β-glicosidases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações β-glicosídicas, e diversas aplicações biotecnológicas são postuladas para β-glicosidases microbianas. Este estudo apresenta a triagem de substratos para a produção de uma β-glicosidase extracelular por Monascus purpureus NRRL1992 em cultivo submerso, bem como a purificação parcial e a caracterização da enzima. A produção da enzima demonstrou ser indutível e controlada por repressão catabólica. A maior produção de β-glicosidase foi observada com a utilização de resíduo de uva e peptona como substratos. A purificação parcial da β-glicosidase envolveu a precipitação com acetona e etapas de cromatografia líquida (gel-filtração e interação hidrofóbica), resultando em fator de purificação de 92 vezes e recuperação de 23% a partir do extrato bruto. A enzima apresentou atividade ótima em amplas faixas de temperaturas e pHs frente ao substrato p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo (pNPβG), sendo selecionadas as condições de 50 °C e pH 5,5. A β-glicosidase demonstrou ser moderadamente termoestável, apresentando atividade residual de 78% após 120 minutos a 60 °C. Os íons Hg2+ e Cr3+ inibiram a atividade β-glicolítica, provavelmente através de modificações estruturais da enzima. β-mercaptoetanol, SDS, entre outros reagentes não afetaram a catálise. Etanol ou metanol em baixas concentrações estimularam a atividade enzimática, possivelmente devido à atuação da enzima como glicosiltransferase; contudo, o aumento na concentração destes álcoois reduziu a atividade enzimática. A hidrólise de pNPβG, celobiose, maltose, salicina e n-octil-β-D-glicopiranosídeo indica a ampla especificidade da enzima frente à diferentes substratos. As constantes cinéticas Km e Vmax foram definidas para pNPβG, celobiose e maltose, sendo observados valores intermediários para β-glicosidases. Glicose e celobiose inibiram competitivamente a hidrólise de pNPβG. / β-glucosidases are enzymes that catalyse the hydrolysis of β-glycosidic linkages, and various biotechnological applications are proposed for microbial β-glucosidases. This study presents the screening of substrates for extracellular β-glucosidase production by Monascus purpureus NRRL1992 in submerged cultivations, as well as the enzyme partial purification and caracterization. The enzyme production showed to be inducible and controled by catabolic repression. The higher β-glucosidase production was observed with grape residue and peptone as substrates. The β-glucosidase partial purification involved acetone precipitation and liquid chromatography steps (gel-filtration and hydrophobic interaction), resulting in a 92-fold purification factor and a recovery of 23% from the crude extract. The enzyme showed optimal activity in a wide range of temperatures and pH values for p-nitrophenyl-β-Dglucopyranoside (pNPβG) hydrolysis. β-glucosidases are enzymes that catalyse the hydrolysis of β-glycosidic linkages, and various biotechnological applications are proposed for microbial β-glucosidases. This study presents the screening of substrates for extracellular β-glucosidase production by Monascus purpureus NRRL1992 in submerged cultivations, as well as the enzyme partial purification and caracterization. The enzyme production showed to be inducible and controled by catabolic repression. The higher β-glucosidase production was observed with grape residue and peptone as substrates. The β-glucosidase partial purification involved acetone precipitation and liquid chromatography steps (gel-filtration and hydrophobic interaction), resulting in a 92-fold purification factor and a recovery of 23% from the crude extract. The enzyme showed optimal activity in a wide range of temperatures and pH values for p-nitrophenyl-β-Dglucopyranoside (pNPβG) hydrolysis.

β-glicosidases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações β-glicosídicas, e diversas aplicações biotecnológicas são postuladas para β-glicosidases microbianas. Este estudo apresenta a triagem de substratos para a produção de uma β-glicosidase extracelular por Monascus purpureus NRRL1992 em cultivo submerso, bem como a purificação parcial e a caracterização da enzima. A produção da enzima demonstrou ser indutível e controlada por repressão catabólica. A maior produção de β-glicosidase foi observada com a utilização de resíduo de uva e peptona como substratos. A purificação parcial da β-glicosidase envolveu a precipitação com acetona e etapas de cromatografia líquida (gel-filtração e interação hidrofóbica), resultando em fator de purificação de 92 vezes e recuperação de 23% a partir do extrato bruto. A enzima apresentou atividade ótima em amplas faixas de temperaturas e pHs frente ao substrato p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo (pNPβG), sendo selecionadas as condições de 50 °C e pH 5,5. A β-glicosidase demonstrou ser moderadamente termoestável, apresentando atividade residual de 78% após 120 minutos a 60 °C. Os íons Hg2+ e Cr3+ inibiram a atividade β-glicolítica, provavelmente através de modificações estruturais da enzima. β-mercaptoetanol, SDS, entre outros reagentes não afetaram a catálise. Etanol ou metanol em baixas concentrações estimularam a atividade enzimática, possivelmente devido à atuação da enzima como glicosiltransferase; contudo, o aumento na concentração destes álcoois reduziu a atividade enzimática. A hidrólise de pNPβG, celobiose, maltose, salicina e n-octil-β-D-glicopiranosídeo indica a ampla especificidade da enzima frente à diferentes substratos. As constantes cinéticas Km e Vmax foram definidas para pNPβG, celobiose e maltose, sendo observados valores intermediários para β-glicosidases. Glicose e celobiose inibiram competitivamente a hidrólise de pNPβG. / β-glucosidases are enzymes that catalyse the hydrolysis of β-glycosidic linkages, and various biotechnological applications are proposed for microbial β-glucosidases. This study presents the screening of substrates for extracellular β-glucosidase production by Monascus purpureus NRRL1992 in submerged cultivations, as well as the enzyme partial purification and caracterization. The enzyme production showed to be inducible and controled by catabolic repression. The higher β-glucosidase production was observed with grape residue and peptone as substrates. The β-glucosidase partial purification involved acetone precipitation and liquid chromatography steps (gel-filtration and hydrophobic interaction), resulting in a 92-fold purification factor and a recovery of 23% from the crude extract. The enzyme showed optimal activity in a wide range of temperatures and pH values for p-nitrophenyl-β-Dglucopyranoside (pNPβG) hydrolysis. β-glucosidases are enzymes that catalyse the hydrolysis of β-glycosidic linkages, and various biotechnological applications are proposed for microbial β-glucosidases. This study presents the screening of substrates for extracellular β-glucosidase production by Monascus purpureus NRRL1992 in submerged cultivations, as well as the enzyme partial purification and caracterization. The enzyme production showed to be inducible and controled by catabolic repression. The higher β-glucosidase production was observed with grape residue and peptone as substrates. The β-glucosidase partial purification involved acetone precipitation and liquid chromatography steps (gel-filtration and hydrophobic interaction), resulting in a 92-fold purification factor and a recovery of 23% from the crude extract. The enzyme showed optimal activity in a wide range of temperatures and pH values for p-nitrophenyl-β-Dglucopyranoside (pNPβG) hydrolysis.

