacité de fixer Pb ou Cd, et 9% les deux. Les 52 souches montrant les meilleurs résultats ont été retenues pour identification par des méthodes moléculaires (rRNA16S). Selon les résultats de séquençage, la plupart de souches étaient de genre Enterococcus et Lactobacillus, secondairement Lactococcus et Leuconostoc.Dans un second temps, un test physiologique (in vivo) a été réalisé sur 80 cobayes divisés en 8 groupes traités par le Pb et des souches de BAL. La quantité de Pb dans les fèces des groupes traités par le lait fermenté ayant contenu ou pas du Pb était relativement élevé par rapport aux groupes témoin et celui recevant de l'eau enrichie de Pb (groupe EauPb). La distribution du Pb dans les organismes de cobayes du groupe EauPb s'est révélée dans l'ordre croissant: rate / The Kazakh people are traditional consumers of milk from non-conventional species like camel. However, the camel-rearing areas in this country, although based on an extensive mode and an access to natural resources, are affected by the risks of pollution, the environment of the country being affected by the presence of heavy metals, pesticides and radionuclides. The objective of the thesis was (a) to evaluate the impact of this pollution on the quality of the camel milk and shubat (fermented milk), and (b) to evaluate the abilitiy of detoxification by the dairy products. To answer to the question of the impact of pollution, several levels of analyses were implemented:(i) At the regional level, maps of pollution index were established around 13 farms from polluted zones (Almaty, Southern Kazakhstan, Atyraou and Kyzylorda) in order to compare the level of pollution of the various matrices (soil, water, plant) according to the distance to the polluting sources.(ii) On environmental matrix level (soil, plant, water), two major heavy metals (Pb and Cd) were determined in the soil (7,76-131,08 ppm and 0,08-0,39 ppm, respectively), water (Pb 5,9-13,6 ppm and Cd 0,05-0,25 ppm), the plants (0,50-2,30 ppm and >0,05-0,56 ppm, respectively) samples. A correlation between pollution index and metals in soils was observed, showing the impact of the proximity and the nature of the polluting sources on the contamination of the soils. A close correlation between Pb and Cd content within the various matrices was also observed. However, the contents in the soil were independent of the contents in water or plants. The contents of pesticides in water were lower than those of the international standards. In fodder, the DDT and its derivatives were higher than in the soil. That means that the pesticides residues can be also of atmospheric origin and thus inhaled by the animals(iii) In milk and shubat, the heavy metal concentration in five areas (Almaty, Atyraou, Kyzylorda, Taraz and Sud Kazakhstan) was on average low in Cu (< 0,05 ppm), normal for Zn (nearly 5 ppm) and Cd, but a little high for Pb. Our results were relatively high for the total DDT in the milk of all the areas except Kyzylorda and superiors for the total HCH in the milk of Almaty and Atyraou areas.(iv) The relations between environment and milk were tested showing the absence of link between environmental contamination of the heavy metals and that of milk and shubat. No relation either was observed for the pesticides, except for lindane and 4,4-DDD.To test the detoxification effect, it was proceeded in two stages: initially the isolation and identification of the strains of lactic bacteria (LAB) of the shubat in order to test their capacity to fix Pb and Cd. On the whole, 138 strains were isolated starting from 25 dairy samples. A qualitative study to detect the capacity of the LAB to fix heavy metals was carried out. Among 118 tested strains, only 5.1% of them pushed neither on Pb nor on Cd, 36% having had the capacity to fix Pb or Cd, and 9% both. The 52 strains showing the best results were retained for identification by molecular methods (rRNA16S). According to results' of sequencing, the majority of strains were of genus Enterococcus and Lactobacillus, secondarily Lactococcus and Leuconostoc. In the second time, a physiological test (in vivo) was carried out on 80 guinea-pigs divided into 8 groups treated by strains of LAB containing or not some Pb. The quantity of Pb in feces of the groups treated by fermented milk having contained or not Pb was relatively high compared to the reference groups and that receiving from the water enriched by Pb (WaterPb group). The distribution of Pb in the organes of guinea-pigs of the WaterPb group appeared in the ascending order: spleen> blood> heart> lungs> liver> kidneys. There was no significant correlation between organs.The results obtained on the identification of the isolated strains, gave the possibilities of studying

Broiler flocks become frequently asymptomatically contaminated by the enteric bacteria Salmonella sp. and Campylobacter sp. which are human pathogens. Among the strategies developed at farm level to reduce the incidence of these pathogens, some lactic acid bacteria have been shown to be interesting because of their antimicrobial activity and their stimulatory properties on the immune system of poultry. The aim of this thesis was to select bacteria with antagonistic activity against Salmonella or Campylobacter, and to improve their inhibitory effect by the combination with enzymes of polysaccharidase type. The first step of the thesis was an epidemiological study carried out in the Walloon region in order to determine the contamination way of broilers by Campylobacter in free range production. Results showed that the major way of contamination is the open-air range to which the animals have access during the rearing period. A preventive treatment of the open-air range and the straw litter with an antagonistic strain in combination with an enzyme seems thus to be suitable in this case. The second step of the work aimed at the selection of a xylanase for using as a dietary additive in combination with an antagonistic bacterial strain against Salmonella. Four xylanases were studied in vivo for their effect on growth performances of broiler chickens. Diet supplementation with enzyme led to an increased final body weight and daily weight gain (P < 0.05), without difference according to the bacterial or fungal origin of the xylanase. The Belfeed B1100MP xylanase, which is commercialized in he Walloon region, was selected in order to develop a probiotic-xylanase feed additive. The purpose of the third part was to select a bacterial strain with antagonistic activity against Campylobacter for applying on open-air range and broiler litter. An in vitro screening of 12 lactic acid bacteria was realised using a co-culture assay with a growth medium based on straw and dehydrated poultry excreta, supplemented with different cellulase concentrations. Lactobacillus pentosus and Enterococcus faecium showed inhibitory effect against Campylobacter without enzyme which was intensified by cellulose from 200 ppm. Finally, the effect of dietary supplementation with a L. plantarum strain combined with the Belfeed B1100MP (PE treatment) on growth performance, microflora, and faecal Salmonella Typhimurium concentrations, was studied with experimentally infected broiler chickens. The PE diet allowed to partially overcome the negative effects associated with the infection on growth performance and microflora, and to significantly reduce faecal Salmonella concentration.

