Este trabalho teve por objetivo estudar a produtividade do processo de produção de β-galactosidase de leveduras em biorreator utilizando soro de queijo como meio de cultura. Na primeira parte do estudo determinou-se a influência das velocidades de aeração e de agitação do biorreator na produção de β-galactosidase pela levedura Kluyveromyces marxianus. As condições de agitação e aeração testadas foram: 500rpm e 3L/min (condição I); 600rpm e 6L/min (condição II) e 700rpm e 9L/min (condição III). Os resultados mostraram que esta levedura, considerada Crabtree negativa, produz etanol, cuja concentração é maior nas condições de menor aeração. A produção de β-galactosidase mostrou-se dependente das velocidades de aeração, sendo menor na condição de maior aeração, e sendo que a maior produtividade da enzima foi atingida na condição intermediária de oxigenação (condição II). Após, estudou-se diferentes estratégias de alimentação objetivando culturas de alta concentração celular de K. marxianus em cultivos batelada alimentada. Foram testados dois perfis de alimentação (linear e exponencial), três tempos de alimentação (20, 25 e 35 horas) e três diferentes concentrações do meio de alimentação (soro de queijo concentrado duas, três ou quatro vezes). Os resultados mostraram que os cultivos em regime de batelada alimentada não geraram altas concentrações de biomassa. Contudo, a inserção contínua de lactose no meio de cultura induziu uma alta atividade específica de β-galactosidase, aumentando, conseqüentemente, a atividade volumétrica e a produtividade do processo. A melhor estratégia de alimentação, linear crescente durante 25 horas com soro de queijo três vezes concentrado, resultou em uma produtividade β-galactosidase de 291U/(L.h), 50% maior que a produtividade da cultura em batelada. Paralelamente a este estudo, construiu-se uma cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae produtora de β-galactosidase. A levedura S. cerevisiae W303 foi transformada com os plasmídeos integrativos LAC4 e LAC12, que codificam β-galactosidase e lactose-permease de Kluyveromyces lactis. A cepa transformante BLR030 foi escolhida entre as outras devido ao seu crescimento e produção de β-galactosidase. Um meio de cultura composto por soro de queijo desproteinizado suplementado por extrato de levedura (1%) e peptona (3%) foi escolhido, entre os meios testados, para os experimentos em biorreator. Foram realizados cultivos em regime de batelada e batelada alimentada com alimentação linear crescente durante 25 (FB25), 35 (FB35) e 50 (FB50) horas. Os cultivos FB35 e FB50 apresentaram as maiores atividades específicas da enzima (em torno de 1.800U/g) e também a maior produtividade de β-galactosidase (180U/(L.h)).

Este trabalho teve por objetivo estudar a produtividade do processo de produção de β-galactosidase de leveduras em biorreator utilizando soro de queijo como meio de cultura. Na primeira parte do estudo determinou-se a influência das velocidades de aeração e de agitação do biorreator na produção de β-galactosidase pela levedura Kluyveromyces marxianus. As condições de agitação e aeração testadas foram: 500rpm e 3L/min (condição I); 600rpm e 6L/min (condição II) e 700rpm e 9L/min (condição III). Os resultados mostraram que esta levedura, considerada Crabtree negativa, produz etanol, cuja concentração é maior nas condições de menor aeração. A produção de β-galactosidase mostrou-se dependente das velocidades de aeração, sendo menor na condição de maior aeração, e sendo que a maior produtividade da enzima foi atingida na condição intermediária de oxigenação (condição II). Após, estudou-se diferentes estratégias de alimentação objetivando culturas de alta concentração celular de K. marxianus em cultivos batelada alimentada. Foram testados dois perfis de alimentação (linear e exponencial), três tempos de alimentação (20, 25 e 35 horas) e três diferentes concentrações do meio de alimentação (soro de queijo concentrado duas, três ou quatro vezes). Os resultados mostraram que os cultivos em regime de batelada alimentada não geraram altas concentrações de biomassa. Contudo, a inserção contínua de lactose no meio de cultura induziu uma alta atividade específica de β-galactosidase, aumentando, conseqüentemente, a atividade volumétrica e a produtividade do processo. A melhor estratégia de alimentação, linear crescente durante 25 horas com soro de queijo três vezes concentrado, resultou em uma produtividade β-galactosidase de 291U/(L.h), 50% maior que a produtividade da cultura em batelada. Paralelamente a este estudo, construiu-se uma cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae produtora de β-galactosidase. A levedura S. cerevisiae W303 foi transformada com os plasmídeos integrativos LAC4 e LAC12, que codificam β-galactosidase e lactose-permease de Kluyveromyces lactis. A cepa transformante BLR030 foi escolhida entre as outras devido ao seu crescimento e produção de β-galactosidase. Um meio de cultura composto por soro de queijo desproteinizado suplementado por extrato de levedura (1%) e peptona (3%) foi escolhido, entre os meios testados, para os experimentos em biorreator. Foram realizados cultivos em regime de batelada e batelada alimentada com alimentação linear crescente durante 25 (FB25), 35 (FB35) e 50 (FB50) horas. Os cultivos FB35 e FB50 apresentaram as maiores atividades específicas da enzima (em torno de 1.800U/g) e também a maior produtividade de β-galactosidase (180U/(L.h)).