β-glicosidases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações β-glicosídicas, e diversas aplicações biotecnológicas são postuladas para β-glicosidases microbianas. Este estudo apresenta a triagem de substratos para a produção de uma β-glicosidase extracelular por Monascus purpureus NRRL1992 em cultivo submerso, bem como a purificação parcial e a caracterização da enzima. A produção da enzima demonstrou ser indutível e controlada por repressão catabólica. A maior produção de β-glicosidase foi observada com a utilização de resíduo de uva e peptona como substratos. A purificação parcial da β-glicosidase envolveu a precipitação com acetona e etapas de cromatografia líquida (gel-filtração e interação hidrofóbica), resultando em fator de purificação de 92 vezes e recuperação de 23% a partir do extrato bruto. A enzima apresentou atividade ótima em amplas faixas de temperaturas e pHs frente ao substrato p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo (pNPβG), sendo selecionadas as condições de 50 °C e pH 5,5. A β-glicosidase demonstrou ser moderadamente termoestável, apresentando atividade residual de 78% após 120 minutos a 60 °C. Os íons Hg2+ e Cr3+ inibiram a atividade β-glicolítica, provavelmente através de modificações estruturais da enzima. β-mercaptoetanol, SDS, entre outros reagentes não afetaram a catálise. Etanol ou metanol em baixas concentrações estimularam a atividade enzimática, possivelmente devido à atuação da enzima como glicosiltransferase; contudo, o aumento na concentração destes álcoois reduziu a atividade enzimática. A hidrólise de pNPβG, celobiose, maltose, salicina e n-octil-β-D-glicopiranosídeo indica a ampla especificidade da enzima frente à diferentes substratos. As constantes cinéticas Km e Vmax foram definidas para pNPβG, celobiose e maltose, sendo observados valores intermediários para β-glicosidases. Glicose e celobiose inibiram competitivamente a hidrólise de pNPβG. / β-glucosidases are enzymes that catalyse the hydrolysis of β-glycosidic linkages, and various biotechnological applications are proposed for microbial β-glucosidases. This study presents the screening of substrates for extracellular β-glucosidase production by Monascus purpureus NRRL1992 in submerged cultivations, as well as the enzyme partial purification and caracterization. The enzyme production showed to be inducible and controled by catabolic repression. The higher β-glucosidase production was observed with grape residue and peptone as substrates. The β-glucosidase partial purification involved acetone precipitation and liquid chromatography steps (gel-filtration and hydrophobic interaction), resulting in a 92-fold purification factor and a recovery of 23% from the crude extract. The enzyme showed optimal activity in a wide range of temperatures and pH values for p-nitrophenyl-β-Dglucopyranoside (pNPβG) hydrolysis. β-glucosidases are enzymes that catalyse the hydrolysis of β-glycosidic linkages, and various biotechnological applications are proposed for microbial β-glucosidases. This study presents the screening of substrates for extracellular β-glucosidase production by Monascus purpureus NRRL1992 in submerged cultivations, as well as the enzyme partial purification and caracterization. The enzyme production showed to be inducible and controled by catabolic repression. The higher β-glucosidase production was observed with grape residue and peptone as substrates. The β-glucosidase partial purification involved acetone precipitation and liquid chromatography steps (gel-filtration and hydrophobic interaction), resulting in a 92-fold purification factor and a recovery of 23% from the crude extract. The enzyme showed optimal activity in a wide range of temperatures and pH values for p-nitrophenyl-β-Dglucopyranoside (pNPβG) hydrolysis.

Orientadores: Francisco Maugeri Filho, Renato de Azevedo Moreira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-21T19:53:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_Gilcenara_M.pdf: 1974223 bytes, checksum: 647b7e3918cb207ca7de16931074a977 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A celulose é um material amplamente encontrado na natureza. A hidrólise deste material é resultado de um complexo enzimático que age em sinergismo, denominado celulase. Neste complexo a enzima ß-glicosidase (EC 3.2.1.21) é responsável pelo passo final da hidrólise para formação do produto glicose. Esta enzima tem várias aplicações nos diversos setores industriais, atuando principalmente de forma suplementar, ou seja, é acrescida ao sistema enzimático assim aumentando a cinética da hidrólise. Na indústria alimentícia pode-se destacar a extração e clarificação de sucos, a hidrólise de vegetais para preparação de pures, para alimentação infantil ou geriátrica. Este trabalho se propõe a determinar os parâmetros envolvidos no processo de separação e purificação da ß-glicosidase, a partir de um complexo enzimático, Celulase Tr (Cellumax), para então aplicá-los ao sistema CARE (Continuous Affinity Recycle Extraction). No processo de purificação foram utilizadas técnicas cromatográficas. Iniciou-se com cromatografia de filtração em gel, seguida de cromatografia de troca iônica. Obtiveram-se melhores resultados com o uso de CM-Sephadex C-50. As frações correspondentes aos picos obtidos nesta cromatografia foram concentradas e aplicadas em coluna de Superose 12 R acoplada ao sistema de FPLC (Faster Performance Liquid Chromatography) a fim de confirmar a pureza da enzima ß-glicosidase. O material obtido foi submetido a análise de eletroforese em gel de poliacrilamida/dodecil sulfeto de Sódio (PAGE/SDS), garantindo desta forma que a enzima estava realmente pura. Os resultados obtidos mostram que é possível a aplicação do processo CARE para separar e purificar a ß-glicosidase. Como continuidade a este trabalho, sugere-se a determinação das constantes cinéticas envolvidas na adsorção-dessorção