L'évolution est-elle prédictible? Alors que la réponse habituelle est un non presque unanime, un corpus croissant de connaissances suggère qu'il est temps de revoir cette réponse. Même si les mutations sont toujours considérées comme aléatoires, la détection de patterns génétiques sous-jacents aux événements évolutifs ouvre la porte sur des stratégies potentielles permettant de prévoir les trajectoires évolutives suivies par les organismes lorsqu'ils s'adaptent à des contraintes changeantes. Quand les organismes subissent une spécialisation fonctionnelle (à travers la perte de gènes et de fonctions) pour s'adapter à des signaux environnementaux donnés, les trajectoires évolutives possibles qu'ils peuvent emprunter sont restreintes et devraient donc être plus facilement prévisibles. Dans ce contexte d'évolution réductive par spécialisation, les objectifs de cette thèse sont de mieux comprendre l'interaction entre contraintes environnementales, métabolisme, évolution génétique et adaptations fonctionnelles, et dans un deuxième temps de prédire, pour des contraintes données, les trajectoires évolutives qui seront suivies par les organismes pour s'adapter à ces contraintes. Une première approche met l'accent sur l'importance des interactions biotiques en tant que déterminants des trajectoires évolutives, et comment, en modélisant une hausse bénéfique de dépendance envers un bien commun, il est possible de prédire la dynamique d'une population subissant de tels évènements évolutifs. Une deuxième approche étudie comment les changements observés au niveau métabolique et fonctionnel et engendrés par des modifications de contraintes environnementales pourraient être prévus et testés. Sur la base d'une vision centrée sur le métabolisme, des travaux de modélisation et des travaux d’expérimentions ont été combinés pour étudier l'évolution de la spécialisation aux niveaux génétiques, métaboliques et fonctionnels. Nous montrons que les trajectoires évolutives suivies peuvent-être partiellement prédites en fonction de conditions environnementales spécifiques, mais que ces prédictions sont limitées en raison de la complexité du réseau de l'expression génétique. Ce travail exploratoire et interdisciplinaire augmente les connaissances sur les déterminants évolutifs et les trajectoires suivies par l'organisme au cours d’un phénomène de spécialisation. Il démontre également un grand potentiel de prédiction, notamment grâce à une perception métabolique des systèmes. / Is evolution predictable? While the usual response is an almost unanimous No, a growing corpus of knowledge suggests it is time to seriously revisit this answer. Even though mutations are still assumed to be random, the detection of genetic patterns underlying evolutionary events opens the door on potential strategies to forecast the evolutionary trajectories followed by organisms when they adapt to changing constraints. When organisms undergo functional specialization (through genes and function loss) to adapt to given environmental cues, the possible evolutionary paths they can take are restrained and should thus be more easily predictable. In this context of reductive evolution through specialization, the objectives of this thesis are to understand better the interaction between environmental constraints, metabolism, genetic evolution and functional adaptations, and in a second time to predict, for given environmental constraints, the evolutionary trajectories which will be followed by organisms to adapt to these constraints. A first approach focuses on the importance of biotic interactions as being determinants of evolutionary trajectories, and how by modelling a beneficial rise of dependency on a common good, we could predict the dynamic of a population undergoing such evolutionary events . A second approach investigates how changes entailed in metabolisms and functions by a change in environmental constraints could be forecast and tested. Based on a metabolic-centered view, we combined modelling and experimental work to encompass the evolution of specialization at the genetic, metabolic and functional levels. We show that evolution trajectories can partially be predicted according to specific environmental conditions, but that these predictions are limited due to the intricacy of the genetic expression network. This exploratory and interdisciplinary work increases the knowledge on evolutionary determinants and trajectories followed by organism during specialization. It also demonstrate a great potential for predictions, notably through a metabolic perception of the systems.

