Submitted by Alexandre Sousa (alexandre.sousa@incqs.fiocruz.br) on 2015-05-11T17:59:22Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Kayo_Bianco.pdf: 5086210 bytes, checksum: 14083186869c48adebe043f3e9e02a6c (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandre Sousa (alexandre.sousa@incqs.fiocruz.br) on 2015-05-11T17:59:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação_Kayo_Bianco.pdf: 5086210 bytes, checksum: 14083186869c48adebe043f3e9e02a6c (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandre Sousa (alexandre.sousa@incqs.fiocruz.br) on 2015-05-11T17:59:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação_Kayo_Bianco.pdf: 5086210 bytes, checksum: 14083186869c48adebe043f3e9e02a6c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-11T17:59:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_Kayo_Bianco.pdf: 5086210 bytes, checksum: 14083186869c48adebe043f3e9e02a6c (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / A contaminação fecal de corpos hídricos é uma das principais causas de doenças entéricas veiculadas pela água no mundo, responsáveis pela morte de mais de dois milhões de crianças por ano. As águas das bacias do rio São Joao e do rio Guandu vêm sendo destinadas ao abastecimento público da Região dos Lagos e da região metropolitana do estado do Rio de Janeiro. Os indicadores de contaminação fecal usualmente empregados na avaliação da qualidade microbiológica da água quanto a presença de patógenos entéricos são os coliformes termotolerantes, representados pela Escherichia coli, os quais estão associados com matéria fecal humana e de outros animais de sangue quente. Entretanto, para um gerenciamento mais efetivo deve ser identificada a fonte de contaminação fecal. Microrganismos anaeróbios, como a ordem Bacteroidalese as archaeas metanogênicas, vêm sendo apontados como bioindicadores alternativos de contaminação fecal hospedeiro-especifico. O presente estudo tem como objetivo avaliar a qualidade das águas das bacias do rio São João e do rio Guandu por meio da aplicação de biomarcadores moleculares capazes de revelar contaminações fecais suína, humana, equina e de ruminantes. Esta abordagem representa uma importante ferramenta na detecção de contaminação hospedeiro-específica de ambientes aquáticos, o que poderá contribuir para as ações preventivas de vigilância ambiental em saúde. / Fecal contamination of water bodies is a major cause of waterborne enteric diseases in the world, responsible for the deaths of more than two million children per year. The waters from São João river basin and Guandu river basin have been intended for public supply of the Lakes Region and the metropolitan region of the State of Rio de Janeiro. Indicators of fecal contamination usually employed to evaluate the microbiological quality of water for the presence of enteric pathogens are coliforms, represented by Escherichia coli, which are associated with human faecal matter and other warm-blooded animals. However,for a more effective management the source of fecal contamination should be identified. Anaerobic microorganisms, such as the order Bacteroidales and methanogenic archaea, have been identified asalternative biomarkers for host-specific fecal contamination. The present study aims to evaluate the water quality of São João river basinand Guandu riverbasinthrough the application of molecular biomarkers able to reveal swine, human, equine and ruminants fecal contamination. This approach represents an important tool in the detection of host-specific contamination of aquatic environments, which may contribute to prevention efforts for environmental health surveillance.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-03-29T20:09:57Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Eni Liudmiliza Leite Buma - 2017.pdf: 1928297 bytes, checksum: 00dfb2987c7dc920fba208a5861948fe (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-03-31T10:28:49Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Eni Liudmiliza Leite Buma - 2017.pdf: 1928297 bytes, checksum: 00dfb2987c7dc920fba208a5861948fe (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-31T10:28:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Eni Liudmiliza Leite Buma - 2017.pdf: 1928297 bytes, checksum: 00dfb2987c7dc920fba208a5861948fe (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-03-07 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Water courses that pass through areas of production, whether agricultural, pasture or housing, are subject to discharge of municipal and industrial sewage systems. These waters can be directed to river basins and redistributed to networks of water treatment and public supply. Normally, surface raw water has high concentrations of total coliforms, thermotolerant coliforms and E. coli. However, the microbiological indicator of fecal contamination, E. coli, does not present specificity, limiting, therefore, the host identification causing fecal pollution in water stream. As