da resina usada no sistema CARE / Abstract: Cellulose is a very common natural substance. The hydrolysis of this material is caused by an enzyme complex, acting synergistically, known as cellulase. In such a complex, the enzyme ß-glucosidase (EC 3.2.1.21) is responsible for the final step of hydrolysis to form glucose. This enzyme has numerous industrial applications. Particularly important among applications in the food industry we may include the lightening of juices and the hydrolysis of vegetables for production of purees, for infants and elderly. This work was carried out to try to find the parameters involved in the separation and purification of , ß-glucosidase, from an enzymatic complex called Cellulase Tr (Cellumax), and then, to apply them in the CARE (Continuous Affinity Recycle Extraction) system. The purification process began with gel filtration chromatography and followed by ion-exchange chromatography. The best results were obtained using CM-Sephadex C-50. The peak fractions obtained with ion-exchange cromatography were concentrated and applied to a Superose 12 R column in a FPLC system to confirm the purity of the , Abstract: Cellulose is a very common natural substance. The hydrolysis of this material is caused by an enzyme complex, acting synergistically, known as cellulase. In such a complex, the enzyme Abstract: Cellulose is a very common natural substance. The hydrolysis of this material is caused by an enzyme complex, acting synergistically, known as cellulase. In such a complex, the enzyme ß-glucosidase (EC 3.2.1.21) is responsible for the final step of hydrolysis to form glucose. This enzyme has numerous industrial applications. Particularly important among applications in the food industry we may include the lightening of juices and the hydrolysis of vegetables for production of purees, for infants and elderly. This work was carried out to try to find the parameters involved in the separation and purification of , ß-glucosidase, from an enzymatic complex called Cellulase Tr (Cellumax), and then, to apply them in the CARE (Continuous Affinity Recycle Extraction) system. The purification process began with gel filtration chromatography and followed by ion-exchange chromatography. The best results were obtained using CM-Sephadex C-50. The peak fractions obtained with ion-exchange cromatography were concentrated and applied to a Superose 12 R column in a FPLC system to confirm the purity of the , ß-glucosidase. For the material obtained with Superose, a PAGE/SDS analysis was undertaken to garantee the purity of the enzime. The results obtained make possible the application of CARE process to the separation and purification of ß-glucosidase. In addition, from the results it is possible to calculate the kinetic constants involved in the resin adsorption-desorption used in the CARE system. ß-glucosidase (EC 3.2.1.21) is responsible for the final step of hydrolysis to form glucose. This enzyme has numerous industrial applications. Particularly important among applications in the food industry we may include the lightening of juices and the hydrolysis of vegetables for production of purees, for infants and elderly. This work was carried out to try to find the parameters involved in the separation and purification of , ß-glucosidase, from an enzymatic complex called Cellulase Tr (Cellumax), and then, to apply them in the CARE (Continuous Affinity Recycle Extraction) system. The purification process began with gel filtration chromatography and followed by ion-exchange chromatography. The best results were obtained using CM-Sephadex C-50. The peak fractions obtained with ion-exchange cromatography were concentrated and applied to a Superose 12 R column in a FPLC system to confirm the purity of the , ß-glucosidase. For the material obtained with Superose, a PAGE/SDS analysis was undertaken to garantee the purity of the enzime. The results obtained make possible the application of CARE process to the separation and purification of ?-glucosidase. In addition, from the results it is possible to calculate the kinetic constants involved in the resin adsorption-desorption used in the CARE system.-glucosidase. For the material obtained with Superose, a PAGE/SDS analysis was undertaken to garantee the purity of the enzime. The results obtained make possible the application of CARE process to the separation and purification of ß-glucosidase. In addition, from the results it is possible to calculate the kinetic constants involved in the resin adsorption-desorption used in the CARE system. / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Orientador: Yong Kun Park / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-03T20:01:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Aguiar_ClaudioLimade_D.pdf: 3633403 bytes, checksum: a077bdb4a30340781da556e96aa2116b (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: As isoflavonas são conhecidas por suas atividades biológicas tais como, atividades estrogênica, antifúngica, antioxidante e antitumoral (mama e próstata), além de inibir a atividade de enzimas ligadas à divisão celular, sendo estas atividades biológicas mais acentuadas nas formas agliconas que glicosiladas. Sua presença em produtos de soja, tem sido relatada como importante para a saúde humana, além do que o Brasil é o maior exportador de soja no mundo a partir de 2003. O presente trabalho de tese teve como objetivos, avaliar os teores de isoflavonas e seus conjugados presentes em cultivares de soja brasileiros e em alguns produtos à base de soja, bem como, discutir os efeitos associados à presença de isoflavonas, em suas diferentes formas, nas propriedades biológicas (antioxidante, antiinflamatória e antimicrobiana) encontradas em extratos alcoólicos de soja. Analisou-se os teores de isoflavonas em cultivares de soja (Glycine max L.) provenientes de diferentes órgãos estaduais e