La résistance aux antibiotiques demeure un problème majeur de santé publique particulièrement dans les pays en voie de développement (PVD) où les conditions d’hygiène sont encore précaires et où l’utilisation des antibiotiques est souvent abusive et très peu contrôlée. Cette thèse a pour objectif principal d’étudier la prévalence, la circulation et la caractérisation génétique des bactéries multirésistantes (BMR) dans un PVD, le Burkina Faso. Ce travail permet de mieux comprendre la propagation de ces BMR dans ce pays et de donner des informations indispensables pour les services de santé publique. Dans cette région, c’est la première étude du genre et cette thèse représente donc un travail original et informatif. A partir d’une revue de la littérature réalisée sur la problématique de l’émergence des BMR en Afrique de l’ouest, les objectifs spécifiques sont : i) d’étudier la prévalence et la caractérisation phénotypique et génotypique des bêta-lactamases à spectre élargi (BLSE) chez les entérobactéries isolées en portage et dans les processus infectieux ; ii) d’évaluer la sensibilité des entérobactéries aux carbapénèmes ; iii) de documenter la prévalence du portage nasal de Staphylococcus aureus (SAUR) résistant à la méticilline (SARM) ainsi que d’effectuer la caractérisation moléculaire les isolats de SAUR. Les isolats ont été prélevés par les services de santé publique au sein des 3 CHU du Burkina et ont été remis en culture au laboratoire de bactériologie du CHU de Montpellier [un total de 594 souches, 522 entérobactéries (214 en portage et 308 dans les processus infectieux) et 72 SAUR]. L’identification des espèces bactériennes repose sur la spectrométrie de masse MALDI-TOF. L’évaluation de la sensibilité aux antibiotiques s’appuie sur la méthode de diffusion en milieu gélosé. Les BLSE et les carbapénémases chez les entérobactéries sont identifiées par méthodes moléculaires (PCR et séquençage) et la caractérisation génétique des isolats de SAUR par une technique de puce à ADN. Au Burkina Faso, les points importants sont : des taux très élevés en portage et dans les infections d’entérobactéries sécrétrices de BLSE en hospitalier et en communautaire; les antécédents de consommation d’antibiotiques ou d’hospitalisation sont des facteurs de risque de portage ; par les isolats BLSE, Escherichia coli est l’espèce prédominante ; la majorité des BLSE sont des CTX-M-15, suivi de CTX-M-14, 27 et SHV-12 ; l’étude des phylogroupes d’E. coli suggère une expansion des gènes CTX-M-15 d’origine plasmidique et non liée à une épidémie de clone ; des isolats d’E. coli producteurs de carbapénémase OXA-181 avec un support génétique plasmidique de type IncX3 sont identifiés. On observe un taux de portage nasal de SAUR classique avec une très faible prévalence de SARM ; on note dans une forte proportion des gènes de virulence (Leucocidine de Panton Valentin et du facteur EDIN) parmi les SAUR en portage constituant des facteurs de risques de gravité lors des infections ; l’analyse génétique des isolats de SAUR montre une grande diversité de clones. Les études de prévalence et de génétiques apportent des informations fondamentales pour l’épidémiologie des BMR, base indispensable pour appréhender la lutte et le contrôle de ces organismes pathogènes résistants. En conclusion, ces premières études réalisées au Burkina permettent de définir les perspectives de recherche et les stratégies à développer pour le contrôle l’émergence et la diffusion de ces BMR. / Antibiotic resistance is a major public health issue, particularly in developing countries where health conditions are still inadequate and antibiotic use is often unjustified and not properly regulated. The main objective of this thesis was to study the prevalence, spread and genetic features of multi-resistant bacteria (MRB) in Burkina Faso, a developing country. This work allows better understanding MRB spread in this country and gives essential information for the development of public health policies. This is the first study in this region and this thesis is therefore an original and informative work. Starting from a review of the literature data on the issue of MRB emergence in West Africa, the specific objectives are: i) to study the prevalence and to characterize phenotypically and genotypically the extended-spectrum beta lactamases (ESBL) in enterobacterial samples isolated from healthy carriers and during the clinical phase of infection; ii) to assess the sensitivity of such enterobacterial samples to carbapenem drugs; iii) to document the prevalence of nasal carriage of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and to molecularly characterize all S. aureus isolates. Samples were collected by the public health services of three Burkina Faso University Hospital Centers (UHC) and were then cultured at the Laboratory of Bacteriology of Montpellier UHC [total n= 594 isolates of which 522 were Enterobacteriaceae isolates (214 from healthy carriers and 308 from patients with clinical infection) and 72 S. aureus isolates]. Bacterial species were identified by MALDI-TOF mass spectrometry. Antibiotic sensitivity was tested using the agar diffusion method. ESBL and carbapenemases in enterobacterial isolates were identified using molecular methods (PCR amplification and sequencing). S. aureus isolates were genetically characterized by using DNA arrays. This work shows that in Burkina Faso, ESBL-producing enterobacterial strains are frequent both in healthy carriers and hospitalized patients and that previous antibiotic use or hospitalizations are risk factors for colonization. Among the ESBL-producing enterobacterial strains, Escherichia coli was the predominant species and most ESBL-producing isolates were CTX-M-15, followed by CTX-M-14, 27 and SHV-12. The analysis of the E. coli phylogenetic groups suggests a plasmid-mediated spread of CTX-M-15 genes and not linked to an epidemic clone. Moreover, E. coli strains that produce the carbapenemase OXA-181 and with an IncX3-type plasmid have been identified. Concerning S. aureus, the rate of nasal carriage was classical with a low prevalence of MRSA. Among the S. aureus nasal samples, a high proportion of virulence genes (Panton Valentin leukocidin and EDIN) was detected. This constitutes an important risk of severe disease during clinical infection. The genetic analysis of the S. aureus isolates showed great clone diversity. These data are essential for understanding MRB epidemiology in Burkina Faso and represent a base for fighting and controlling resistant pathogens. In conclusion, these first studies carried out in Burkina Faso allow defining the future research perspectives and strategies to be developed for controlling the emergence and spread of these MRB.