an alternative, bacteria of the genus Bacteroides have been suggested as potential alternative indicators of fecal pollution. Bacteroides are strictly anaerobic, exclusive and specific to the human gastrointestinal tract, and are also present in homeothermic animals. Because its inability to withstand aerobic environments, Bacteroides are considered as promising indicators of recent fecal pollution. Their identification in water bodies is usually performed by the presence of the 16S rRNA genetic marker of the order Bacteroidales. The objective of this study was to evaluate the microbiological and physico-chemical quality of the water of the Ribeirão João Leite Basin, responsible to supply 50% of water to the city of Goiânia, as well as the evaluation of the 16S rRNA Bacteroidales marker as an indicator of human and / or animal fecal pollution in waters of this basin. For this purpose, 91 samples of surface freshwater were collected from 13 points located along the Ribeirão João Leite Hydrographic Basin extension. Also, human and animal fecal samples were collected to test the sensitivity and specificity of primers to trace the 16S rRNA Bacteroidales marker. Based on the CONAMA Resolution 357/2005 Class II for fresh water, 5.5% (5/91) of the samples had a turbidity level above > 100 NTU (119-180 NTU), while 33% presented values below <103 CFU / 100 mL for thermotolerant E. coli. The mean values were found to be between 1.24 x 103-5.03 x 104 CFU / 100 mL. The 16S rRNA Bacteroidales ruminant host marker was identified in points with high agricultural and cattle influence, on the other hand, the presence of the 16S rRNA Bacteroidales marker as an indicator of human fecal pollution was not detected in the 5 analyzed points. The results obtained will be able to collaborate with sanitary measures to reduce the level of turbidity and also to identify the source of the fecal contamination in these bodies of water, thus minimizing the risk of dissemination of waterborne diseases. / Cursos de água que atravessam áreas de produção, sejam elas agrícolas, de pastagens ou habitacional, estão sujeitos à captação de sistemas de esgoto municipais e industriais. Essas águas podem ser direcionadas a bacias hidrográficas e redistribuídas a redes de estação de tratamento de água e abastecimento público. Normalmente, águas de mananciais apresentam elevados níveis de concentrações de coliformes totais, coliformes termotolerantes e E. coli. Entretanto, o indicador microbiológico de poluição fecal E. coli, não apresenta especificidade, limitando, portanto, a identificação do hospedeiro causador da poluição fecal em determinada corrente de água. Como alternativa, as bactérias do gênero Bacteroides vêm sendo sugeridas como potenciais indicadores alternativos de poluição fecal. Bacteroides são estritamente anaeróbicas, exclusivas e específicas ao trato gastrointestinal humano, apresentando especificidade a animais homeotérmicos. Por serem incapazes de resistir a ambientes aeróbios são consideradas como promissores indicadores de poluição fecal recente. A sua identificação em corpos de água é geralmente realizada pela presença do marcador genético 16S rRNA da ordem Bacteroidales. Este estudo teve como objetivos avaliar a qualidade microbiológica e físico-química da água bruta superficial da Bacia Hidrográfica do Ribeirão João Leite, responsável por 50% de abastecimento da cidade de Goiânia, e também, a avaliação do marcador 16S rRNA Bacteroidales como indicador da fonte de poluição fecal humana e/ou animal em águas desta bacia. Para tal, foram coletadas 91 amostras de água bruta superficial de 13 pontos localizados ao longo da extensão da Bacia Hidrográfica do Ribeirão João Leite, assim como, amostras de matéria fecal humana e animal de modo a testar a sensibilidade e especificidade de oligonucleotídeos iniciadores para o rastreamento do marcador 16S rRNA Bacteroidales. Baseado na Resolução CONAMA 357/2005 Classe II para águas doces, 5,5% (5/91) das amostras apresentaram nível de turbidez acima de >100 NTU (119-180 NTU), enquanto que 33% apresentaram valores inferiores a <103 CFU/100 mL para E. coli termotolerante, sendo os valores médios encontrados entre 1,24 x 103–5,03 x 104 CFU/100 mL. O marcador 16S rRNA Bacteroidales hospedeiro bovino (ruminante) foi identificado em água bruta superficial dos pontos coletados com alta influência agropecuária, em contrapartida, dos 5 pontos analisados não foi detectado a presença do marcador 16S rRNA Bacteroidales como indicador de poluição fecal humana. Os resultados obtidos poderão colaborar com medidas sanitárias que visam a redução do nível da turbidez e na identificação da origem da contaminação microbiológica fecal nesses corpos d’água minimizando, desta forma, o risco de disseminação das doenças de veiculação hídrica

