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Orientador: Ricardo de Lima Zollner / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T07:59:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferro_KarlaPriscilaVieira_D.pdf: 2593573 bytes, checksum: dbc61c553ff3b0a43d9d67bfd357abee (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: As reações alérgicas à ferroada de inseto resultam de resposta exacerbada do sistema imune, com produção de elevados níveis de anticorpos IgE alérgeno-específicos e padrão de citocinas Th2, envolvidas na diferenciação de linfócitos B específicos para aquele antígeno em células produtoras de IgE e recrutamento de células efetoras da resposta alérgica. Neste contexto, granulocitos são células efetoras importantes na fase tardia da resposta alérgica e estão envolvidos na patogênese de diferentes doenças. Eosinófilos e neutrófilos, especificamente, modulam a resposta imune por meio de diferentes mecanismos, como a secreçao de citocinas, quimiocinas e mediadores lipídicos. A IgE desempenha papel central na patogênese das doenças alérgicas, interagindo com dois receptores de membranas: alta afinidade FcsRI e baixa afinidade FcsRII (CD23). A ligação da IgE ao seu receptor em mastocitos e basófilos promove a liberação de mediadores inflamatórios, dentre eles, a histamina. A histamina além de induzir os sintomas agudos da reação alérgica, sustenta a reação inflamatória até a fase crônica, sendo estes efeitos mediados através da ativação de diferentes receptores (H1, H2, H3 e H4). Os fatores liberadores de histamina (HRF), particularmente, HRF-dependentes de IgE, induzem a liberação de histamina na fase tardia da resposta alérgica, permitindo a perpetuação dos eventos inflamatórios crônicos. Muitos estudos demonstram a eficácia da imunoterapia específica na dessensibilização e no desenvolvimento de tolerância em indivíduos com quadros graves de hipersensibilidade à ferroada de insetos, sobretudo da classe Hymenoptera. Com base nestas informações, foram objetivos do presente trabalho avaliar os efeitos modulatórios da imunoterapia sobre a expressão gênica dos receptores de histamina (H1, H2 e H4), HRF- IgE dependente e de fatores apoptóticos (Bcl-2 e BID) por RT-PCR, além da expressão gênica, através da técnica de PCR em tempo real de fatores de transcrição envolvidos na diferenciação de granulocitos como PU.1, C/EBPa, C/EBPpe GATA-1, receptores de alta (FcsRla e FcsRly) e baixa afinidade de IgE (CD23), cuja detecção protéica foi realizada por imunofluorescência e citometria de fluxo, respectivamente. Além disso, foram avaliados os níveis séricos de IgE específica, secreçao de RANTES e IL-8 nos sobrenadantes das culturas celulares e quantificação de granulocitos apoptóticos através da técnica de TÚNEL. Os granulocitos foram isolados de pacientes submetidos à imunoterapia específica ao veneno de abelha, em diferentes períodos do tratamento (Pré, 1, 3, 6, 12, 18 e 24 meses), após injeção subcutânea, e submetidas à cultura por 72 horas, com estimulo de 1 ng/mL veneno de abelha. Indivíduos não alérgicos foram estudados como grupo controle. De maneira geral, a imunoterapia específica ao veneno de abelha foi capaz de modular os elementos analisados, reduzindo significativamente a expressão dos mesmos ao final de 24 meses de tratamento. Não verificamos, apenas, modulação no número de granulocitos apoptóticos ao longo da imunoterapia. Nossos resultados inéditos fornecem informações adicionais sobre os efeitos da imunoterapia sobre granulocitos, reforçando as propriedades supressoras e tolerogênicas desta forma de tratamento / Abstract: Allergic reactions to insect stings results from a exacerbated response of the immune system, resulting in the production of high levels of allergen-specific IgE antibodies and Th2 cytokine pattern, which are involved in the differentiation process of B lymphocytes, specific for that antigen, into IgE producing cells and the recruitment of effector cells of allergic response. Eosinophils and neutrophils, specifically, modulate the immune response