Dans le cadre de l’évaluation du risque immunotoxique de composés glycolypidiques d’origine bactérienne, cette thèse a portée sur l’évaluation de toxicité d’endotoxines d’E.coli de deux sérotype différents : LPS O55:B5 utilisé couramment en comme immunostimulant et le LPS O157:H7 dont la réalité environnementale a soulevé notre questionnement scientifique quant à son impact sur le système immunitaire du poisson et son caractère potentiellement pro-inflammatoire. Les différents procédés employés ont compris l’évaluation des paramètres cellulaires (production d’espèces réactives d’oxygène et phagocytose) ainsi que la caractérisation et la quantification de l’expression de gènes de cytokines (TGFβ et IL-10) et facteurs immuno-associés (MARCO, HSP60 et vitellogénine) chez le modèle gardon (Rutilus rutilus).Les approches expérimentales se sont déroulées tout d’abord en ex vivo sur des leucocytes isolés d’organes lymphoïdes (Rein antérieur, rate et sang) de gardon et ont montré une tolérance endotoxique vis-à-vis de ces LPS à de 1µg/mL même combinés au diclofénac à 0,1 µM. ce travaill a été suivi par une évaluation du risque potentiel d’autres composés glycolipidiques d’origine bactérienne (rhamnolipides).Les approches in vivo qui ont suivies ont été réalisées sur : (i) sur modèle poisson-zèbre (Danio rerio) au laboratoire et (ii) sur modèle gardon par encagement sur terrain. Les résultats obtenus sur danios au laboratoire ont montré une toxicité du sérotype O157 :H7 et une influence sur les paramètres comportementaux par les LPS (Sickness behaviour). Sur terrain, l’approche in vivo par encagement a révélé – au niveau de la rate et du rein antérieur – des réponses cellulaires et moléculaires, sérotype, organe et sexe dépendante avec une immunomodulation prédominante chez les mâles d’autant plus que la période d’étude s’est déroulée durant la maturation sexuelle des gardons. Ce travail fait état du caractère inflammatoire et toxique du LPS peu étudié d’E.coli O157 :H7, évalué par des immunomarqueurs cellulaires bien maitrisés et moléculaires néo-développés. / In the context of immunotoxic risk evaluation of glycolypidic compounds of bacterial origin, this thesis focused on the evaluation of E.coli endotoxin toxicity of two different serotypes: LPS O55: B5 commonly used as an immunostimulant et LPS O157: H7, whose environmental reality has raised our scientific questioning about its impact on the fish's immune system et its potentially pro-inflammatory nature. The various methods used included the evaluation of cellular parameters (production of reactive oxygen species et phagocytosis) as well as the characterization of cytokines (TGFβ et IL-10) et immune-realted factors (MARCO, HSP60 et vitellogenin) genes et the quantification of their expression in the roach model (Rutilus rutilus).The experimental approaches were first carried out ex vivo on leukocytes isolated from lymphoid organs (anterior kidney, spleen et blood) roach et showed an endotoxic tolerance at 1μg / mL even combined with 0.1 μM diclofenac. This work was followed by an evaluation of the potential risk of other glycolipidic compounds of bacterial origin (rhamnolipids).The in vivo approaches that followed were performed on: (i) zebrafish (Danio rerio) model in the laboratory et (ii) on roach model by field caging. The results obtained on danios in the laboratory showed a toxicity of the serotype O157: H7 et an influence on the behavioral parameters by the LPS (Sickness behavior). On the field, the caging approach revealed - at spleen et the anterior kidney level - cellular et molecular responses, serotype, organ et sex-dependent with a predominant immunomodulation in males, especially since the study period took place during the sexual maturation of roaches. This work reports the inflammatory et toxic nature of the less studied E.coli O157: H7 LPS serotype, evaluated by well-mastered cellular et neo-developed molecular immunomarkers.

