La detecció de l’orgien de la contaminació fecal a l’aigua perment millorar la gestió del medi i mitigar la contaminació en l’origen recuperant amb més eficiència les zones afectades; a més a més permet estimar el risc sanitari que porta associat; prendre les mesures legals oportunes i establir responsabilitat econòmiques. Fins a l’actualitat s’han descrit un elevat número de tècniques i marcadors que indiquen la presència de contaminació i permeten conèixer el seu origen. Abans de la implementació d’aquestes metodologies cal conèixer altres factors. Aquests mètodes s’han definit en una determinada àrea demogràfica i per una determinada població, per tant, cal conèixer si existeix variació geogràfica i temporal, saber-ne la prevalència i persistència al medi, valorar la distribució entre espècies, materialitzar procediments stàndars que puguin ser utilitzats en qualsevol laboratori. A més a més, estudis previs han suggerit que cap dels indicadors de l’origen de la contaminació fecal presenta un 100% d’eficiència i especifitat, així que és necessària la combinació de varis d’ells per tal d’incrementar la discriminació entre diferents oríigens. Aquesta treball consisteix en tres parts diferenciades que volen aprofundir ens les mancances dels mètodes per a determinar l’origen de la contaminació. En la primera part (Capítol 2) s’ha valorat 10 marcadors diferents descrits prèviament: dues espècies del gènere Bifidobacterium marcadores de contaminació humana: Bif. adolescentis i Bif. dentium, dos marcadors específics d’humans (HF183 i HF134) i dos de rumiants (CF128 i CF193) que detecten espècies no cultivades del grup Bacteroidetes, un marcador del gen esp de soques d’Enterococcus faecium específiques d’humans i 3 marcadors d’ADN mitocondrial de cèl•lules humanes, bovines i porcines. Tot i que alguns dels marcadors moleculars analitzats presenten una elevada sensibilitat i especificitat, cap d’ells assegura un 100% d’encert. Això ha fer que es valorés la possibilitat de desenvolupar models predictius amb combinacions d’ells. D’aquesta manera s’ha obtingut una discriminació del 79,6% entre 4 oríigens diferents: humà, boví, porcí i avícola i d’un 90,1% distingint entre contaminació d’origen humà o no humà. A la segona part, veient la importància de Bif. adolescentis i Bif. dentium com a marcadors de contaminació fecal humana, s’ha utilitzat la tècnica de DGGE per tal d’aprofundir en l’ecologia del gènere. S’ha analitzat la distribució d’espècies en mostres d’aigua residual de diferents orígens. Bif. adolescentis s’ha confirmat com una de les espècies majoritàries en mostres d’origen humà. A la vegada, s’han definit espècies majoritàries en mostres d’origen boví com Bif. pseudolongum ssp. pseudolongum i Bif. thermophilum. Aquesta espècie també ha estat majoritària en porcs juntament amb una espècie que no identificada prèviament. En aus s’ha detectat una sola espècie identificada com Bif. saeculare. En els últims anys s’han dissenyat un elevat nombre de PCRs i q-PCRs específiques d’espècies no cultivades del grup Bacteroidetes per discriminar entre diferents hostes. En la tercera part, s’ha volgut aprofundir en el coneixement de la persistència del gènere Bacteroides i conèixer els factors ambientals que afecten la seva supervivència. Mitjançant experiments in situ al riu Llobregat s’ha observat la persistència de les soques tipus Bact. fragilis i Bact. thetaiotaomicron, majoritàries en aparell digestiu humà i espècies ambientals de l’aigua residual. S’ha realitzat el seguiment de la supervivència mitjançant tècniques de cultiu i tècniques moleculars. S’ha observat una major supervivència de Bact. fragilis a baixes temperatures que altes. Bact. thetaiotaomicron ha mostrat el contrari, major supervivència a l’estiu quan s’ha registrat una menor concentració d’oxigen dissolt a l’aigua. En aquesta espècie s’ha descrit prèviament una menor tolerància a l’oxigen. La presència de predadors a l’aigua també afecta de manera important la supervivència del gènere. / Faecal pollution is one of the main causes of degradation of surface and coastal water quality. Faecal pollution can be attributed to different sources, for example urban sewage, sewer misconnections, slaughterhouse wastewaters, manure run-off and solid disposals. The principal faecal bacterial indicators E. coli