Orientador: Cesar Costapinto Santana / Tese (doutorado) - Univesidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-28T14:24:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_JoseAntonioMarques_D.pdf: 4578484 bytes, checksum: 323128289403636eb3b02a79b3f58a97 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Nos últimos anos, a utilização das enzimas na indústria vem aumentando rapidamente,mas ainda existe um grande campo para a sua expansão.A 'beta¿-Galactosidase pode ser utilizada para a preparação de diversos produtos lácteos com baixo teor de lactose, tais como: leite para consumo, iogurtes, sorvetes, queijos, doce-de-Ieite, entre outros. Este trabalho de pesquisa envolveu a determinação experimental e modelagem matemática das características de transferência de massa para um sistema enzima adsorvente ('beta¿-Galactosidase de Scopulariopsis sp. e a resina aniônica Accell Plus QMA), com a análise do fator de concentração e de purificação da enzima e de sua respectiva atividade, quando submetidas às operações de adsorção e eluição em leitos fixos, e uma etapa final de purificação através de filtração em gel. A enzima 'beta¿-Galactosidase foi produzida através de cultivo em substrato sólido (farelo de trigo e água) utilizando-se o fungo Scopulariopsis sp. Verificou-se que polifenóis presentes no material impediam a adsorção da enzima na resina aniônica. Estudou-se o uso de operações de ultrafiltração, precipitação em acetona, e diálise, e também a combinação dessas operações, para remover polifenóis no preparo de soluções contendo a enzima. Verificou-se que todas essas operações combinadas removem polifénois, porém não na totalidade. Obteve-se isotermas de adsorção, curvas cinéticas em tanque agitado e curvas de ruptura, tanto de proteína como atividade da enzima ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: : In last years, enzyme utilization in industry has been increasing fast, but a large field still remains for it's complete expansion. Beta-Galactosidase may be used for preparations of different milky products containing lower lactose levels. The aim of this work was the experimental determination and mathematical modeling of mass transfer characteristics for an enzyme-adsorbent system (Beta-Galactosidase from Scopulariopsis sp. And the anionic resin Accell Plus QMA), including analysis of concentration factor and enzyme activity and purification, when submitted to adsorption operations and fixed-bed elution, and a final step involving purification from gel filtration. The Beta-Galactosidase enzyme was produced from solid substrate cultivation (wheat bran and water) of Scopulariopsis sp. It was verified that the presence of polyphenols into the material impeded enzyme adsorption on the anionic resin. It was studied the use of some operations, such as ultrafiltration, acetone precipitation, dialysis and the combination on them in arder to remove the polyphenols during the preparation of the solutions containing the enzyme. It was obtained adsorption isotherms, kinetic curves in stirred tank and breakthrough curves of protein as much as enzyme activity. The mathematical models applied to adsorption in stirred tank and chromatography columns were discretized by the orthogonal collocation method ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Engenharia de Processos / Doutor em Engenharia Química

While providing non-invasive tissue detection, magnetic resonance imaging (MRI) presently possesses limited sensitivity for protein target recognition. This limitation was addressed for the target beta-galactosidase (beta-gal) by constructing three beta-gal-specific MRI probes. The probes are based on a bipartite design in which a vasoactive moiety known as a diazeniumdiolate (NONOate) is bound to a specifier, specifically galactose. Upon galactose' interaction with beta-gal, the NONOate is cleaved from galactose, and actively generates nitric oxide (NO). The released NO leads to microvascular permeability changes in surrounding tissues affecting localized T1 measurements. These changes serve as a quantitative index of beta-gal detection. The three beta-gal-specific NO-releasing probes constructed include GALPYRNONO, GALPIPNONO and a 'bi-functional' probe, which is similar to the first two but with glucose additionally incorporated so that the third probe may easily cross cellular membranes. Synthesis and characterization of this novel class of MRI probes are described in this work. / Keywords: non-invasive detection, magnetic resonance imaging (MRI), nitric oxide (NO), diazeniumdiolates (NONOates), NO-releasing compounds, novel MRI probes, molecular targets, protein targets, specifier, vasoactive, vasodilation, microvascular permeability, tissue localization, bipartite systems, bifunctional probes, blood-brain barrier, cell membrane trafficking, saccharide-bound NONOates, sugar diazeniumdiolates, glycosylated diazeniumdiolates, galactose, beta-galactosidase, glucose, glucose transporters, thermal & photolytic degradation, half-life optimization, Griess test, rat serum, stability.