Les antibiotiques ont été utilisés pour le traitement des infections bactériennes depuis plus de 70 ans, sauvant des millions de vies. Cependant, leur mauvaise et sur-utilisation ont conduit à l’émergence de la résistance bactérienne. Outre le développement de nouvelles familles d'antibiotiques, la détection rapide et sensible de bactéries est très importante pour le diagnostic médical. Les polymères fluorescents représentent un grand potentiel, car ils sont faciles à fonctionnaliser, synthétiser et greffer. Les films sont plus pratiques, faciles à manipuler et peuvent être réutilisés, ce qui n'est pas le cas des méthodes de détection en solution. L’objectif de ce travail est de développer un film de polymère nanostructuré fluorescent et sensible sur des surfaces de verre pour la détection bactérienne. Sur la base de la méthode de polymérisation radicalaire par transfert de chaîne réversible par addition-fragmentation (RAFT), trois types de polyélectrolytes fluorescents à base de BODIPY (FPC) ont été synthétisés : des chaînes relativement courtes à caractère polyélectrolyte faible (SW FPC), des chaînes courtes à caractère polyélectrolyte fort (SS FPC) et enfin des chaînes longues à caractère polyélectrolyte faible (FPC LW). Les films FPC LbL ont été élaborés sur des lames en verre par interaction électrostatique. Les propriétés photophysiques et de surface des FPC LbL ont été contrôlées en ajustant les conditions de dépôt. Les films FPC LbL à base de BODIPY ont été utilisés comme dispositif de première génération pour la détection de E. coli. Dans l'étape suivante, la sensibilité des films a été augmentée en utilisant le principe de fluorescence exaltée par plasmon (Metal Enhanced Fluorescence MEF). Un film LbL -MEF a été préparé et testé pour la détection de bactéries. Des nanoparticules d'or sphériques (Au NPs) ont été synthétisées et recouvertes de poly(chlorhydrate d'allylamine) (PAH). Le FPC LW a été sélectionné comme couche fluorescente. Différents films contenant des Au NPs et LW FPC- ont été fabriqués. La distance entre les NPs Au et LW FPC- a été ajustée par l'ajout de deux polymères de charge opposée (PC + et PC-). Les deux surfaces de AuNP / 4 couches PC / LWFPC- et Au NPs / 8 couches PC / LWFPC- ont montré que E. coli peut être ciblée par LW FPC-.La sélectivité des films LbL a été ajoutée en introduisant un anticorps comme site de reconnaissance spécifique. Le polyanion et le polycation avec le groupe fonctionnel 4-dibenzocyclooctynol (DIBO) ont été assemblés sur des lames de verre activées. L'anticorps anti-E. coli a ensuite été introduit sur la surface en une seule étape via la réaction de cycloaddition azide-alcyne (SPAAC). Le nombre d'E. coli capturées dépend de la concentration d’anticorps sur la surface. La surface a montré une sélectivité significative pour E. coli, comparée à B. subtilis.La croissance bactérienne peut être détectée sur un film mince LbL en introduisant un fluorophore sensible au pH (fluorescéine). En effet, la croissance des bactéries est souvent associée à une diminution du pH du milieu due à une libération de métabolites acides. Nous avons préparé avec succès différents types de films LbL sensibles au pH. Dans un premier temps, la synthèse de différents polyanions fonctionnalisés (chaîne courte et longue de DIBO-PC et polymère fluorescent rouge) a été achevée. Ensuite, trois types de surfaces sensibles au pH contenant de la fluorescéine (DIBO-SWPC- / fluorescéine, DIBO-LW PC- / fluorescéine et ratiométrique RFPC- / fluorescéine) ont été préparés sur la base d'assemblage LbL et de chimie click. Enfin, trois surfaces sensibles au pH ont été étudiées pour la détection de la croissance des bactéries. Toutes les surfaces étaient biocompatibles, le nombre de E. coli augmentait même après plusieurs heures d'incubation sur chaque surface. La détection par le changement de fluorescence est en cours de développement. / Antibiotics have been used for the treatment of bacterial infections for over 70 years, saving millions of lives. The current antibiotic resistance crisis has been attributed to the overuse and misuse of these medications. Therefore, the prevention of infection transmission by the rapid and sensitive detection of antibiotic resistant strains is needed in managing this crisis. Fluorescent polymers show great potential for bacteria detection, because they are easy to functionalize, reproduce and graft. Compared with the methods used for bacterial detection in liquid, bacterial detection on a film surface is more convenient, easier to handle and is applied in devices that can be easily reused. The goal of my PhD work is to develop fluorescent and sensitive nanostructured polymer films on surfaces for bacterial detection. Three types of BODIPY-based fluorescent polyelectrolytes (FPC) with different features were synthetized based on reversible addition-fragmentation transfer (RAFT) polymerization: relatively Short chains and Weak polyelectrolytes (SW FPC), Short chains and Strong polyelectrolytes (SS FPCs) and Long chains and Weak polyelectrolytes (LW FPCs). FPC LbL films were fabricated on activated glass slides by means of electrostatic attraction. The photophysical and surface properties of FPC LbL fims were easily controlled by adjusting the deposition conditions.The following step aimed at increasing the films’ sensitivity by using the metal-enhanced fluorescence (MEF) principle. A MEF based LbL film was prepared and tested for bacteria detection. Spherical gold nanoparticles (Au NPs) were synthesized and coated with poly(allylamine hydrochloride) (PAH). The LW FPC- was selected as the fluorescent layer. Different