through different mechanisms, such as the secretion of cytokines, chemokines and lipid mediators. IgE plays a central role on allergic diseases pathogenesis, interacting with two membrane receptors: high affinity FcsRI and low affinity FcsRII (CD23). Biding of IgE with receptors on mast cells and eosinophils promotes the release of inflammatory mediators, among them, histamine. Histamine, besides inducing acute symptoms of allergic reaction, supports inflammatory response until its chronic stage; these effects are mediated through the activation of distinct receptors (H1, H2, H3 and H4). Histamine releasing factors (HRF), particularly, IgE dependent HRF, induce histamine release during the late phase of allergic response, allowing the perpetuation of chronic inflammatory events. In this context, many studies have demonstrated the efficacy of specific immunotherapy on desensitization and tolerance development in subjects with severe hypersensivity to insect stings, especially Hymenoptera. Based on all these information, the aim of the present study were to evaluate the modulating effects of immunotherapy on gene expression of histamine receptors (H1, H2 and H4), IgE dependent HRF and apoptotic factors (Bcl-2 and BID), through RT-PCR; in addition to gene expression, through real time PCR, transcriptional factors involved at granulocytes differentiation as of PU.1, C/EBPa, C/EBPp and GATA-1, and protein expression of high (FcsRIa e FcsRly)and low affinity (CD23) IgE receptors, assessed by immunofluorescence and flow cytometry, respectively. Serum levels of specific IgE were also assessed, along with RANTES and IL-8 secretion in cell culture supernatant and quantification of apoptotic granulocytes through TUNEL technique. Granulocytes were isolated from patients undergoing bee venom specific immunotherapy in different periods of treatment (Pre, 1, 3, 6, 12, 18 and 24 months), after subcutaneous injection, and cultured for 72 hours, with bee venom 1ng/ml_. Non allergic subjects were studied as control group. Overall, bee venom specific immunotherapy was able to modulate the analyzed elements, significantly reducing their expression at the end of 24 months of treatment. Modulation on the number of apoptotic granulocytes were not observed during immunotherapy. Our results provide additional information about the effects of immunotherapy over granulocytes, reinforcing the suppressor and tolerogenic properties of this treatment / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Submitted by Johnny Rodrigues (johnnyrodrigues@ufcg.edu.br) on 2018-04-25T14:31:12Z No. of bitstreams: 1 ALLYSSON FORTUNATO DE ABRANTES - DISSERTAÇÃO PPGSA 2015..pdf: 1275565 bytes, checksum: 5e0019b5b460441a322e5e237b8eac1c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-25T14:31:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ALLYSSON FORTUNATO DE ABRANTES - DISSERTAÇÃO PPGSA 2015..pdf: 1275565 bytes, checksum: 5e0019b5b460441a322e5e237b8eac1c (MD5) Previous issue date: 2015 / O veneno da abelha, a apitoxina, consiste de uma mistura complexa de compostos nitrogenados, constando de uma maior parte proteica(Melitina) e menor fração por: Apamina, adolapina, fosfolipase A2, hialuronidase e peptídeos MCD. Trata-se de um líquido transparente, com odor característico, amargo e que apresenta pH básico (4,5 a 5,5), usado pelas abelhas como elemento de defesa e que seca facilmente em temperatura ambiente. A Melitina é o componente predominante no veneno apresentando, aproximadamente, 50 % da matéria seca, trata-se de uma proteína de elevado potencial anti-inflamatório, sendo considerada o principal agente da apitoxina na terapia da artrite reumática. Junto com a apamina, a melitina estimula os sistemas adrenal e pituitário a produzirem cortisol e outros esteroides naturais, que tem relevante papel na terapia da artrite, bem como na indústria cosmecêutica. A apitoxina foi coletada no apiário El-Shaday, Assentamento Rosário, Agrovila Canudos do município de Ceará-Mirim/RN, a coleta da amostra se deu utilizando o método de choques elétricos