Waterborne pathogen presence caused by fecal pollution is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. In developed countries, this problem can result in waterborne outbreaks. Research suggests that there is a need for better fecal indicators because current methods (total coliforms and E. coli) are insufficient. This study investigated Bacteroidales 16S rRNA markers as a microbial source tracking tool in an agricultural watershed. Correlations between pathogens and markers were also investigated. Water quality monitoring was conducted following assay validation of ruminant-, bovine-, human-specific, and universal Bacteroidales markers. Results revealed a positive relationship between E. coli and the universal marker. Ruminant- and bovine-specific marker detection was associated with increased runoff due to precipitation; however, the human associated marker was not detected. Furthermore, no correlations between Campylobacter, Salmonella, or E. coli O157:H7 could be made. Consequently, these techniques have potential to become a powerful tool; however, further research is needed

La detecció de l’orgien de la contaminació fecal a l’aigua perment millorar la gestió del medi i mitigar la contaminació en l’origen recuperant amb més eficiència les zones afectades; a més a més permet estimar el risc sanitari que porta associat; prendre les mesures legals oportunes i establir responsabilitat econòmiques. Fins a l’actualitat s’han descrit un elevat número de tècniques i marcadors que indiquen la presència de contaminació i permeten conèixer el seu origen. Abans de la implementació d’aquestes metodologies cal conèixer altres factors. Aquests mètodes s’han definit en una determinada àrea demogràfica i per una determinada població, per tant, cal conèixer si existeix variació geogràfica i temporal, saber-ne la prevalència i persistència al medi, valorar la distribució entre espècies, materialitzar procediments stàndars que puguin ser utilitzats en qualsevol laboratori. A més a més, estudis previs han suggerit que cap dels indicadors de l’origen de la contaminació fecal presenta un 100% d’eficiència i especifitat, així que és necessària la combinació de varis d’ells per tal d’incrementar la discriminació entre diferents oríigens. Aquesta treball consisteix en tres parts diferenciades que volen aprofundir ens les mancances dels mètodes per a determinar l’origen de la contaminació. En la primera part (Capítol 2) s’ha valorat 10 marcadors diferents descrits prèviament: dues espècies del gènere Bifidobacterium marcadores de contaminació humana: Bif. adolescentis i Bif. dentium, dos marcadors específics d’humans (HF183 i HF134) i dos de rumiants (CF128 i CF193) que detecten espècies no cultivades del grup Bacteroidetes, un marcador del gen esp de soques d’Enterococcus faecium específiques d’humans i 3 marcadors d’ADN mitocondrial de cèl•lules humanes, bovines i porcines. Tot i que alguns dels marcadors moleculars analitzats presenten una elevada sensibilitat i especificitat, cap d’ells assegura un 100% d’encert. Això ha fer que es valorés la possibilitat de desenvolupar models predictius amb combinacions d’ells. D’aquesta manera s’ha obtingut una discriminació del 79,6% entre 4 oríigens diferents: humà, boví, porcí i avícola i d’un 90,1% distingint entre contaminació d’origen humà o no humà. A la segona part, veient la importància de Bif. adolescentis i Bif. dentium com a marcadors de contaminació fecal humana, s’ha utilitzat la tècnica de DGGE per tal d’aprofundir en l’ecologia del gènere. S’ha analitzat la distribució d’espècies en mostres d’aigua residual de diferents orígens. Bif. adolescentis s’ha confirmat com una de les espècies majoritàries en mostres d’origen humà. A la vegada, s’han definit espècies majoritàries en mostres d’origen boví com Bif. pseudolongum ssp. pseudolongum i Bif. thermophilum. Aquesta espècie també ha estat majoritària en porcs juntament amb una espècie que no identificada prèviament. En aus s’ha detectat una sola espècie identificada com Bif. saeculare. En els últims anys s’han dissenyat un elevat nombre de PCRs i q-PCRs específiques d’espècies no cultivades del grup Bacteroidetes per discriminar entre diferents hostes. En la tercera part, s’ha volgut aprofundir en el coneixement de la persistència del gènere Bacteroides i conèixer els factors ambientals que afecten la seva supervivència. Mitjançant experiments in situ al riu Llobregat s’ha observat la persistència de les soques tipus Bact. fragilis i Bact. thetaiotaomicron, majoritàries en aparell digestiu humà i espècies ambientals de l’aigua residual. S’ha realitzat el seguiment de la supervivència mitjançant tècniques de cultiu i tècniques moleculars. S’ha observat una major supervivència de Bact. fragilis a baixes temperatures que altes. Bact. thetaiotaomicron ha mostrat el contrari, major supervivència a l’estiu quan s’ha registrat una menor concentració d’oxigen dissolt a l’aigua. En aquesta espècie s’ha descrit prèviament una menor tolerància a l’oxigen. La presència de predadors a l’aigua també afecta de manera important la supervivència del gènere. / Faecal pollution is one of the main causes