and Enterococcus are used to show the presence of pollution as well as the faecal load in water. However, these indicators do not discriminate between the possible sources of pollution. During the last decade many authors have described different methodologies based on molecular tools to detect different Microbial Source Tracking (MST) markers. However there is a lack of knowledge about the behaviour of the markers when they appear in the environment. Usually these markers have been described in a specific geographical area. For this reason their geographical and temporal stability has to be tested. Other aspects such as their prevalence and persistence in the aquatic environment must be known and standard operating procedures must be determined. The current project aimed to address these questions. 144 samples of different human and animal sources around Catalonia were collected in order to evaluate the applicability of some described MST markers, e.g. Bifidobacterium adolescentis, Bif. dentium, Bacteroides species human and ruminant specifics, esp gene of Ent. faecium and mitochondrial DNA of human, bovine and swine cells. The specificity and sensitivity of the markers was determined. Each marker alone does not give 100% source discrimination and for that reason predictive models were developed. These models increased the capacity of source discrimination using the lowest possible number of markers. Bif. adolescentis and Bif. dentium have been described as human specific species. Denaturant gradient gel electrophoresis technique was used to broaden the knowledge of Bifidobacterium distribution among different animal sources and to describe new species specificity to enable their uses as new MST markers. In addition, Bacteroidetes species have shown themselves to be capable MST markers. How environmental factors such as temperature and dissolved oxygen affect their survival in the environment has been studied in order to predict the durability of the markers in these environments. For this purpose, molecular techniques such as PCR and Q-PCR and cultivable methodologies combined with colony hybridization were used.

El gènere Bifidobacterium adquireix una gran importància com a microorganisme indicador de contaminació fecal. És un dels gèneres predominants en la microbiota intestinal humana i d'alguns animals de sang calenta arribant a unes concentracions entre 109 i 1010 cèl·lules/g de femta. La fisiologia anaeròbia, els requeriments nutricionals complexes i la seva incapacitat de multiplicar-se per sota dels 30ºC, fan que Bifidobacterium no pugi replicar-se a nivell extraentèric.L'objectiu d'aquesta tesi ha estat la optimització de les tècniques presents per a la detecció de Bifidobacterium spp. en mostres d'aigua residual per a la possible utilització de certes espècies d'aquest gènere bacterià com a indicadores de la contaminació fecal i determinar l'origen d'aquesta:1. Avaluar l'enumeració de Bifidobacterium spp. en tres medis selectius diferents, i comparar les diferents poblacions bacterianes de Bifidobacterium analitzades amb altres indicadors microbians en aigües.2. Definir proporcions entre les diferents poblacions d'indicadors i les bifidobactèries que permetin diferenciar l'origen humà o animal de la contaminació fecal en aigües.3. Determinar quines espècies de Bifidobacterium que s'han associat prèviament com exclusives dels humans, es troben només en aigües residuals urbanes. 4. Desenvolupar una tècnica molecular per a la detecció de les espècies de Bifidobacterium associades exclusivament a aigües residuals d'origen humà.5. Analitzar l'ús combinat d'aquest nou mètode molecular amb la proporció de les bifidobactèries fermentadores de sorbitol i de les bifidobactèries totals en el medi selectiu HBSA.6. Desenvolupar una PCR quantitativa en temps real per a la detecció de les espècies B. adolescentis i B. dentium. 