Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Farmacología / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas / La polimerización y agregación del péptido Aβ1-42 son procesos poco dilucidados hasta el momento, sin embargo, están fuertemente relacionados al desarrollo de la Enfermedad de Alzheimer, trastorno neurodegenerativo, causante principal de demencia senil para el cual no existe cura o prevención efectiva hasta nuestros días. Una de las estrategias estudiadas con el fin de prevenir y buscar la cura de esta enfermedad es la de buscar compuestos que inhiban la agregación de Aβ1-42 y consecuentemente la formación de especies tóxicas que causan la muerte neuronal y el desarrollo de la enfermedad. En esta tesis se evaluó la acción inhibidora de la agregación de una serie de 6 derivados dihidropiridínicos (fenil-DHP, 3-OH-DHP, 4-OH-DHP, 3,4-OH-DHP, 3,5-OH- DHP y 3,4,5-OH-DHP) que difieren en el número y posición de hidroxilos en la molécula que por semejanzas estructurales con otros compuestos encontrados en la literatura se constituyeron en buenos candidatos para este fin. Estos compuestos poseen además las propiedades de ser inhibidores de la generación de radicales libres, inhibidores de canales de calcio y posibles antihipertensivos, constituyéndose en compuestos aún más atractivos, ya que el estrés oxidativo, el desbalance en la homeostasis de calcio y la hipertensión, son también factores desencadenantes de la EA. Mediante las técnicas de Fluorescencia por Interacción con tioflavina-T, Electroforesis en Geles y TEM, los resultados demostraron que los compuestos con uno o ningún grupo hidroxilo (fenil-DHP, 3-OH-DHP y 4-OH-DHP) no son inhibidores de la agregación de Aβ1-42. Sin embargo, los compuestos , 3,4-OH-DHP, 3,5-OH-DHP y 3,4,5-OH-DHP son inhibidores de la agregación siendo 3,4-OH-DHP el compuesto más eficaz con una inhibición máxima de 88±5% y una IC50 de 5.6±0.1µM siendo significativamente más potente que el resveratrol (IC50=9.8±1.3 µM), compuesto polifenólico usado como control en esta tesis. Los efectos sobre la toxicidad celular inducida por fibras amiloides fueron evaluados, para los compuestos activos, en cultivo primario de hipocampo de ratas E18; observándose que una inhibición en la agregación de Aβ1-42 está relacionada con una inhibición de la muerte celular inducida por fibras amiloides. Por otra parte, en esta tesis se desarrolló un nuevo método electroquímico que permite evaluar el proceso de agregación y desagregación de Aβ1-42 con el fin de complementar, con nueva información, la metodología existente, ya que los métodos convencionales poseen diversas limitaciones y no pueden ser constituidos como un único método válido. Se generaron electrodos de carbón vítreo modificados con nanotubos de carbono y fue posible seguir el proceso de agregación mediante la señal de oxidación del residuo de Tyr en estadios tempranos cuando oligómeros pequeños son formados, revelando información conformacional del extremo N-terminal de la molécula. Además, este nuevo método fue útil para evaluar la desagregación del péptido LPFFD-NH2, conocido desagregante. / Polymerization and aggregation of the Aβ1-42 peptide are not complete elucidated processes until now, however, they are strongly related to the development of Alzheimer's disease, a neurodegenerative disorder, the primary cause of dementia for which no cure or effective prevention exist so far. One of the strategies studied in order to prevent and to find a cure for this disease is to find compounds that inhibit the aggregation of Aβ1-42 and consequently the formation of toxic species that cause neuronal death and disease development. In this thesis, the aggregation inhibitory activity of a series of 6 dihydropyridine derivatives (phenyl-DHP, 3-OH-DHP, 4-OH-DHP, 3,4-OH-DHP, 3,5-OH-DHP and 3,4,5- OH-DHP) was evaluated. These compounds differ to each other in the number and position of hydroxyl groups in the molecule and since they have structural similarities with other compounds found in the literature they are constituted in good candidates for this purpose. These compounds also have other characteristics like inhibitors of free radical generation, calcium channel blockers and potential antihypertensive activity that make them more attractive since oxidative stress, the imbalance in calcium homeostasis and hypertension, are also triggers factors of Alzheimer's disease. By mean of Thioflavin-T Fluorescence Assay, Gel Electrophoresis and TEM the results demonstrated that the compounds with one or no hydroxyl group (phenyl-DHP, 3-OH-DHP and 4-OH-DHP) are not inhibitors of Aβ1-42 aggregation. However, the compounds, 3,4-OH-DHP, 3,5-OH-DHP and 3,4,5-OH-DHP are inhibitors of the aggregation being 3.4-OH-DHP the inhibitor compound with the highest maximum inhibition of 88 ± 5% and an IC50 of 5.6 ± 0.1μM being significantly more potent than resveratrol (IC50 = 9.8 ± 1.3 µM), a polyphenolic compound used as a control in this thesis. The effects on cellular toxicity induced by amyloid fibrils were evaluated for these