of degradation of surface and coastal water quality. Faecal pollution can be attributed to different sources, for example urban sewage, sewer misconnections, slaughterhouse wastewaters, manure run-off and solid disposals. The principal faecal bacterial indicators E. coli and Enterococcus are used to show the presence of pollution as well as the faecal load in water. However, these indicators do not discriminate between the possible sources of pollution. During the last decade many authors have described different methodologies based on molecular tools to detect different Microbial Source Tracking (MST) markers. However there is a lack of knowledge about the behaviour of the markers when they appear in the environment. Usually these markers have been described in a specific geographical area. For this reason their geographical and temporal stability has to be tested. Other aspects such as their prevalence and persistence in the aquatic environment must be known and standard operating procedures must be determined. The current project aimed to address these questions. 144 samples of different human and animal sources around Catalonia were collected in order to evaluate the applicability of some described MST markers, e.g. Bifidobacterium adolescentis, Bif. dentium, Bacteroides species human and ruminant specifics, esp gene of Ent. faecium and mitochondrial DNA of human, bovine and swine cells. The specificity and sensitivity of the markers was determined. Each marker alone does not give 100% source discrimination and for that reason predictive models were developed. These models increased the capacity of source discrimination using the lowest possible number of markers. Bif. adolescentis and Bif. dentium have been described as human specific species. Denaturant gradient gel electrophoresis technique was used to broaden the knowledge of Bifidobacterium distribution among different animal sources and to describe new species specificity to enable their uses as new MST markers. In addition, Bacteroidetes species have shown themselves to be capable MST markers. How environmental factors such as temperature and dissolved oxygen affect their survival in the environment has been studied in order to predict the durability of the markers in these environments. For this purpose, molecular techniques such as PCR and Q-PCR and cultivable methodologies combined with colony hybridization were used.

Submitted by RAQUEL LUNEDO (bln.raquel@yahoo.com.br) on 2016-03-01T19:55:22Z No. of bitstreams: 1 TESE_Raquel_Lunedo_repositorio.pdf: 2945618 bytes, checksum: a9cae139d1f67fb1f8ba4fa91aef40eb (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-03-03T19:46:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lunedo_r_dr_jabo.pdf: 2945618 bytes, checksum: a9cae139d1f67fb1f8ba4fa91aef40eb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-03T19:46:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lunedo_r_dr_jabo.pdf: 2945618 bytes, checksum: a9cae139d1f67fb1f8ba4fa91aef40eb (MD5) Previous issue date: 2016-02-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A hipótese testada neste projeto é que a restrição alimentar altera a composição da microbiota intestinal e a expressão gênica hepática em frangos de corte, e estas alterações podem influenciar a deposição tecidual das aves. Outra hipótese, é que a genética do frango influencia estas variáveis, e pode alterar a sua resposta frente a restrição alimentar. Os objetivos específicos foram analisar a resposta de duas linhagens de frangos de corte (crescimento rápido – Cobb – ou lento – Label Rouge) a dois programas de restrição alimentar (quantitativa ou energética) sobre: 1) o desempenho zootécnico; 2) a deposição tecidual; 3) a microbiota de íleo e ceco; 4) a expressão de genes relacionados ao metabolismo hepático. Para tal, dois experimentos foram conduzidos, sendo que no experimento I foram utilizados 480 frangos de corte, machos, da linhagem comercial Cobb500TM e no experimento II foram utilizados 480 frangos de corte, machos, da linhagem Label Rouge. Até os 21 dias as aves receberam mesma dieta e foram criadas em temperatura termoneutra. Aos 22 dias, oito grupos de 20 aves foram distribuídos dentro de cada um dos três tratamentos experimentais: 1. Controle (ad libitum – 3,176 Mcal/kg de EM e 19% PB); 2. Restrição energética (2,224 Mcal/kg EM e 19% PB) até os 43 dias de idade, com consumo equiparado ao controle; 3. Restrição quantitativa (restrição de 70%, ou seja, as aves restritas ingeriram apenas 30% da quantidade de ração consumida pelo grupo controle – 3,176 Mcal/kg EM e 19% PB) durante 7 dias, seguido de realimentação ad libitum até os 43 dias de idade. A restrição alimentar energética diminuiu o ganho de peso e o peso da carcaça e piorou a conversão alimentar em ambas as linhagens; diminuiu as contagens do grupo Lactobacillus e aumentou as contagens de Enterococcus e Enterobacteriaceae nas aves de crescimento rápido; favoreceu a proliferação de Lactobacillus, e