films containing Au NPs and LW FPC- were fabricated and the distance between the Au NPs and LW FPC- was adjusted by changing the numbers of layers with two oppositely charged polymers (PC+ and PC-). Both Au NPs/4 layers PCs/LWFPC- and Au NPs/8 layers PCs/LWFPC- surfaces indicated that E. coli can be detected by LW FPC-.The selectivity of LbL films was added by introducing an antibody on the surface of the film to provide specific recognition of a chosen bacterial strain. This LbL surface achieved a rapid, effective and specific detection of E. coli bacteria. The polyanion and polycation with a 4-dibenzocyclooctynol (DIBO) functional group were assembled on the activated glass slides and an anti-E. coli antibody containing an azide group was efficiently introduced on the surface in a single step based on the azide-alkyne cycloadditions (SPAAC) reaction. The number of E. coli captured on the surface was shown to be dependent on the amount of antibody on the surface. The anti-E. coli antibody surface showed significant selectivity for E. coli, compared with B. subtilis. An alternative approach is to detect bacterial growth on thin LbL film by introducing pH sensitive fluorophore (fluorescein). The growth of bacteria is often associated with a decrease in pH of the growth medium due to a release of acidic metabolites. Different types of pH sensitive LbL film were prepared and tested for the detection of bacterial growth. Firstly, the synthesis of different functionalized polyanions (short and long chain of DIBO-PC- and red fluorescent polymer) was carried out. Three types of pH sensitive surfaces containing fluorescein (DIBO-SWPC-/fluorescein, DIBO-LW PC-/fluorescein and ratiometric RFPC-/fluorescein surfaces) were prepared based on the combination of LbL assembly and copper-free click chemistry. Finally, three pH sensitive surfaces were studied for bacteria growth detection. All the surfaces were shown to be biocompatible, the number of E. coli increased after several hours of incubation on each surface, as detected by brightfield microscopy imaging. The application for the fluorophore-dependent detection of bacterial growth remains to be developed.

Ce travail présente les résultats dune étude menée sur la dépollution des tailings de Kipushi (RD Congo) par la valorisation des métaux contenus. Ce sont les rejets anciens dun concentrateur. Ils contiennent de la pyrite et des sulfures résiduels de cuivre et de zinc. Du fait du stockage à lair libre pendant plus de 40 ans, ces sulfures sont partiellement oxydés. Ces tailings présentent une certaine instabilité physique et chimique qui est à la base de la dégradation des milieux environnants les plus proches (rivières naturelles, sols sous-jacents, nappes souterraines, etc.) suite à la migration et à la dispersion dETM (éléments traces métalliques) tels que larsenic, le cadmium, le cobalt, le cuivre, le plomb, le zinc, Linstabilité physique se manifeste par des phénomènes dérosion par les eaux de ruissellement pendant la saison des pluies et par des phénomènes dérosion éolienne pendant la saison sèche. Leur stockage en surface saccompagne dune lente oxydation des sulfures avec production deaux acides qui dans leur neutralisation par la dolomie présente dans les rejets et celle des formations géologiques sur lesquelles ils reposent, contribuent à laccroissement des réseaux karstiques, au durcissement des eaux des nappes et parfois provoquent des phénomènes daffaissements, voire même deffondrements de terrains. Pour réduire les impacts environnementaux majeurs de ces tailings, nous avons effectué ce travail en recherchant un traitement qui combinerait dune part la dépollution par la réduction des ETM et du soufre sulfure et dautre part la valorisation du cuivre et du zinc contenus. Les deux voies qui ont été testées commencent par une flottation globale de tous les sulfures (désulfuration environnementale). Les résultats de nos expérimentations montrent quon peut obtenir un nouveau rejet de flottation dans lequel une majeure partie des ETM facilement mobilisables dans lenvironnement est éliminée ainsi que presque tout le soufre (95 %), ce qui écarte donc tout risque de DMA. Nous avons démontré que pour atteindre ces résultats, il suffit de ne broyer que la fraction la moins libérée de dimension supérieure à 75 μm et dactiver par un prétraitement à pH 6 les sulfures dont la collection par le xanthate est sinon inhibée par laltération superficielle avec formation doxydes ou par les complexes cyanométalliques formés lors de la flottation avec dépression de la pyrite par les ions cyanures ayant produit les tailings étudiés. Nous avons tenté denrichir le concentré global de la désulfuration environnementale par une flottation différentielle avec dépression de la pyrite à pH 11. Cet enrichissement est difficile à réaliser à cause de la finesse des grains et des caractéristiques minéralogiques du concentré global qui contient beaucoup de grains mixtes. Les essais ont alors porté sur la lixiviation chimique acide oxydante (avec Fe3+) et la lixiviation bactérienne du concentré global après son enrichissement en cuivre et en zinc dans un circuit de flottation avec deux finissages. Une étude approfondie des paramètres qui influencent le mécanisme des biolixiviations a été effectuée et les conditions de leur mise en pratique industrielle ont été déterminées. La lixiviation chimique doit être réalisée à des températures élevées (98°C) pour fragiliser la couche de passivation de soufre élémentaire qui se forme à la surface des grains et qui tend à freiner la diffusion des réactifs et des produits de la réaction. Par contre, la biolixiviation