federais de pesquisa em soja e o efeito da temperatura na extração de isoflavonas de soja. As concentrações mais elevadas de isoflavonas foram obtidas principalmente por extração alcoólica em solução 80 ou 90% de metanol e solução 60 ou 70% de etanol. Foi avaliada a composição de isoflavonas presentes em soja, após tratamento térmico e por radiação gama. A farinha de soja foi tratada por aquecimento a 100 e 121°C por 20, 40 e 60 min; a 121°C por 40 e 60 min, alonil-isoflavonas em farinha de soja foram completamente transformadas a glicosil-isoflavonas. A radiação gama também promoveu a redução no conteúdo de isoflavonas. O extrato metanólico de soja tratado por radiação gama apresentou uma perda gradual no conteúdo de isoflavonas totais (perda de 33,5%), mas em farinha de soja, rica em fibras, a radiação gama teve pouco efeito (perda de 9,96%). Por outro lado, o fungo filamentoso Aspergillus onJzae ATCC 22786 produziu alta atividade de 13-glicosidase, a qual foi capaz de converter glicosil-isoflavonas em agliconas presentes em farinha de soja. Glicosil-isoflavonas (daidzina, glicitina e genistina) foram eficientemente transformadas às suas formas agliconas (daidzeína, gliciteína e genisteína) por fermentação em estado sólido por 48 h a 30°C com esporos (107 esporosjmL) ou pela l3-glicosidase de A. oryzae, após 30 min a 40°C. Após o tratamento da farinha de soja com P-glicosidase, 85,5% das glicosil-isoflavonas foram hidrolisadas às formas agliconas. O tratamento térmico a 121°C seguido da reação enzimática, produziu grande quantidade de isoflavonas agliconas. Portanto, o tratamento combinado de aquecimento a 121°C e reação com p-glicosidase de A. oryzae ATCC 22786 pode transformar eficientemente malonil-isoflavonas a glicosil-conjugados e, posteriormente, a agliconas. Além disso, os extratos metanólicos de farinha de soja tratada com aquecimento e P-glicosidase demonstraram elevadas atividades antioxidantes. No entanto, o tratamento com aquecimento e reação enzimática não mostrou claramente um aumento nas atividades antimicrobiana e antiinflamatória. / Abstract: The isoflavones from soybean are known to have several biological properties such as estrogenic, antimicrobial and antitumoral (breast and prostate) activities, besides inhibiting the activity of enzymes linked to the cellular division. These properties are shown to be more accentuated in the aglycone than glycoside forms. Their presence in soy products have been reported with a number of beneficial health effects. In addition, Brazil is a major soybean producer in the World. The main objectives of this work of Thesis was to evaluate the isoflavone contents, and its conjugate forms, present in different Brazilian soybean cultivars, as well as, in some soy products. Other objective of this work, was to discuss the effects associated to the presence of isoflavones with some biological properties (antioxidant, anti-inflammatory, and antimicrobial) into alcoholic extracts of soybean. The isoflavone contents was analyzed in different soybean cultivars donated by State and Federal Organization on Soy Research, and the effect of the temperature in the extraction of soybean isoflavones. The high isoflavone concentrations were obtained mainly by alcoholic extraction using 80% methanol and 60% ethanol solutions. As a major soybean producer, Brazil finds important to characterize the isoflavone composition of the some Brazilian soybean cultivars, which were treated with heat processing and gamma irradiation. Soybean flour was treated by heating at 100 and 121°C for 20, 40, and 60 mino At 121°C for 40 and 60 min, the isoflavone malonate into defatted soybean flour was completely converted to their glycoside conjugates. Gamma irradiation also promoted some reduction in isofIavone profiles. The methanolic extract of soybean treated by y-radiation had a gradual decreasing in their isofIavone contents (loss of 33.5%), but on soybean fIour, rich in fiber, the y-radiation had a little effect (loss of 9.96%). On the other hand, the filamentous fungus Aspergillus oryzae ATCC 22786 a high f3-glucosidase producer, was found to be able to convert glycoside isofIavones to aglycones forms present into soybean fIour. It was observed that the glycoside isofIavones extracted such as, daidzin, glycitin and genistin, were efficiently transformed into their aglycones forms (daidzein, glycitein and genistein) by solidstate fermentation after 48 h at 30°C with A. oryzae spores (107 sporesjmL) or f3-glucosidase after 30 min at 40°C. After treatment of the methanolic extracts with f3-glucosidase, 85.5% of glycoside isofIavones were hydrolyzed by this enzyme to form aglycones. The enzymatic reaction on the methanolic extract from the soybean sample treated at 121°C indicated that the glycoside isoflavones were efficiently transformed into aglycones. Therefore, combined application of heat treatment at 121°C and the fungal p-glucosidase could transform efficiently malonylglycoside isoflavones and glycoside isoflavones to aglycones. Furthermore, methanolic extracts of soybean sample treated by heating and with P-glucosidase demonstrated higher antioxidant activity. However, the treatment by heating and enzyme reaction do not show an increasing in the antimicrobial and anti-inflammatory activities. / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Hélia Harumi Sato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-16T13:30:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bedani_CarolinaCasagrande_M.pdf: 909079 bytes, checksum: 17274331f891e68042559fd5f2939310 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: As ß-glicosidases (ß-D-glucosídeo glucohidrolase, EC 3.2.1.21) catalisam a hidrólise de dissacarídeos e glicosídeos conjugados a partir da extremidade não redutora. A enzima ß-glicosidase apresenta inúmeras aplicações na indústria de alimentos e farmacêutica, atuando na hidrólise