Die vorliegende Arbeit hatte vorrangig zum Ziel, die enzymatische Synthese von prebiotischen Galactooligosacchariden (GOS) in Süß- und Sauermolke unter Nutzung verschiedener Enzymquellen zu evaluieren. Aufgrund des tendenziell weltweit steigenden Molkenaufkommens besteht großes Interesse, eine möglichst ganzheitliche Wertschöpfung dieses teilweise ungenutzten Rohstoffs zu generieren. Eine Möglichkeit, um dies zu realisieren, wäre die Herstellung einer GOS-haltigen Molke und eine entsprechende Weiterverarbeitung zu GOS-haltigen Lebensmitteln. Durch die generell hohe Temperatur- und pH-Toleranz von GOS sind vielfältige Applikationsmöglichkeiten gegeben. Neben den kommerziell verfügbaren β-Galactosidasen aus Aspergillus oryzae und Kluyveromyces lactis wurden Enzyme aus Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (kurz: L. bulgaricus) und Cryptococcus laurentii im Labormaßstab hergestellt und charakterisiert. Mit beiden Enzymen konnten höhere GOS-Ausbeuten in niedrig konzentrierten Lactoselösungen (Puffer als auch Molke) erhalten werden als mit den beiden kommerziellen Enzymen. Während die β-Galactosidase aus K. lactis stark vom umgebenden Medium beeinflusst wird, so zeigen alle anderen Enzyme eine gute Übertragbarkeit der Ergebnisse von Puffer auf das Substrat Süß- bzw. Sauermolke. Die höchste Transgalactosylierungsaktivität weist das Enzym aus C. laurentii mit Ausbeuten von ca. 50 % (inkl. GOS-Disaccharide) auf. Bei Verwendung der L. bulgaricus-Lactase können die Gesamtausbeute als auch die GOS-Zusammensetzung in Abhängigkeit von der gewählten Synthesetemperatur gezielt beeinflusst werden. Des Weiteren wurde der Einfluss einer parallel zur Synthese stattfindenden Glucose-Entfernung durch enzymatische Oxidation untersucht. Trotz tendenziell begünstigter Synthese von Tri- und höheren Oligosacchariden konnte die Ausbeute mit A. oryzae nicht signifikant gesteigert werden. Die Kopplung mit K. lactis führte zu einer signifikant verringerten Synthese von GOS-Disacchariden, wodurch die Ausbeute insgesamt sank. Der Einsatz von Glucose-Oxidase und Katalase ist demnach nur bei β-Galactosidasen empfehlenswert, welche vorrangig Tri- und kaum Disaccharide synthetisieren. Der Einsatz mehrerer β-Galactosidase-Enzyme stellte sich als vielversprechend heraus. In Abhängigkeit von den jeweils kombinierten Enzymen konnte die Ausbeute teilweise gesteigert werden. Positiv erwies sich eine sequentielle Kombination von A. oryzae und K. lactis im Sinne der Steigerung der Gesamtausbeute und der parallele Einsatz von A. oryzae und C. laurentii im Sinne der Erhöhung der Strukturdiversität der GOS-Mischung.:Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGS- UND SYMBOLVERZEICHNIS IV ABBILDUNGSVERZEICHNIS VIII TABELLENVERZEICHNIS XIII 1 EINLEITUNG UND ZIELSTELLUNG 1 2 STAND DES WISSENS 4 2.1 Molke: Aufkommen, Inhaltsstoffe und Verwertungsmöglichkeiten 4 2.2 β-Galactosidasen 7 2.2.1 Aufbau und Eigenschaften 7 2.2.2 Inhibitoren und Aktivatoren in Milch und Molke 8 2.2.3 Einfluss von Glucose und Galactose 9 2.2.4 Kommerzielle β-Galactosidase-Präparate 11 2.3 Galactooligosaccharide 12 2.3.1 Definition und Syntheseweg 12 2.3.2 Einflussgrößen auf die Reaktion 14 2.3.2.1 Enzymquelle 14 2.3.2.2 Lactosekonzentration 16 2.3.2.3 Reaktionsbedingungen 17 2.3.2.4 Einfluss von Glucose und Galactose 21 2.3.3 GOS-Synthese in Milch und Molke 22 2.3.4 GOS-Synthese mit Lactobacillus sp. 26 2.3.5 GOS-Synthese mit Cryptococcus laurentii 26 2.3.6 GOS-Synthese mit mehreren β-Galactosidasen 27 2.3.7 Möglichkeiten der Glucose-Entfernung 27 2.3.8 Kommerziell erhältliche GOS-Produkte 28 2.3.9 Eigenschaften und Anwendung 30 2.3.10 Modifizierte GOS-Strukturen und GOS-Alternativen 32 3 MATERIAL UND METHODEN 40 3.1 Materialien 40 3.1.1 Verwendete Enzyme 40 3.1.2 Verwendete Mikroorganismen 40 3.1.3 Verwendete Molkeproben 40 3.1.4 Verwendete Geräte 40 3.2 Bestimmung der Inhaltsstoffe von Molke 40 3.3 Mikroorganismenkultivierung und Enzymgewinnung 