diminuiu as populações de Enterococcus e Enterobacteriaceae nos cecos dos frangos de crescimento lento; induziu a expressão gênica das enzimas ACACA e FASN nas aves de crescimento lento e da enzima CPT1-A nas aves de crescimento rápido; e reduziu a massa de gordura corporal nas aves de crescimento rápido. Durante a semana de restrição alimentar quantitativa, não foi verificado ganho de peso em ambas as linhagens. A restrição levou a: diminuição das contagens do grupo Lactobacillus e aumento de Enterococcus e Enterobacteriaceae nas aves de crescimento rápido; indução da expressão gênica de ACACA, FASN e SREBP- 1 e repressão da expressão de CPT1-A nas duas linhagens. No período de realimentação, foi observado comportamento hiperfágico, melhor ganho de peso e melhor conversão alimentar nas aves restritas. O ganho compensatório não foi suficiente para alcançar o mesmo peso vivo. Nos frangos de crescimento rápido, a deposição tecidual foi semelhante ao controle, porém nas aves de crescimento lento ocorreu maior deposição de gordura e menor deposição de proteína corporal nas aves restritas. Em conclusão, apesar da resposta das variáveis ganho de peso e conversão alimentar aos programas de restrição alimentar ter sido semelhante nos dois grupos genéticos, a composição e a estabilidade da microbiota intestinal de frangos de corte foram dependentes da linhagem. Adicionalmente, encontramos evidências sobre a relação entre expressão de genes lipogênicos hepáticos e a deposição de lipídeos na carcaça de frangos de corte, além de demonstrar modificações no padrão de deposição tecidual em função da velocidade de crescimento da linhagem. / The hypothesis of this project is that feed restriction alters the composition of gut microbiota and hepatic gene expression in broilers, and these changes can influence the tissue deposition of birds. The second hypothesis is that the broiler genetics influence on these variables, and can change the response in front of feed restriction. The specific objectives were investigated the response of broilers (fast – Cobb – or slow-growing – Label Rouge – strains), in front of two feed restriction programs (energetic or quantitative), on: 1) growth performance; 2) tissue deposition; 3) ileal and cecal microbiota; 4) expression of genes related to hepatic metabolism. For this, two experiments were conducted. In the experiment I, were used 480 male Cobb500TM broilers, and in the experiment II, were used 480 male Label Rouge broilers. Up to 21 days of age, the birds received the same diet and were created in thermoneutral temperature. At 22 days of age, birds were divided into 3 experimental treatments (8 replicates of 20 birds): T1. Control (ad libitum – 3.176 Mcal/kg ME and 19% CP); T2. Energetic restriction (2.224 Mcal/kg ME and 19% CP) up to 42 days with consumption equivalent to control; T3. Quantitative restriction (70% restriction, i. e., restricted broilers ingested only 30% of the quantity consumed by the control group – 3.176 Mcal/kg ME and 19% CP) for 7 days, followed by refeeding ad libitum until 42 days. Energetic restriction reduces body weight gain and carcass weight and increased feed conversion ratio in both strains; reduced the Lactobacillus and increased the Enterococcus and Enterobacteriaceae copies in fast-growing broilers; promoted the Lactobacillus proliferation and reduced Enterococcus and Enterobacteriaceae populations in ceca of slow-growing broilers; induced the gene expression of ACACA and FASN in slow-growing, and CPT1-A in fast-growing broilers; and reduced the fat mass in fast-growing broilers. During the quantitative feed restriction period, was not verified body weight gain, independently of strain. The restriction leads to: reduction in Lactobacillus and increase in Enterococcus and Enterobacteriaceae copies in fast-growing broilers; induction of ACACA, FASN and SREBP-1 and reduction in CPT1-A gene expression in both strains. During the refeeding period, was observed hyperphagic behavior, better body weight gain and lower feed conversion ratio in restricted birds. The compensatory growth was not sufficient to achieve the same 42d body weight than the control treatment. For slowgrowing broilers, there was greater fat deposition and lower protein deposition after refeeding, whereas for fast-growing broilers, no difference between control and restricted birds were found. In conclusion, although the body weight gain and feed conversion ratio response of two genetic groups in front of feed restriction programs is similar, the composition and stability of the intestinal microbiota are strongly dependent on host. Additionally, the present data provide evidence on the relationship between hepatic lipogenic gene expression and lipids deposition in broilers carcass, and demonstrated that changes in the tissue deposition is directly related to growth rate in broilers. / CNPq: 141453/2012-5 / FAPESP: 2013/05924-6

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