da celobiose em glicose, no processo de conversão da celulose em glicose em combinação com outras enzimas celulolíticas; na liberação de compostos de aroma em sucos de frutas e vinho; na hidrólise de compostos cianogênicos, presentes em plantas e resíduos agroindustriais e na transformação de isoflavonas glicosiladas de soja em isoflavonas agliconas, que podem ser utilizadas para reposição hormonal. Entre as linhagens de Aspergillus sp., Aspergillus oryzae, Mucor miehei, Penicillium sp. E Trichoderma viride a primeira apresentou a maior produção de ß-glicosidase. Na fermentação da linhagem Aspergillus sp. em meio semi sólido composto de farelo de trigo (Natur¿s): casca de maracujá: água destilada, na proporção 1:1:0,4; foram obtidos, respectivamente, 25,75 U/g, 45,88 U/g e 9,29 U/g de ß-glicosidase utilizando-se os substratos p-NPG, celobiose e amigdalina, após 30 minutos a 50°C. A ß-glicosidase bruta de Aspergillus oryzae apresentou atividade ótima na faixa de pH 5,0 - 5,5 e uma fração com atividade em pH 7,0. A enzima apresentou temperatura ótima de atividade na faixa de 45 - 50°C e mostrou-se estável a 45°C após 30 minutos de incubação em pH 5,0 e na faixa de pH 5,0 - 7,0 após 2 h a 47°C. A ß-glicosidase bruta de Penicillium sp. apresentou atividade ótima em pH 4,0 a 50°C e a 60ºC, evidenciando a presença de iso enzimas. Mostrou-se estável a 55°C após 30 minutos de incubação em pH 5,0 e apr esentou maior estabilidade na faixa de pH 3,0 - 7,0 após 2 h a 60°C. A ß-glicosidase bruta de Trichoderma viride mostrou atividade ótima em pH 5,0 - 5,5 e 45ºC e mostrou-se estável a 45°C após 30 minutos de incubação em pH 5,0 e na faixa de pH 5,0 - 7,0 após 2 h a 45°C . A ß-glicosidase bruta de Aspergillus sp. apresentou atividade ótima em pH 4,5 e 60°C, estabilidade a 60°C após 30 minutos de incubação em pH 4,5 e na faixa de pH 3,0 - 8,5 após 2 h de incubação a 60°C. A ß-glicosidase de Aspergillus sp. apresentou valores de Km de 3,41 mM e Vmax de 72,46 µmol p nitrofenol/mL.min para o substrato p-NPG. Após fracionamento com sulfato de amônio 80% e cromatografia em coluna DEAE-celulose, a ß-glicosidase de Aspergillus sp. foi parcialmente purificada cerca de 38 vezes com recuperação de 2,5%. Utilizando-se planejamento experimental a ß-glicosidase parcialmente purificada apresentou atividade ótima em pH 4,5 e 60°C e estabilidade na faixa de pH de 3,6 - 5,0 e temperatura de 30 - 50°C após 2 h de incubação. A ß-glicosidase parcialmente purificada de Aspergillus sp. apresentou atividade de hidrólise da celobiose, p-NPG e amigdalina / Abstract: The ß-glucosidases (ß-D-glucoside glucohydrolase, EC 3.2.1.21) catalyze the hydrolysis of disaccharides and conjugate glycosides from the non-reducing end. The ß-glucosidases have several applications in the food and pharmaceutical industries such as the hydrolysis of cellobiose into glucose, the conversion of cellulose into glucose together with other cellulolytic enzymes; the release of flavour compounds into fruit juices and wine; the hydrolysis of cyanogenic compounds present in plants and agro-industrial residues and the conversion of isoflavone glycosides into the soy isoflavone aglycone, which can be used for hormone replacement. Of the strains Aspergillus sp., Aspergillus oryzae, Mucor miehei, Penicillium sp. and Trichoderma viride, the first showed the greater production of ß-glucosidase. In the fermentation by the Aspergillus sp. strain in a semi-solid medium containing wheat bran: passion fruit peel: distilled water, in a ratio of 1:1:0.4; 25.75 U/g, 45.88 U/g and 9.29 U/g of ß-glucosidase were obtained, respectively, using p-NPG, amygdalin and cellobiose as the substrate, after 30 minutes at 50°C. The crude ß-glucosidase obtained from Aspergillus oryzae showed a fraction with optimal activity at pH 5.0 ¿ 5.5, and another fraction with activity at pH 7.0. The enzymes showed optimum activity in the temperature range from 45 to 50°C and were stable after 30 minutes of incubation at 45°C and pH 5.0, and also after 2 hours at 47°C in the pH range from 5.0 to 7.0. The crude ß-glucosidase from Penicillium sp. showed optimal activity at pH 4.0 and isoenzymes with optimal activity at 50°C and 60ºC. The enzymes showed stability after 30 minutes of incubation at 55°C and pH 5.0, and were stable in the pH range from pH 3.0 to 7.0 after 2 hours at 60°C. The crude ß-glucosidase from Trichoderma viride showed optimal activity in the pH range from 5.0 to 5.5 at 45°C; stability after 30 minutes of incubation at 45°C and pH 5.0 and stabil ity in the pH range from 5.0 to 7.0 after 2 hours at 45°C. The crude ß-glucosidase from Aspergillus sp. Showed optimal activity at pH 4.5 and 60°C; stability afte r 30 minutes of incubation at 60°C and pH 4.5, and stability in the pH range from 3.0 to 8.5 after 2 hours of incubation at 60°C. The ß-glucosidase from Aspergillus sp. showed a Km value of 3.41 mM and Vmax of 72.46 mmol p-nitrophenyl/mL.min with p-NPG as the substrate. After fractionation with 80% ammonium sulphate and chromatography on a DEAEcellulose column, the ß-glucosidase from Aspergillus sp. was purified 38 fold with a recovery of 2.5%. Using an experimental design the partially purified ß-glucosidase showed optimal activity at pH 4.5 and 60°C, and sta bility in the pH range from 3.6 to 5.0 and temperature range from 30°- 50°C, after 2 hours of incubation. The partially purified ß-glucosidase from Aspergillus sp. showed hydrolytic activity with respect to cellobiose, p-NPG and amygdalin / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Glicosídeos essenciais a vida podem ser sintetizados por métodos enzimáticos com altíssima especificidade. O mecanismo de reação de β-glicosidases GH1 por dupla-substituição envolve a formação de intermediário covalente (glicosil-enzima) que pode seguir duas rotas. Uma envolve sua hidrólise na ligação β-glicosídica entre glicone e aglicone do substrato, liberando