donne de bons résultats à température modérée. Elle est techniquement applicable aux tailings de Kipushi. Nous proposons de réaliser la biolixiviation en deux étapes successives, la première avec des bactéries thermophiles modérées (55°C) à une densité de pulpe de 15 % (poids/volume) et la deuxième avec des bactéries mésophiles (33°C) sur des pulpes à 4 % de solides. Dans ces conditions, on réussit à produire deux solutions de lixiviation (PLS : pregnant leach solution), lune à 3 g/l de cuivre et 7 g/l de zinc et lautre à 0,2 g/l de cuivre et 7 g/l de zinc, quon purifie et concentre facilement dans un circuit dextraction par solvant. Lextraction par solvant du cuivre est réalisée avec le LIX984N directement sans modifier le pH des PLS (1,7-1,9) et le zinc est extrait par le D2EHPA après précipitation dions Fe3+ du raffinat cuivre à des pH entre 3 et 3,5. On obtient ainsi des solutions aqueuses de cuivre et de zinc convenant aux installations délectrolyse industrielle. Nous avons proposé un schéma de traitement des tailings de Kipushi qui pourrait fonctionner pendant 20 ans avec les 36 684 600 tonnes sèches de rejets stockés à la digue 1 et 2. Le traitement produirait un nouveau rejet plus ou moins dépollué qui représente 66 % en poids des tailings traités, 80 950 tonnes de cuivre et 631 750 tonnes de zinc. The work present results from research study devoted to de-pollution of the stocked tailings in Kipushi (DR Congo) via valorization of the metals contained in the tailings. Pyrite and copper and zinc sulfides present the principal mineral composition of the laid down tailings from the concentrator. Due to the fact that the sulphides have been stocked during more than 40 years, they are partly oxidized. These tailings present a constant risk from physical instability and spillage, which reflects in the deterioration of the surrounding environment (rivers, soil, underground water table, etc). Moreover the migration and dispersion of TEM (trace metal elements) such as arsenic, cadmium, cobalt, copper, lead, zinc, is leading to erosion and mine run-off phenomena during wet season and generate air-borne particles during dry season. The stocking of the tailings is accompanied by slow oxidation of the sulfides with concomitant production of acidic waters which are neutralized by the dolomite present, which finally reflects in hardening of the underground waters and even provoke soil subsidence and ground collapses. In order to reduce the major environmental impacts from the tailings, we have performed a study for their post-treatment which encompasses the cleanup from one side and the reduction of TEMs and sulphur on the other side. Apart from this, the aim was to economically extract the remaining non-ferrous metals, notably Zn and Cu. The approach which has been chosen to accomplish this task has been to re-float by bulk flotation the majority of the sulphides and thus by elimination of the nearly total sulphur (95 %) to eliminate the risk of AMD generation and metals immobilization. We have shown that this is possible to be achieved via grinding the 75 μm oversize fraction in order to facilitate minerals liberation, following by subsequent activation at pH 6 before flotation. Without this pretreatment step, the flotation by use of xanthates is impossible, due to the surface coatings of the grains, which are either of oxide nature or are cyano-metallic complexes formed from the use of potassium cyanide as pyrite depressor in the flotation circuit practiced at the times when the concentrator was operational. The further attempts to produce monometallic flotation concentrates via selective flotation with depression of the pyrite at pH 11 have been unsuccessful due to reasons of complex mineralogy. Therefore chemical (Fe3+) and bacterial leaching of the bulk concentrate enriched in Cu and Zn via two cleaning flotation circuits have been envisaged. The technological parameters for the both leaching options have been studied and the mechanisms of the bioleaching taking place have been proposed in view industrial scale up of the process. It has been found that the chemical leaching should be conducted at very high temperatures (98°C) in order to breakdown the passivation coatings (sulphur). In contrast, the bioleaching has shown good results at moderate temperatures. It has been found that bioleaching is technically feasible to the tailings of Kipushi. We have suggested a bioleaching in two successive stages: the first one with moderate thermophilic microorganisms (55 °C) at pulp density 15 % (weight / volume) and the second one with mesophilic microorganisms (33 °C) at pulp density of 4 % (w/v). Under these conditions two principal PLSs (pregnant leach solution) can be obtained - a one with 3 g/l Cu and 7 g/ l Zn and other one in 0.2 g/l Cu and 7 g/l Zn. The both PLSs could be further processed via solvent extraction. The solvent extraction of Cu is accomplished with LIX984N without modifying the pH of the PLS (1.7 - 1.9), while Zn is extracted using a D2EHPA at pH between 3 and 3,5, after elimination of the iron from the copper raffinate. The aqueous solutions thus obtained are suitable for Cu and Zn electrowinning. Finally, a flow sheet for re-treatment of the Kipushi tailings which could operate during 20 years has been proposed. It could treat about 37 mln tones of dry tailings stocked in the tailing ponds 1 and 2. Preliminary calculations estimate that such treatment would produce new tailings with low environmental risk which will represent about 66 % in weight of the original treated tailings and will yield about 80 950 tons of Cu and 631 750 tons of Zn.