através de eletrodos de aço inox conectados a uma bateria e lâminas de vidro posicionado no alvado da colmeia que retêm a apitoxina após a picada da abelha. O apiário produz dois tipos de apitoxina, classificada como tipo 01, pura, e tipo 02, beneficiada. Foram realizados testes de citotoxicidade, quantificação proteica e eletroforese, em ambas as amostras, a fim de avaliá-las e comparar os dois tipos de apitoxina.Na apitoxina 01 foi realizada a concentração inibitória mínima. As amostras também foram incorporadas em duas bases dermatológicas, Gel carbopol® e Emulsão aniônica para que fossem avaliadas a estabilidade Preliminar e Acelerada das formulações.A apitoxina tipo 01, apresentou 77,83% de proteínas, uma concentração inibitória mínima a partir de 1,0% e toxicidade de 962,60 µg/mL; Os testes na apitoxina 02 apresentaram um teor proteico de 51,87% e uma citotoxicidade 154,82 µg/mL resultados possivelmente afetados pela contaminação ainda presente neste tipo de amostra após o beneficiamento. A eletroforese demonstrou que a apitoxina apresenta o mesmo perfil proteico, independente do processo de extração. Porém, a apitoxina tipo 02, aponta a diferença de uma unidade que não se revelou neste produto. As formulações mantiveram-se estáveis durante todo período de avaliação de sua estabilidade, 90 dias, onde foram avaliados pH, viscosidade, caracteres organolépticos, espalhabilidade, nas três diferentes condições de armazenamento: temperatura ambiente, 5 °C e 40 °C, exceção feita à emulsão aniônica conservada à 40 °C em que perdeu estabilidade a partir do trigésimo dia. / The bee venom, the apitoxin, is a complex mixture of nitrogenous compounds, having largely represented by melittin protein and a smaller fraction consisting of: Apamin, adolapina, phospholipase A2, hyaluronidase and peptides MCD. It is a transparent liquid, with characteristic odour, bitter and that presents basic pH (4.5 to 5.5), used by bees as a defense and that dry easily at room temperature. The Melittin is the predominant component in poison showing approximately 50% of the dry matter, it is a high protein anti-inflammatory potential, being considered the main agent of apitoxin on rheumatic arthritis therapy. Along with the apamin, melittin stimulates the adrenal and pituitary systems to produce cortisol and other steroids, which has important role in arthritis therapy, as well as in the cosmeceutical industry. The apitoxin was collected in the Apiary El-Shaday, Settlement, Agrovila Straws of municipality of Ceara – Mirin/ RN. sample collection occurred using the method of electric shocks through electrodes of stainless steel connected to a battery and glass blades positioned at the hive entrance of the hive that retain the apitoxin after bee sting. The Apiary produces two types of apitoxin, classified as type 01, pure, and type 02 milled. Cytotoxicity tests were performed, and protein quantification in both samples in order to evaluate them and compare the two types of apitoxin, on 01 was still held the apitoxin minimum inhibitory concentration. The samples were also incorporated into two bases, carbopol Gel ® skin and anionic emulsion for primary and Accelerated stability evaluated formulations. The apitoxin type 01, 77.83% protein, introduced a minimum inhibitory concentration from 1% and toxicity of 962.60 µ g/mL; Tests on apitoxin 02 presented a protein content of 51.87% and a cytotoxicity 154.82 µ/mL results possibly affected by the contamination still present in this sample type after the processing. Electrophoresis showed that apitoxin features the same protein profile, regardless of the extraction process. However, the apitoxin 02 type, presents the difference in a unit that didn't report revealed in this product. The wording remained stable throughout assessment period of its stability, 90 days, where they were evaluated pH, viscosity, organoleptic characters, spreadability, in three different storage conditions: room temperature 5° C and 40° C, except the anionic emulsion stored at 40° C that lost stability from the 30th day.