o monossacarídeo da extremidade não-redutora; enquanto na outra rota, transglicosilação ou síntese por controle cinético, o intermediário é atacado por um aceptor glicosídico (2ª molécula de substrato), gerando um novo glicosídeo. BglB possui resíduos (W e H) que formam um \"canal\" por onde a água ataca o intermediário covalente no sítio ativo, sendo alvos de potenciais mutações que alteram o balanço entre as rotas e ampliando a eficiência de transglicosilação. Para caracterizar as bases moleculares da razão entre essas duas rotas catalíticas, β-glicosidases da família GH1 Spodoptera frugiperda (Sfβglu; AF052729) e Tenebrio molitor (Tmβglu; AF312017) foram produzidas como enzimas recombinantes em leveduras Pichia pastoris GS115, concentradas com 90% (p/v) de sulfato de amônio e diálise reversa com PEG 10000, e dialisadas em tampão CP 100 mM pH 6. A pureza foi confirmada por banda única com tamanho semelhante a 50 kDa (Sfβgly) e 56 kDa (Tmβgly) em SDS-PAGE. A atividade recuperada após purificação é 152% (Sfβgly) e 171% (Tmβgly) e a concentração protéica de 0,134 µg/µL (Sfβgly) e 0,217 µg/µL (Tmβgly). A razão entre as reações de hidrólise e transglicosilação (vH/vT) foi analisada utilizando os substratos pNPβ-gluco (0,1 mM a 8 mM) e MUβ-gluco (0,1 mM a 40 mM), a partir da velocidade de formação dos produtos pNP ou MU e glicose, respectivamente. Tmβgly catalisa reações de transglicosilação com ambos, mas vH/vT depende da [S] variando de +∞ (vH>>vT) a 1,5 para pNPβ-gluco e +∞ a 1 para MUβ-gluco. Sfβgly, ao contrário, não transglicosila com substrato MUβ-gluco. Além disso, vH/vT para pNPβ-gluco é 2 e independe da [S]. Já Sfβgly K201F conjuga propriedades de ambas, pois não transglicosila com MUβ-gluco, mas para pNPβ-gluco há ocorrência de transglicosilação dependente da [S], variando de +∞ (vH>>vT) a 1,25. Os parâmetros cinéticos (Vmax e Km) foram ajustados no Enzifitter e por simulação numérica na equação do modelo cinético ping-pong para dois substratos, e mostram maior (Km2) em Tmβgly e Sfβgly K201F do que em Sfβgly. Também foi avaliado o efeito da adição de aceptores alternativos que substituem a água em ensaios com pNPβ-gluco 4mM na presença de alcóois. Para as três enzimas a adição de metanol torna a vglc menor do que de vpNP, indicando ocorrência de transglicosilação. Com adição de n-propanol vH/vT diminui cerca de 7 vezes em Sfβgly e 2 vezes em Tmβgly. Os efeitos destes alcoóis sobre Sfβgly são maiores do que para Tmβgly e Sfβgly K201F, sugerindo acesso mais fácil destes ao intermediário covalente em Sfβgly, indicando diferenças entre as enzimas na configuração desta região. Portanto, notamos que vH/vT não está ligada à afinidade pela segunda molécula de substrato, podendo ser modulada por mutação do resíduo K201 de Sfβgly, posição relacionada ao acesso da água ou aceptor alternativo ao sítio ativo. / Glycosides are essential to life and can be synthesized by enzymatic methods with high specificity. The reaction mechanism of GH1 β-glucosidases by double-substitution involves the formation of covalent intermediate (glycosyl-enzyme) which may follow two routes. One of them involves hydrolysis in β-glycosidic bond between aglycone glucone and the substrate, releasing a monosaccharide from the non-reducing end, whereas in the other route, transglycosylation or synthesis by kinetic control, the intermediate is attacked by a glucosyl acceptor (second substrate molecule), generating a new glucoside. BglB has two residues (W and H) that form a \"channel\" through which water attacks the covalent intermediate on the active site. Thus, the residues are potential targets for mutations that alter the balance between routes, increasing the efficiency of transglycosylation. To characterize the molecular basis of the ratio between these two catalytic routes, two β-glycosidases from GH1 family, Spodoptera frugiperda (Sfβgly; AF052729) and Tenebrio molitor (Tmβgly; AF312017) were produced as recombinant enzymes in Pichia pastoris GS115, concentrated using 90% (w/v) ammonium sulfate and reverse dialysis with PEG 10000, and dialyzed in 100 mM CP buffer pH 6. SDS-PAGE confirmed that Sfβgly (~50 kDa) and Tmβgly (~56 kDa) were pure after that procedure. The activity recovered after purification were 152% (Sfβgly) and 171% (Tmβgly) and protein concentration were 0.134 mg/mL (Sfβgly) and 0.217 mg/mL (Tmβgly). The ratio between the hydrolysis and transglycosylation (vH/vT) was analyzed using pNPβ-gluco substrates (0.1 mM to 8 mM) and MUβ-gluco (0.1 mM to 40 mM), the rate of formation of pNP or MU and glucose. Tmβgly catalyzes transglycosylation reactions with both substrates, but vH/vT depends on [S] ranging from +∞ (vH>>vT) to 1.5 for pNPβ-gluco and + ∞ to 1 for MUβ-gluco. In contrast, Sfβgly did not catalyses transglycosilation with MUβ-gluco. Moreover, vH/vT for pNPβ-gluco-is 2 and is independent of [S]. Sfβgly K201F combines properties of both, because it does not catalyse transglycosylation with MUβ-gluco, but for pNPβ-gluco the occurrence of transglycosylation is dependent on [S], ranging from + ∞ (vH>>vT) to 1.25. The kinetic parameters (Vmax e Km) were adjusted in Enzfitter and numerical simulation showing that Km2is higher for Tmβgly and Sfβgly K201F than Sfβgly. We also evaluated the effect of adding alternative acceptors that replace the water in pNPβ gluco-4 mM. For the three enzymes the addition of methanol makes vglc less than pNP, indicating the occurrence of transglycosylation. Addition of n-propanol decreases vH/vT about 7 times in Sfβgly and 2 times Tmβgly. The effects on Sfβgly are higher than on Tmβgly and Sfβgly K201F, suggesting easier access to the covalent intermediate in Sfβgly. We observe that vH/vT is not related to affinity for the second substrate molecule and may be modulated by mutation of residue K201 Sfβgly, position related to the access of water or alternative acceptor to the active site.