Les bactéries appartenant au complexe Burkholderia cepacia (Bcc) peuvent causer des infections pulmonaires dévastatrices chez les patients atteints de mucoviscidose. Les bactéries Bcc sont capables de survivre et se multiplier dans les macrophages in vitro. Des études cliniques ont confirmé que ces bactéries opportunistes se localisent au niveau des cellules phagocytaires et ne forment pas des biofilms dans les poumons des patients infectés comme on le croyait généralement. En utilisant le modèle d'infection zebrafish, nous avons établi précédemment que les macrophages constituent un site clé pour la réplication bactérienne et le développement de l'infection aiguë mortelle. Dans la présente étude, nous avons étudié le rôle des stades intracellulaires de B. cenocepacia en développant des nouvelles lignées transgéniques reportrices pour les études d’imagerie en temps réel, nous avons étudié le rôle de l'autophagie in vivo et analysé le profil « transcriptomique » des macrophages lors de l'infection par B. cenocepacia chez le poisson zèbre.En accord avec les études in vitro, nous avons constaté que la protéine « Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 » (Lc3), protéine clé dans l’autophagie, a été recrutée au niveau des vacuoles contenant B.cenocepacia K56-2. Nous avons observé en temps réel que les bactéries étaient capables de se répliquer dans ces organelles. Cependant la modulation de l'autophagie par voie génétique et pharmacologique n'a pas changé de manière significative le profil de réplication de B.cenocepacia K56-2 lors de l'infection. En dépit de la charge bactérienne inchangée, une baisse de l’autophagie était reliée avec une augmentation de la mortalité par rapport aux embryons de type sauvage. Ceci suggère une corrélation entre l'autophagie et l'inflammation, et nous proposons que la capacité de B. cenocepacia à arrêter la maturation des (auto) phagosomes et la présence de « cross-talk » entre l’autophagie d’une part et l’inflammasome de l’autre jouent un rôle important dans les réactions inflammatoires observées. Pour approfondir les connaissances sur le rôle des macrophages lors de l'infection aiguë, nous avons déterminé le profil transcriptomique des macrophages isolés à partir d'embryons de poisson zèbre infectés par B. cenocepacia après l'infection. Notre analyse bio-informatique a montré que la plupart des gènes surexprimés sont impliqués dans la signalisation de la réponse immunitaire, tandis que la plupart des gènes sous exprimés sont associés à la transcription et à la traduction. Nous avons confirmé l’activation de l’expression de tnfa dans les macrophages, et nous avons constaté que l'expression des cytokines cxcl8 et Il1b, induite par l'infection, ne dépendait pas de la signalisation par le récepteur TNFa, TNFRSF1A.Nos résultats contribuent à une meilleure compréhension de l'interaction entre B. cenocepacia et les macrophages in vivo, et peuvent contribuer à l’identification de nouvelles cibles pour le développement de thérapies anti-infectieuses pour lutter contre ces bactéries intracellulaires. / Opportunistic bacteria belonging to Burkholderia cepacia complex (Bcc) can cause devastating pulmonary infections in cystic fibrosis patients. These bacteria can survive and replicate in macrophages in vitro. Clinical evidence confirmed that the bacteria localize in phagocytic cells, and do not form biofilms in the lungs of infected patients as generally believed. Using a zebrafish infection model we established previously that macrophages are a critical site for bacterial replication and development of acute fatal infection. In the present study, we further explored the role of the intracellular stages of B. cenocepacia by developing new transgenic reporter lines for real time imaging of subcellular trafficking, studying in detail the role of autophagy in vivo, and performing host transcriptome analysis of FACS-sorted macrophages from zebrafish larvae infected with B. cenocepacia.In agreement with in vitro studies, we found that the autophagy related protein Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (Lc3) was recruited to B. cenocepacia K56-2-containing vacuoles. Although not critical, using real time confocal microscopy, we observed that the bacteria were able to replicate in such organelles. Both genetic and pharmacological modulation of autophagy did not significantly change the replication profile of B. cenocepacia K56-2 during infection. However, reduction in autophagy resulted in more rapid embryo death compared to wild type embryos. This suggests an inverse correlation between autophagy and fatal inflammation, and we hypothesize that the ability of B. cenocepacia to arrest maturation of (auto)phagosomes, and cross talk between autophagy and inflammasome signaling pathways during B. cenocepacia infection play an important role in the observed inflammatory responses. This study further describes the host transcriptome profile of macrophages isolated from infected zebrafish embryos. Our bio-informatics analysis showed that most of the genes up-regulated during infection were involved in immune response signaling, while the major group of down-regulated genes was associated with transcription and translation. We experimentally confirmed rapidly increased expression of tnfa in macrophages, and found that infection-induced expression of the cytokines cxcl8 and il1b did not depend on signalling through the Tnfa receptor, Tnfrsf1a.Our results contribute to a better understanding of the interaction between B. cenocepacia and macrophages in vivo, and the zebrafish may help finding new targets for development of anti-infectious therapies to combat these intracellular bacteria.