41 3.3.1 Biochemische Analysenmethoden 41 3.3.2 Herstellung der Rohextrakte aus Lactobacillus sp. 41 3.3.3 Kultivierung im Labormaßstab 42 3.3.3.1 Lactobacillus bulgaricus LB4 42 3.3.3.2 Cryptococcus laurentii 43 3.3.4 Kultivierung im Fermentormaßstab (L. bulgaricus LB4) 43 3.4 Assays zur Bestimmung der Enzymaktivität 43 3.4.1 β-Galactosidase 43 3.4.2 Glucose-Oxidase 44 3.4.3 Katalase 44 3.4.4 Berechnung der Enzymaktivität 45 3.5 Enzymcharakterisierung 45 3.5.1 Temperatur- und pH-Optimum 45 3.5.2 Bestimmung von Aktivatoren und Inhibitoren 46 3.5.3 Enzymstabilität 46 3.6 Galactooligosaccharid-Synthese 47 3.6.1 Verwendung von kommerziellen β-Galactosidasen 47 3.6.2 Verwendung von β-Galactosidase aus Lactobacillus bulgaricus LB4 47 3.6.3 Verwendung von Cryptococcus laurentii-Zellen 47 3.6.4 Kopplung mit Glucose-Oxidase und Katalase 48 3.6.5 Kopplung mehrerer β-Galactosidasen 48 3.7 Galactooligosaccharid-Analytik 49 3.8 Statistische Auswertung 50 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 51 4.1 Zusammensetzung der Molken 51 4.2 Charakterisierung der β-Galactosidasen 52 4.2.1 Temperatur- und pH-Optimum 52 4.2.2 Inhibitoren und Aktivatoren 55 4.2.3 Stabilität in Puffer und Molke 57 4.3 Synthese von Galactooligosacchariden 61 4.3.1 Synthese mit β-Galactosidase aus K. lactis 61 4.3.1.1 Synthese in Puffer 61 4.3.1.2 Synthese in Süßmolke 64 4.3.1.3 Synthese in Sauermolke 66 4.3.2 Synthese mit β-Galactosidase aus A. oryzae 67 4.3.2.1 Synthese in Puffer 67 4.3.2.2 Synthese in Süßmolke 69 4.3.2.3 Synthese in Sauermolke 70 4.3.3 Synthese mit β-Galactosidase aus L. bulgaricus LB4 73 4.3.3.1 Synthese in Puffer 73 4.3.3.2 Synthese in Süßmolke 76 4.3.4 Synthese mit C. laurentii-Zellen 78 4.3.4.1 Synthese in Puffer 78 4.3.4.2 Synthese in Sauermolke 80 4.3.5 Vergleich der untersuchen Enzyme und Substrate 83 4.3.6 Kopplung mit Glucose-Oxidase und Katalase 88 4.3.6.1 Charakterisierung von Glucose-Oxidase und Katalase 88 4.3.6.2 Einfluss simultaner Glucose-Entfernung auf die GOS-Ausbeute 90 4.3.6.3 Schlussfolgerungen 95 4.3.7 Kombination mehrerer β-Galactosidasen 95 4.3.7.1 Kopplung von A. oryzae und K. lactis 95 4.3.7.2 Kopplung von A. oryzae und C. laurentii 100 4.3.7.3 Schlussfolgerungen 105 4.4 Untersuchungen zur β-Galactosidase-Synthese mit L. bulgaricus LB4 106 4.4.1 Nährmedienumstellung auf koscher-/halal-zertifizierte Bestandteile 106 4.4.2 Kultivierung im Fermentormaßstab 111 5 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 114 6 LITERATURVERZEICHNIS 118 7 ANHANG 140 7.1 Anhang zu Kapitel 2 140 7.2 Anhang zu Kapitel 3 165 7.2.1 Verwendete Geräte 165 7.2.2 Zusammensetzung MRS-Medium 166 7.2.3 Wachstum von C. laurentii 167 7.2.4 Anfangslactosekonzentrationen 167 7.2.5 Katalaseaktivität 168 7.2.6 Vergleich GOS-Disaccharidanalytik 169 7.3 Anhang zu Kapitel 4 170 7.3.1 Temperaturabhängigkeit von verschiedenen β-Galactosidasen 170 7.3.2 Aktivatoren und Inhibitoren 171 7.3.3 Grafiken zur β-Galactosidase-Stabilität 173 7.3.4 Katalase-Stabilität 182 7.3.5 Aminosäuresequenz von β-Galactosidase aus L. bulgaricus LB4 183 7.3.6 Grafiken zur GOS-Synthese mit kommerziellen β-Galactosidasen 184 7.3.7 Grafiken zur GOS-Synthese mit β-Galactosidase aus L. bulgaricus LB4 188 7.3.8 Daten zur GOS-Synthese mit β-Galactosidase aus C. laurentii 190 7.3.9 Vergleich der maximalen GOS-Ausbeute in Puffer und Molke 191 7.3.10 Grafik zur GOS-Synthese mit β-Galactosidase/GOX/KAT 192 7.3.11 Grafiken zur GOS-Synthese mit mehreren β-Galactosidasen 193 7.3.12 Grafiken zur Kultivierung von L. bulgaricus LB4 194 / The prior aim of the present work was to study the synthesis of prebiotic galactooligosaccharides (GOS) in sweet and acid whey by using various enzyme origins. Worldwide, an increase in whey production can be observed, thus a complete usage of this partially wasted resource is preferable. This could be implemented by producing a GOS containing whey and its subsequent processing to GOS containing foods. Due