compounds in primary cultures of E18 rat hippocampus. It was observed that the inhibition on the aggregation of Aβ1-42 is related to the inhibition of cell death induced by amyloid fibers. On the other hand, in this thesis was developed a new electrochemical method to assess the process of aggregation and disaggregation of Aβ1-42 in order to supplement, with new information, the existing methodology, since conventional methods have several limitations and cannot be constituted as a single valid method. Glassy carbon electrodes modified with carbon nanotube were generated and it was possible to follow up the aggregation process by mean of the oxidation signal of Tyr residue in the early stages when small oligomers are formed, revealing conformational information of the N-terminal part of the molecule. In addition, this new methodology was useful for assessing the disaggregation activity of LPFFD-NH2 peptide, a known disaggregating compound. / Fondecyt

La proteína beta amiloide (Aβ), involucrada en la enfermedad de Alzheimer, cambia su conformación en condiciones patológicas formando agregados tóxicos (AT) que tienen un efecto neurodegenerativo. La estructura molecular de los AT todavía no se ha dilucidado debido a que Aβ no cristaliza. Su conocimiento contribuirá al diseño de fármacos capaces de interferir eficientemente en el proceso de agregación. En este, Aβ1_42 puede formar estructuras como protofibrillas, amiloesferoides o fibras amiloides (FAs). Para obtener información estructural y sondear si existe exposición de grupos hidrofóbicos en los AT de Ab1¡42, se emplearon diferentes técnicas como AFM, TEM, FV, y sondas de nanopartículas (NP) metálicas. Se estudió la interacción de los AT con sustratos hidrofílicos e hidrofóbicos y también se usaron NP de oro conjugadas al péptido CLPFFD, que reconocen selectivamente los AT. A través de espectroscopia de fuerza (FV), se estudió la interacción de los AT adsorbidos a HOPG (grafito pirrolítico altamente ordenado) con una sonda de oro funcionalizada con CLPFFD. Una de las interacciones observadas fue la adhesión, atribuible a la interacción entre residuos hidrofóbicos de los AT y CLPFFD. Además, se estudió la interacción entre LPFFD y FAs in volumen observándose la desagregación de FAs. Paralelamente, se realizaron experimentos in situ observándose que LPFFD no produce desagregación de FAs sobre HOPG, debido a que los sitios de interacción con LPFFD se encuentran bloqueados por la interacción con el HOPG. Los resultados obtenidos revelaron interesantes propiedades fisicoquímicas de los agregados, que concuerdan con algunos de los modelos actuales para la agregación de la proteína Aβ1_42. / Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / The amyloid beta peptide (Ab ), involved in Alzheimer´s disease, can change its conformation in pathologic conditions forming toxic aggregates (TA) with a neurodegenerative effect. Structure of Ab at a molecular level is unknown yet due to this protein has not been crystalized. The knowledge of the structure will contribute to the design of new drugs that can efficiently halt the aggregation process. In the aggregation process, is possible to recognize clear structures of Ab1¡42, like protofibrils, globular aggregates or amyloid fibrils (AF). To obtain information about the structure of amyloid aggregates and to probe wether exist exposition of hydrophilic or hydrophobic groups in different regions, AFM, TEM, FV and metal nanoparticles probes will be used. The interaction between the TA and hydrophobic and hydrophyilc substrates has been studied. In addition, gold nanoparticles (AuNP) were linked to the peptide CLPFFD that selectively attaches to the AF of Ab1¡42. We study with force spectroscopy (FV) mode, the interaction of the TA of Ab1¡42 adsorbed in a HOPG surface, with a gold-CLPFFD linked probe. The force curves gave information of the interaction between the AF of Ab1¡42 and the peptide sequence CLPFFD. One of the interactions observed was the adhesion, attributable to the interaction between hydrophobic residues. Therefore, we study the interaction between LPFFD and AF of Ab1¡42 in volumen observing the disaggregation. In contrast, in experiments done in situ, disaggregation was not observed due to the blocking of the AF by HOPG to LPFFD that avoid the interaction. The obtained results reveals interesting physicochemical properties of the TA which are in agreement with some of the recently proposed models for the Ab1¡42 aggregation

Orientador: Benedito de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-19T21:59:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marques_MariaRisoletaFreire_D.pdf: 5230967 bytes, checksum: 560f78c2e493fb4bf266804f21146619 (MD5) Previous issue date: 1994 / Doutorado / Genetica / Doutor em Ciências Biológicas