A celulose é o biopolímero de maior abundância no mundo e tem potencial para se tornar fonte de energia renovável através de sua transformação em açúcares fermentáveis, que por sua vez serão transformados em etanol. A recalcitrância da celulose, principal dificuldade encontrada no processo, pode ser superada com o auxílio de enzimas (celulases). Ao menos três enzimas celulolíticas são necessárias para a degradação total da celulose, incluindo as celobioidrolases, que hidrolisam as ligações glicosídicas das extremidades redutoras e não redutoras da cadeia, as endoglucanases, que clivam a cadeia de celulose amorfa randomicamente, e as beta-glicosidases, que produzem glicose através dos celo-oligômeros. Mas para que esse processo se torne financeiramente viável é necessário conhecer o funcionamento, otimizar a atividade e aumentar a produção dessas celulases. Com o intuito de avançar na compreensão da função e estrutura dessas enzimas, o presente trabalho teve como objetivo o estudo estrutural de beta-glicosidases da família GH1 e endoglucanases da família GH5. Na primeira parte do trabalho, a expressão da endoglucanase II de Trichoderma reesei não foi alcançada, mesmo utilizando diferentes organismos e condições de expressão. Porém, na segunda etapa, foi obtida a expressão, purificação e os primeiros ensaios de cristalização de 11 beta-glicosidases bacterianas da família GH1 e 8 endoglucanases bacterianas da família GH5. Dentre elas, três beta-glicosidases e uma endoglucanase de Bacillus licheniformis foram cristalizadas e tiveram sua estrutura resolvida. As beta-glicosidases, apesar de possuírem o enovelamente similar, apresentaram variações no tamanho e posição das alças formadoras da fenda catalítica e divergem em relação a um dos aminoácidos importantes para a estabilização do substrato. Essas diferenças podem ajudar a explicar o mecanismo dessas enzimas para reconhecer substratos distintos. A endoglucanase da família GH5, possuindo dois módulos acessórios, foi cristalizada tanto na forma apo quanto complexada ao substrato celotetraose. O segundo módulo acessório possivelmente é um domínio de ligação à celulose (CBM) e seus resíduos aromáticos, que são responsáveis pela interação com o substrato, parecem complementar o sítio catalítico, sendo assim um novo mecanismo de auxílio enzimático de um CBM. O primeiro módulo acessório não possui um aparente sítio de interação com carboidratos e provavelmente funciona como um conector entre domínio catalítico e o CBM. O posicionamento do substrato no sítio de ligação é parecido com outras estruturas já determinadas, porém, suscita algumas dúvidas sobre a função dos resíduos catalíticos que é conservada na família. O carbono anomérico do substrato possui uma densidade eletrônica contínua com o glutamato da fita β4 (que deveria ser o ácido/base) e está mais próximo dele que do glutamato da fita β7 (que deveria ser o nucleófilo). / Cellulose is the most abundant biopolymer in the world and can become a renewable energy source through its transformation in fermentable sugars, which will be converted in bioethanol. The cellulose recalcitrance, main difficulty in the process, can be overcome with the aid of enzymes (cellulases). At least three cellulolytic enzymes are required for complete hydrolysis of cellulose, including cellobiohydrolases for hydrolyzing the glycosidic linkages from the reducing and non-reducing chain ends, endoglucanases for randomly cleaving cellulose chains in the amorphous regions, and beta-glucosidases for producing glucose from the solubilized cello-oligomers. But, to become a financially viable process it is necessary to know the mechanism, optimize the activity and improve the production of these cellulases. In order to advance the understanding of the structure and function of these enzymes, the present work intended to study the structure of beta-glucosidases from family GH1 and endoglucanases from family GH5. In the first part of the work, the expression of endoglucanase II from Trichoderma reesei was not achieved, even using different organisms and expression conditions. However, in the second part, the expression, purification and the crystallization first trials of eleven bacterial beta-glucosidases and eight bacterial endoglucanases were achieved. Among them, three beta-glucosidases and one endoglucanase from Bacillus licheniformis were crystallized and had their structures solved. Beta-glucosidases, although having a similar folding, showed variations in the length and position of the loops that form the catalytic cleft and diverge in relation to one of the amino acids that are important in substrate stabilization. These differences may help explain the mechanism of these enzymes to recognize distinct substrates. The endoglucanase, which has two accessory modules, was crystallized in the apo form and complexed with the substrate celotetraose. The second accessory module probably is a cellulose binding domain (CBM) and its aromatic residues, which are responsible for the substrate interaction, seem to complement the catalytic site. Therefore it can be a new mechanism of CBM assistance in the enzymatic activity. The first accessory module has no apparent interaction site with carbohydrates and probably works as a connector between the catalytic domain and CBM. The positioning of the substrate in the binding site is similar to other structures already solved but raises some questions about the role of the catalytic residues, that are conserved in the family. The anomeric carbon of the substrate has a continuous electron density with glutamate from sheet-β4 (which should be the acid/base) and is closer to it than to glutamate from sheet-β7 (which should be the nucleophile).

A Doença de Gaucher (DG) é a doença de depósito mais comum. É causada pela deficiência da enzima -glicosidase (-gli), necessária para o catabolismo intralisossômico do glicocerebrosídio, sendo herdada de modo autossômico recessivo. Esta deficiência resulta em um acúmulo de glicocerebrosídio nos lisossomos de macrófagos derivados de monócitos em tecidos do sistema reticuloendotelial. No período de janeiro de 1982 a outubro de 2003 foram analisadas, bioquimicamente, 1081 amostras de sangue de pacientes com suspeita de DG. Nestas amostras foram medidas as atividades das enzimas -gli e quitotriosidase (QT). Foram diagnosticados 412 casos de DG (38,1%), sendo na sua grande maioria DG tipo 1. As regiões brasileiras de maior concentração destes pacientes foram as regiões sudeste, sul e nordeste. A idade média destes pacientes ao diagnóstico foi de 19 anos. A atividade da -gli de indivíduos com DG foi em média 10,7% daquela apresentada pelos indivíduos normais. A QT apresentou-se em média 269 vezes mais elevada no grupo de pacientes com DG. Nos 669 casos em que não foi confirmada a presença de DG, houve pacientes com Doença de Niemann-Pick tipos A, B ou C (44 casos), possíveis