to the high temperature stability over a wide pH range, manifold food applications are possible. Besides the commercial available β-galactosidases from Aspergillus oryzae and Kluyveromyces lactis, enzymes from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (short: L. bulgaricus) and Cryptococcus laurentii were produced on the laboratory scale and characterized accordingly. With both enzymes, higher GOS yields in low lactose solutions (buffer as well as whey) were achieved compared to the two commercial enzymes. While the β-galactosidase from K. lactis was strongly influenced by the surrounding environment, all other tested enzymes showed a good transferability of the results from buffer to sweet and acid whey, respectively. The enzyme from C. laurentii exhibited the highest affinity to transgalactosylation, the yield being about 50 % (including GOS disaccharides). When using the L. bulgaricus lactase, total GOS yield as well as GOS composition can be adjusted via the synthesis temperature. Furthermore, the effect of glucose depletion during GOS synthesis using enzymatic oxidation was examined. Although a tendency towards the synthesis of tri- and higher oligosaccharides was observed, GOS yield by A. oryzae was not significantly enhanced. The combination with the K. lactis enzyme led to a significantly reduced synthesis of GOS disaccharides, resulting in a decreased total GOS yield. Thus, the use of glucose oxidase and catalase is only beneficial for β-galactosidases, which have a preference for synthesizing trisaccharides, but less disaccharides. The use of more than one β-galactosidase has shown to be promising. Depending on the respective enzyme combinations, it was partially possible to enhance the GOS yield. Positive results in terms of increasing total GOS yield were obtained using a consecutive coupling of A. oryzae and K. lactis, while in terms of enhancing the structural diversity of the GOS mixture, a simultaneous combination of A. oryzae und C. laurentii led to the best results.:Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGS- UND SYMBOLVERZEICHNIS IV ABBILDUNGSVERZEICHNIS VIII TABELLENVERZEICHNIS XIII 1 EINLEITUNG UND ZIELSTELLUNG 1 2 STAND DES WISSENS 4 2.1 Molke: Aufkommen, Inhaltsstoffe und Verwertungsmöglichkeiten 4 2.2 β-Galactosidasen 7 2.2.1 Aufbau und Eigenschaften 7 2.2.2 Inhibitoren und Aktivatoren in Milch und Molke 8 2.2.3 Einfluss von Glucose und Galactose 9 2.2.4 Kommerzielle β-Galactosidase-Präparate 11 2.3 Galactooligosaccharide 12 2.3.1 Definition und Syntheseweg 12 2.3.2 Einflussgrößen auf die Reaktion 14 2.3.2.1 Enzymquelle 14 2.3.2.2 Lactosekonzentration 16 2.3.2.3 Reaktionsbedingungen 17 2.3.2.4 Einfluss von Glucose und Galactose 21 2.3.3 GOS-Synthese in Milch und Molke 22 2.3.4 GOS-Synthese mit Lactobacillus sp. 26 2.3.5 GOS-Synthese mit Cryptococcus laurentii 26 2.3.6 GOS-Synthese mit mehreren β-Galactosidasen 27 2.3.7 Möglichkeiten der Glucose-Entfernung 27 2.3.8 Kommerziell erhältliche GOS-Produkte 28 2.3.9 Eigenschaften und Anwendung 30 2.3.10 Modifizierte GOS-Strukturen und GOS-Alternativen 32 3 MATERIAL UND METHODEN 40 3.1 Materialien 40 3.1.1 Verwendete Enzyme 40 3.1.2 Verwendete Mikroorganismen 40 3.1.3 Verwendete Molkeproben 40 3.1.4 Verwendete Geräte 40 3.2 Bestimmung der Inhaltsstoffe von Molke 40 3.3 Mikroorganismenkultivierung und Enzymgewinnung 41 3.3.1 Biochemische Analysenmethoden 41 3.3.2 Herstellung der Rohextrakte aus Lactobacillus sp. 41 3.3.3 Kultivierung im Labormaßstab 42 3.3.3.1 Lactobacillus bulgaricus LB4 42 3.3.3.2 Cryptococcus laurentii 43 3.3.4 Kultivierung im Fermentormaßstab (L. bulgaricus LB4) 43 3.4 Assays zur Bestimmung der Enzymaktivität 43 3.4.1 β-Galactosidase 43 3.4.2 Glucose-Oxidase 44 3.4.3 Katalase 44 3.4.4 Berechnung der Enzymaktivität 45 3.5 Enzymcharakterisierung 45 3.5.1 Temperatur- und pH-Optimum 45 3.5.2 Bestimmung von Aktivatoren und Inhibitoren 46 3.5.3 Enzymstabilität 46 3.6 Galactooligosaccharid-Synthese 