7. Comparar les dues tècniques moleculars desenvolupades, PCR múltiple ADO-DEN i PCR quantitativa en temps real en aigües residuals d'origen humà.8. Comparar la persistència de les poblacions indicadores de la contaminació fecal en aigües juntament amb el gènere Bifidobacterium en aigua de riu.Els medis selectius analitzats per a Bifidobacterium, Beerens, HBSA i BFM, van presentar unes enumeracions molt similars en aigües residuals, proporcionant una elevada especificitat per a les bifidobactèries. No obstant, el medi Beerens i HBSA van recuperar un nombre significativament igual i més elevat de bifidobactèries cultivables. La hibridació colonial amb la sonda Bif permet una confirmació pràctica de les enumeracions, donant una correcció de la fracció de creixement no específic que donen el medis utilitzats.La proporció de les colònies de Bifidobacterium fermentadores de sorbitol respecte el nombre de colònies totals crescudes en el medi HBSA és una eina eficaç per a la determinació de l'origen de la contaminació fecal. Les espècies B. adolescentis i B. dentium van presentar una elevada especificitat per a les aigües d'origen humà, tot i que no es pot descartar la presència de B. adolescentis en alguna espècie d'aviram.El desenvolupament de la PCR múltiple ADO-DEN per a les espècies B. adolescentis i B. dentium és una eina molecular complementària per a caracteritzar l'origen de la contaminació fecal en aigües. Presenta un llindar de detecció 103 UCF/100mL.Les PCRs quantitatives específiques desenvolupades permeten la quantificació de les espècies B. adolescentis i B. dentium proposades com a indicadores de la contaminació fecal humana en aigües residuals d'origen humà. Aquesta tècnica presenta un llindar de detecció més alt que la de la PCR múltiple ADO-DEN essent de 104 UCF/100mL. Hi ha una diferencia significativa (P<0,05) en les inactivacions de totes les poblacions bacterianes a l'estiu respecte les inactivacions a l'hivern on són més baixes. El gènere Bifidobacterium és potencialment un bon indicador de l'origen de la contaminació fecal recent en aigües. La seva baixa persistència en l'entorn fa però menys operatiu el seu ús quan la contaminació fecal és remota en el temps. / The genus "Bifidobacterium" is proposed as indicators to identify the source of fecal pollution, since certain "Bifidobacterium" spp. are found only in humans, since it is abundant in the intestinal microbiota of humans and other warm-blooded animals. These organisms could be used to distinguish between human and animal pollution. They are found at a concentration of between 109 and 1010 cells/g in feces. Additionally, their anaerobic physiology, complex nutritional requirements and inability to multiply below 30ºC mean that they are unlikely to reproduce in extraenteric environments.The objective of this thesis has been the optimization of the techniques presents for the detection of "Bifidobacterium" spp. in samples of residual water. The selective media analyzed for "Bifidobacterium", Beerens, HBSA and BFM, they presented some very similar enumerations in residual water, provided a high specificity for the detection of bifidobacteria. Nevertheless, the enumeration of bifidobacteria was evaluated using three selective media. Beerens and HBSA media showed similar recoveries, with no statistically significant difference and BFM showed statistically different recovery for Bifidobacterium than the recovery on Beerens and HBSA media.The confirmation by colony hybridization of colonies of "Bifidobacterium" grown on the selective media revealed that some colonies belong to anaerobic bacterial genera other than bifidobacteria. The HBSA medium allows the calculation of the ratio Y/T that showed to distinguish fecal pollution origin. Values of this ratio higher than 0.20 indicate human origin. Values below 0.20 indicate animal origin. These results support previous studies postulating the use of sorbitol-fermenting bifidobacteria as human fecal indicators in sewageIn this study a multiple PCR for "B. adolescentis" and "B. dentium" species was developed to be used as a complementary molecular tool to characterize the origin of the fecal contamination in water. The threshold of this technique is 103 CFU/100mL. In order to quantify both species a quantitative PCR for "B. adolescentis" and "B. dentium" (proposed as indicators for human fecal contamination in residual water of human origin) was developed. This technique presents a threshold higher than the PCR multiple ADO-DEN being of 104 UCF/100mL. The genus "Bifidobacterium" is potentially a good indicator of the origin of the recent fecal contamination in water. But its low persistence in the environmental waters is a handicap when the fecal pollution is not recent.