A acetilcolinesterase (AChE) é uma enzima essencial que encerra a transmissão colinérgica através de uma rápida hidrólise do neurotransmissor, acetilcolina (ACh). Uma ampla série de evidências mostraram que os inibidores da AChE podem interferir com a progressão da doença de Alzheimer (DA). O desenvolvimento bem sucedido de compostos inibidores da AChE foi baseado na teoria de que o declínio nas funções cognitivas e mentais associadas a DA está relacionado com a perda da neurotransmissão cortical colinérgica, sendo assim, esses compostos podem ser usados para tratar as deficiências colinérgicas. Uma coleção de moléculas orgânicas foi escaneada para ser avaliada a capacidade dessas moléculas em inibir a atividade enzimática da AChE com o objetivo de se encontrar compostos líderes para posteriores otimizações, conduzindo a fármacos com aumento da eficácia e/ou menores efeitos adversos. As estratégias aplicadas incluem o screening ou triagem virtual baseado na estrutura e também no ligante, modelagem farmacofórica, docking molecular e buscas por similaridade (forma e eletrostática). Os estudos foram também concentrados na descoberta de novas classes de inibidores da AChE, tendo como molécula de referência o fármaco donepezil, o qual inaugurou uma nova classe de inibidores da AChE com a ação mais longa e mais seletiva com efeitos adversos manejáveis. Do total de compostos triados, 50 foram selecionados com adequadas propriedades físico-químicas e ADME/Tox. Em geral, esses compostos possuem substancial interação com o sítio periférico aniônico (PAS) da AChE e a maioria deles faz interações adicionais com o sítio catalítico (CAS) e com outros resíduos de aminoácidos importantes ao longo da enzima. Destes 50 compostos, oito foram comercialmente adquiridos e os ensaios enzimáticos revelaram que estes compostos exibem uma alta afinidade pela AChE. Os resultados apontam, ainda, que o composto entitulado ZINC30019441 exibiu a mais potente atividade inibitória para a AChE, com 1,8 micromolar de concentração, e os demais ficaram ainda situados em baixo micromolar, de 2 a 3 micromolar de concentração. Estes resultados, além das modificações químicas ora propostas in silico para estes inibidores protótipos, apontam para o desenvolvimento de uma nova e promissora série de potentes anticolinesterásicos, contendo propriedades de fármacos, as quais são ainda apropriadas para atuarem no Sistema Nervoso Central e interagirem com o peptídeo beta-amiloide, com vistas ao tratamento quimioterápico da doença de Alzheimer. A perspectiva imediata inclui os ensaios de anti-agregação do peptídeo com os oito inibidores já testados com a Acetilcolinesterase. / Acetylcholinesterase (AChE) is an essential enzyme that terminates cholinergic transmission by rapid hydrolysis of the neurotransmitter acetylcholine (ACh). A wide range of evidence shows that AChE inhibitors may interfere with the progression of Alzheimer\'s disease (AD). The successful development of AChE inhibitor compounds was based on the theory that the decline in cognitive and mental functions associated with AD is related to the loss of cortical cholinergic neurotransmission, thus, these compounds can be used for treating cholinergic deficiencies. A collection of organic molecules has been scanned to evaluate the ability of these molecules to inhibit the enzymatic activity of AChE in order to find lead compounds for further optimization, leading to drugs with increased efficacy and/or fewer adverse effects. The strategies applied include structure-based virtual screening and also in ligand-based virtual screening, pharmacophoric modeling, molecular docking and similarity searches (shape and electrostatic). Studies have also focused on the discovery of new classes of AChE inhibitors, having as a reference molecule the drug donepezil, which has opened a new class of AChE inhibitors with longer and more selective action with manageable side effects. 50 of the compounds screened, were selected with appropriate physical and chemical properties and ADME/Tox. In general, these compounds possess substantial interaction with the peripheral anionic site (PAS) of AChE and most of them make further interact with the catalytic site (CAS) and other key amino acid residues throughout the enzyme. Out of these 50 compounds, eight were commercially purchased and the enzyme assays have shown that these compounds exhibit a high affinity for AChE. The results show also that the compound titled ZINC30019441 exhibited the most potent inhibitory activity for AChE, with 1.8 micromolar concentration, and the rest were still located in low micromolar, 2-3 micromolar concentration. These results as well as chemical modifications herein proposed for these prototypes, indicate the development of a new and promising series of potent anticholinesterase containing drug properties, which are still suitable to act on the central nervous system and interact with the ?-amyloid peptide, for chemotherapy treatment of Alzheimer\'s disease. The immediate prospect includes the peptide anti-aggregation assays with the eight inhibitors already tested against acetylcholinesterase