47 3.6.1 Verwendung von kommerziellen β-Galactosidasen 47 3.6.2 Verwendung von β-Galactosidase aus Lactobacillus bulgaricus LB4 47 3.6.3 Verwendung von Cryptococcus laurentii-Zellen 47 3.6.4 Kopplung mit Glucose-Oxidase und Katalase 48 3.6.5 Kopplung mehrerer β-Galactosidasen 48 3.7 Galactooligosaccharid-Analytik 49 3.8 Statistische Auswertung 50 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 51 4.1 Zusammensetzung der Molken 51 4.2 Charakterisierung der β-Galactosidasen 52 4.2.1 Temperatur- und pH-Optimum 52 4.2.2 Inhibitoren und Aktivatoren 55 4.2.3 Stabilität in Puffer und Molke 57 4.3 Synthese von Galactooligosacchariden 61 4.3.1 Synthese mit β-Galactosidase aus K. lactis 61 4.3.1.1 Synthese in Puffer 61 4.3.1.2 Synthese in Süßmolke 64 4.3.1.3 Synthese in Sauermolke 66 4.3.2 Synthese mit β-Galactosidase aus A. oryzae 67 4.3.2.1 Synthese in Puffer 67 4.3.2.2 Synthese in Süßmolke 69 4.3.2.3 Synthese in Sauermolke 70 4.3.3 Synthese mit β-Galactosidase aus L. bulgaricus LB4 73 4.3.3.1 Synthese in Puffer 73 4.3.3.2 Synthese in Süßmolke 76 4.3.4 Synthese mit C. laurentii-Zellen 78 4.3.4.1 Synthese in Puffer 78 4.3.4.2 Synthese in Sauermolke 80 4.3.5 Vergleich der untersuchen Enzyme und Substrate 83 4.3.6 Kopplung mit Glucose-Oxidase und Katalase 88 4.3.6.1 Charakterisierung von Glucose-Oxidase und Katalase 88 4.3.6.2 Einfluss simultaner Glucose-Entfernung auf die GOS-Ausbeute 90 4.3.6.3 Schlussfolgerungen 95 4.3.7 Kombination mehrerer β-Galactosidasen 95 4.3.7.1 Kopplung von A. oryzae und K. lactis 95 4.3.7.2 Kopplung von A. oryzae und C. laurentii 100 4.3.7.3 Schlussfolgerungen 105 4.4 Untersuchungen zur β-Galactosidase-Synthese mit L. bulgaricus LB4 106 4.4.1 Nährmedienumstellung auf koscher-/halal-zertifizierte Bestandteile 106 4.4.2 Kultivierung im Fermentormaßstab 111 5 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 114 6 LITERATURVERZEICHNIS 118 7 ANHANG 140 7.1 Anhang zu Kapitel 2 140 7.2 Anhang zu Kapitel 3 165 7.2.1 Verwendete Geräte 165 7.2.2 Zusammensetzung MRS-Medium 166 7.2.3 Wachstum von C. laurentii 167 7.2.4 Anfangslactosekonzentrationen 167 7.2.5 Katalaseaktivität 168 7.2.6 Vergleich GOS-Disaccharidanalytik 169 7.3 Anhang zu Kapitel 4 170 7.3.1 Temperaturabhängigkeit von verschiedenen β-Galactosidasen 170 7.3.2 Aktivatoren und Inhibitoren 171 7.3.3 Grafiken zur β-Galactosidase-Stabilität 173 7.3.4 Katalase-Stabilität 182 7.3.5 Aminosäuresequenz von β-Galactosidase aus L. bulgaricus LB4 183 7.3.6 Grafiken zur GOS-Synthese mit kommerziellen β-Galactosidasen 184 7.3.7 Grafiken zur GOS-Synthese mit β-Galactosidase aus L. bulgaricus LB4 188 7.3.8 Daten zur GOS-Synthese mit β-Galactosidase aus C. laurentii 190 7.3.9 Vergleich der maximalen GOS-Ausbeute in Puffer und Molke 191 7.3.10 Grafik zur GOS-Synthese mit β-Galactosidase/GOX/KAT 192 7.3.11 Grafiken zur GOS-Synthese mit mehreren β-Galactosidasen 193 7.3.12 Grafiken zur Kultivierung von L. bulgaricus LB4 194

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A intolerância à lactose é caracterizada pela falta da enzima lactase (β-galactosidase) e atinge quase 50% da população. O tratamento se baseia em uma dieta restritiva de produtos lácteos o que pode acarretar em prejuízo nutricional e estar associada com a diminuição da densidade mineral óssea e fraturas. Nosso objetivo foi avaliar uma formulação de lactase gastro-resistente para garantir uma maior atividade no local de ação da enzima (lúmen do intestino delgado). Concomitantemente, também avaliamos a estabilidade e a atividade enzimática do produto comercial americano (comprimidos de Lactaid® 9000 U). E por fim, desenvolvemos um método analítico para quantificar o teor de lactase em formulações sólidas através da espectroscopia na região do infravermelho. Ao realizar o teste de estabilidade nota-se que a embalagem primária é fundamental na manutenção da atividade enzimática da lactase. Ao término do estudo de estabilidade, os comprimidos que