heterozigotos para DG (59 casos), pacientes com outras DL (19 casos) e outros EIM (3 casos) Em 508 casos não foi encontrado nenhum distúrbio metabólico. Foram analisadas as mutações de 128 indivíduos com DG, sendo que o genótipo N370S/L444P foi o mais freqüente (48,4%). Este estudo mostra que o protocolo bioquímico empregado foi eficiente para a detecção de DG, uma doença que se mostra bastante freqüente também no Brasil. Neste estudo também foi possível caracterizar o comportamento do pH ótimo, termoestabilidade, Km e Vmax da -gli em leucócitos de pacientes com DG e heterozigotos obrigatórios com diferentes genótipos comparando-os com indivíduos normais. Os resultados mostraram um comportamento diferente da enzima nos três grupos analisados. Esse comportamento variou conforme a mutação presente nos indivíduos. Não foi observado somente um único pH ótimo nos 3 grupos. A enzima de indivíduos normais mostrou uma faixa de pH de 5,0 a 5,4, a de heterozigotos, um único pH ou uma estreita faixa e a de indivíduos com DG, 2 picos de pH ótimo. O Km e a Vmax da enzima de heterozigotos variou desde igual até maior que aquele da enzima normal. Quando comparamos a enzima de indivíduos normais com aquela de pacientes com DG, observamos que nos genótipos N370S/N370S e N370S/IVS2+1 o Km foi maior e no grupo N370S/L444P o Km foi significativamente menor. A Vmax nos indivíduos com DG apresentou valores menores em relação aos indivíduos normais. A enzima de leucócitos de indivíduos normais, heterozigotos e homozigotos para DG, foi inativada a 60ºC. As diferenças de comportamento entre as enzimas dos três grupos analisados permitiram discriminá-los, ou seja, a enzima de indivíduos homozigotos apresentou uma maior atividade residual após 60 minutos de pré-incubação, sendo mais termoestável que os grupos de indivíduos normais e heterozigotos. . A mutação N370S produziu uma enzima mais estável e cataliticamente mais ativa que aquela da mutação L444P. Esta por sua vez, foi mais estável e ativa do que a mutação D409H. O mesmo aconteceu com os indivíduos homozigotos para DG, onde o comportamento bioquímico da b-gli foi determinado pela presença do alelo N370S. Portanto há um gradiente de estabilidade que vai de uma condição mais estável a uma condição menos estável. Este gradiente assemelha-se aquele da classificação do fenótipo clínico da DG. Os resultados nos permitem correlacionar diretamente a mutação N370S, mais estável cineticamente, com a forma clínica não neurológica da doença e a mutação menos estável cataliticamente (D409H) com a forma clínica neurológica da DG. Através deste trabalho foi possível obter informações sobre o comportamento da proteína em cada mutação estudada, seja ela em homo ou em heterozigose e estes dados podem colaborar para uma melhor distinção entre a enzima de indivíduos normais, heterozigotos e homozigotos para DG.

A Doença de Gaucher (DG) é a doença de depósito mais comum. É causada pela deficiência da enzima -glicosidase (-gli), necessária para o catabolismo intralisossômico do glicocerebrosídio, sendo herdada de modo autossômico recessivo. Esta deficiência resulta em um acúmulo de glicocerebrosídio nos lisossomos de macrófagos derivados de monócitos em tecidos do sistema reticuloendotelial. No período de janeiro de 1982 a outubro de 2003 foram analisadas, bioquimicamente, 1081 amostras de sangue de pacientes com suspeita de DG. Nestas amostras foram medidas as atividades das enzimas -gli e quitotriosidase (QT). Foram diagnosticados 412 casos de DG (38,1%), sendo na sua grande maioria DG tipo 1. As regiões brasileiras de maior concentração destes pacientes foram as regiões sudeste, sul e nordeste. A idade média destes pacientes ao diagnóstico foi de 19 anos. A atividade da -gli de indivíduos com DG foi em média 10,7% daquela apresentada pelos indivíduos normais. A QT apresentou-se em média 269 vezes mais elevada no grupo de pacientes com DG. Nos 669 casos em que não foi confirmada a presença de DG, houve pacientes com Doença de Niemann-Pick tipos A, B ou C (44 casos), possíveis heterozigotos para DG (59 casos), pacientes com outras DL (19 casos) e outros EIM (3 casos) Em 508 casos não foi encontrado nenhum distúrbio metabólico. Foram analisadas as mutações de 128 indivíduos com DG, sendo que o genótipo N370S/L444P foi o mais freqüente (48,4%). Este estudo mostra que o protocolo bioquímico empregado foi eficiente para a detecção de DG, uma doença que se mostra bastante freqüente também no Brasil. Neste estudo também foi possível caracterizar o comportamento do pH ótimo, termoestabilidade, Km e Vmax da -gli em leucócitos de pacientes com DG e heterozigotos obrigatórios com diferentes genótipos comparando-os com indivíduos normais. Os resultados mostraram um comportamento diferente da enzima nos três grupos analisados. Esse comportamento variou conforme a mutação presente nos indivíduos. Não foi observado somente um único pH ótimo nos 3 grupos. A enzima de indivíduos normais mostrou uma faixa de pH de 5,0 a 5,4, a de heterozigotos, um único pH ou uma estreita faixa e a de indivíduos com DG, 2 picos de pH ótimo. O Km e a Vmax da enzima de heterozigotos variou desde igual até maior que aquele da enzima normal. Quando comparamos a enzima de indivíduos normais com aquela de pacientes com DG, observamos que nos genótipos N370S/N370S e N370S/IVS2+1 o Km foi maior e no grupo N370S/L444P o Km foi significativamente menor. A Vmax nos indivíduos com DG apresentou valores menores em relação aos indivíduos normais. A enzima de leucócitos de indivíduos normais, heterozigotos e homozigotos para DG, foi inativada a 60ºC. As diferenças de comportamento entre as enzimas dos três grupos analisados permitiram discriminá-los, ou seja, a enzima de indivíduos homozigotos apresentou uma maior atividade residual após 60 minutos de pré-incubação, sendo mais termoestável que os grupos de indivíduos normais e heterozigotos. . A mutação N370S produziu uma enzima mais estável e cataliticamente mais ativa que aquela da mutação L444P. Esta por sua vez, foi mais estável e ativa do que a mutação D409H. O mesmo aconteceu com os indivíduos homozigotos para DG, onde o comportamento bioquímico da b-gli foi determinado pela presença do alelo N370S. Portanto há um gradiente de estabilidade que vai de uma condição mais estável a uma condição menos estável. Este gradiente assemelha-se aquele da classificação do fenótipo clínico da DG. Os resultados nos permitem correlacionar diretamente a mutação N370S, mais estável cineticamente, com a forma clínica não neurológica da doença e a mutação menos estável cataliticamente (D409H) com a forma clínica neurológica da DG. Através deste trabalho foi possível obter informações sobre o comportamento da proteína em cada mutação estudada, seja ela em homo ou em heterozigose e estes dados podem colaborar para uma melhor distinção entre a enzima de indivíduos normais, heterozigotos e homozigotos para DG.