estavam dentro da sua embalagem primária tiveram uma diminuição da sua atividade de aproximadamente 7,5%, enquanto os comprimidos que foram armazenados fora da sua embalagem original tiveram uma perda de aproximadamente 35%. Ao realizar o teste de dissolução também do produto comercial americano nota-se que a formulação existente não é capaz de proteger a enzima da ação degradante do ambiente gástrico do estômago, apresentando ao final do teste uma perda de 65% de atividade enzimática. Em comparação com a forma farmacêutica gastro-resistente, não houve perda de atividade durante a etapa ácida e ao final do ensaio de dissolução a atividade encontrada foi de 93%. Quanto ao método de quantificação por infravermelho, constatou-se que a o melhor modelo de calibração multivariada (PLS) apresenta 7 VL, RMSECV de 4,3 %, RMSEP de 1,2% e os dados obtidos com o MIR é muito similar com os dados obtidos pelo método USP de referência. / Lactose intolerance is characterized by the absence of the enzyme lactase (β-galactosidase) and affects almost 50% of the population. The treatment is based on a restrictive diet of dairy products which can result in nutritional loss and is associated with decreased bone mineral density and fractures. Our aim was to evaluate a lactase gastro formulation to ensure increased activity in the action site of the enzyme (lumen of the small intestine). Simultaneously, we also evaluated the stability and enzyme activity of the american commercial product (tablets of Lactaid® 9000 U). And lastly, we developed an analytical method for measuring the lactase content in solid formulations by spectroscopy in the infrared region. In carrying out the stability test to note that the primary packaging is critical in maintaining the enzymatic activity of lactase. At the end of the stability study, the tablets that were in the primary package had a decrease in their activity by approximately 7.5%, while the tablets were stored outside of its original container had a loss of approximately 35%. When carrying out dissolution test also the american commercial product it is noted that the existing formulation is not able to protect the enzyme from the degrading action of gastric environment of the stomach, with the end of the test a loss of 65% of enzyme activity. Compared with the gastroresistant pharmaceutical form there was no loss of activity during the acid step and the end of the dissolution test the activity was found 93%. As regards the measurement method by IR, it was found that the best multivariate calibration model (PLS) features 7 LV, RMSECV 4.3%, RMSEP of 1.2% and the data obtained with MIR is very similar to the data obtained by the USP reference method. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Several lactic acid bacteria contain β-galactosidases. Beta galactosidases catalyze lactose hydrolysis and transfer acceptor sugars onto galactose, producing galactooligosaccharides. The aim of this work was to exploit β-galactosidases of lactic acid bacteria as crude cell extracts to produce novel oligosaccharides with mannose, N-acetylglucosamine, and fucose. Of 17 strains of lactic acid bacteria, transferase activity was the strongest in crude cell extracts of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, followed by Streptococcus thermophilus, Lactobacillus animalis, and Lactobacillus reuteri in a buffered 19% (w/w) lactose solution. Incorporation of 6 % (w/w) glycerol increased transferase activity and enzyme stability at higher incubation temperatures. Incorporation of 10% (w/w) mannose, N-acetylglucosamine and fucose as acceptor sugars yielded three distinct oligosaccharides with mannose and two with N-acetylglucosamine and fucose, with the composition confirmed using gas chromatography-mass spectrometry. This is the first public report indicating production of oligosaccharides containing N-acetylglucosamine and fucose from β-galactosidases of lactic acid bacteria.

Des travaux de recherche en fermentation liquide ont montré que P. canescens est une souche hyperproductrice de xylanases non contaminées par des activités cellulolytiques et amylolytiques. Selon les scientifiques, lintérêt de lutilisation industrielle de ces hémicellulases dans différents secteurs (particulièrement dans la formulation daliments pour le bétail, en industries des jus de fruits et brassicoles, en amidonnerie, en industrie du papier, en pharmacie, dans les textiles et dans la production du bioéthanol) va croître significativement. Mais le développement de ces enzymes est fréquemment limité par le coût de production. Ce travail sest intéressé à loptimisation de la production des xylanases de P. canescens à partir de matières premières peu coûteuses telles les résidus agro-industriels par fermentation solide, une technique traditionnellement utilisée dans la fermentation des aliments en Asie. Létude a démontré que le tourteau de soja est un bon inducteur de la production des xylanases. La teneur initiale en eau, le pH initial, la température de la culture et laération active influencent la synthèse de l'enzyme. Compte tenu des résultats obtenus à léchelle du laboratoire, la transposition à léchelle industrielle serait facilitée naturellement par de fines épaisseurs de cultures statiques, ce qui réduit de moitié le coût de production comparativement à la fermentation liquide. Les expérimentations ont confirmé que la production de xylanases par P. canescens répondait à des phénomènes dinduction et de répression dépendant du substrat et des conditions physico-chimiques de croissance, et non pas à des phénomènes de régulation de type quorum sensing. Lenzyme sous forme liquide concentrée présente une bonne stabilité pendant six mois sans protection préalable (stérilisation, stabilisation ou inhibition de protéases).

The aim of this research was the production of beta-galactosidase from thermophilic fungi for use in low lactose milk production or other possible applications. For this purpose, three thermophilic fungi Humicola insolens, Torula thermophila and Thermomyces lanuginosus were screened for lactase production. Highest lactase activity was observed in Thermomyces lanuginosus. The carbon source inducing highest extracellular lactase production in Thermomyces lanuginosus was determined as arabinose. When grown on arabinose T. lanuginosus produced two major lactase activity peaks, one being at day 4 (beta-galactosidase-A) and second starting following the initiation of biomass degradation at day 3 suggesting the existence of a cell wall-bound beta-galactosidase (beta-galactosidase-B). Maximum activity of the second enzyme was at day 10. Crude enzyme stored at 4&ordm / C and -20&ordm / C was stable over a period of one month. Optimum pH and temperature of crude enzyme were found as pH 6.8 and 65&ordm / C. For concentration of extracellular enzyme, fractional ammonium sulfate precipitation with 60-85% salt was applied. Comparisons with commercial lactase obtained from Kluyveromyces lactis revealed that partially purified lactase from Thermomyces lanuginosus was 1.3 times more efficient in hydrolysis of lactose even at 30&ordm / C which is optimum for Kluyveromyces lactis. Lactose hydrolysis was enhanced at higher temperatures and reached maximum at 50-60&ordm / C giving 4.7 fold higher hydrolysis than Kluyveromyces lactis beta-galactosidase. Molecular weight of the second enzyme was determined as 156 kDa by gel filtration. Being an extracellular enzyme with optimum pH suitable for dairy processes, high thermotolerance and stability, this enzyme has a potential for commercial use.