FE65 es una proteína adaptadora que actualmente se ha relacionado con la formación del péptido β-amiloide y la hiperfosforilación de tau, procesos que se ven incrementados en pacientes con Alzheimer, probablemente como consecuencia de un aumento en la actividad transcripcional de FE65. Una de las principales interacciones que se asocian con la activación de ésta proteína es la unión de su dominio PTB2 con el dominio citoplasmático de la proteína precursora del amiloide (AICD), interacción que se ve estabilizada por la proteína adaptadora 14-3-3γ. En esta tesis se llevó a cabo la construcción de un modelo por homología de PTB2 y un segmento de AICD, correspondiente a la secuencia de interacción con FE65. A partir de éstos, mediante técnicas de docking se determinó el modo conformacional de interacción más probable para el complejo, cuya interfaz de interacción fue estudiada mediante un análisis de geometrías de interacción, principalmente de formación de puentes de hidrógeno y también mediante el estudio del cambio en el área de superficie accesible a solvente entre los monómeros y el complejo. Una vez determinados los aminoácidos que interaccionan en la interfaz se realizó un estudio de la contribución de éstos en la estabilidad del complejo mediante una técnica conocida como Alanine Scanning. Se logró determinar la importancia de cada uno de estos aminoácidos en la formación del complejo, presentando así las bases necesarias para el futuro diseño de ligandos inhibidores de la interacción como estrategia farmacoterapéutica para combatir la patología del Alzheimer. A su vez se presenta un estudio preliminar de otro complejo involucrado en la interacción de FE65 y AICD, aquel formado entre 14-3-3γ con AICD, pudiendo determinar dos posibles sitios de unión. Por otra parte se realizó un breve estudio de un potencial sitio de unión de PTB2 a fosfoinositidos de membrana, interacción que se ha señalado como probable, pero cuyo posible papel en los procesos moleculares de FE65 no ha sido determinado aun.

A doença de Alzheimer (DA) é a forma mais comum de demência, representando cerca de 80% dos casos. A DA é caracterizada por um processo de declínio progressivo e irreversível das funções cognitivas e da memória, que se estende para a desorganização do comportamento. Atualmente, 46,8 milhões de pessoas em todo o mundo foram diagnosticadas com demência. Embora vários fatores tenham sido implicados na DA, sua etiologia ainda não é completamente conhecida. Do ponto de vista neuropatológico, é observado no cérebro de indivíduos com DA atrofia cortical difusa, presença de grande número de placas senis, emaranhados neurofibrilares, processo inflamatório e perda neuronal. A progressão dos sintomas está associada a mudanças estruturais nas sinapses colinérgicas em certas regiões do cérebro, que consequentemente, apresentam neurotransmissão colinérgica reduzida. Os vários eventos patológicos interligados contribuem para o avanço da doença e direcionam diversas pesquisas na busca por tratamentos multialvos com base no processo multifatorial de DA. Assim o presente trabalho descreve a síntese de derivados híbridos dual binding site de donepezila-tacrina (fármacos inibidores de acetilcolinesterase), com potencial para agir em dois alvos terapêuticos pela (i) inibição da acetilcolinesterase em ambos os sítios ativo e periférico, como demonstrado pelos estudos de modelagem molecular, e (ii) na agregação do peptídeo A? neurotóxico induzido pela acetilcolinesterase, na tentativa de interromper a progressão da doença. A estratégia sintética envolveu a condensação da 5,6-dimetóxiindanona com a unidade 4-piperidinil carbaldeído, a qual forneceu o intermediário 5,6- dimetóxindan-1-ona-4-piperidinil-metileno-1-[(4-cloroquinolin-2-il)metil], seguido de redução da dupla ligação, gerada na reação de condensação anterior, e substituição do átomo de cloro-quinolina por amino para obtenção do produto final, ou manutenção da função olefina, seguido de substituição do átomo de cloro-quinolina por azido ou amino, gerando cinco híbridos estruturalmente correlacionados. Os híbridos foram testados em ensaio de inibição de acetilcolinesterase e butirilcolinesterase pelo método de Ellman, e o híbrido insaturado, contendo a função amino-quinolina foi o mais ativo da série com IC50 na faixa de nanomolar (0,014 ?M). Futuramente, os intermediários da reação e produto final serão submetidos ao ensaio de inibição da agregação do peptídeo A? neurotóxico pelo método da tioflavina T. Neste trabalho, também são descritos os testes de predição in vitro para permeação pela barreira hematoencefálica, bem como sua absorção intestinal, pelo método PAMPA. / Alzheimer\'s disease (AD) is the most commom form of dementia in almost 80% of the cases. AD is a process that causes a progressive and irreversible decline of cognitive functions, memory and includes disorganized behavior. Currently, 46.8 million people live with dementia around the world. Although several factors have been implicated in AD, its etiology is not fully understood. In the point of neuropathologic view, diffuse cortical atrophy, presence of senile plaques, neurofibrillary tangles, inflammatory process and neuronal loss are observed in the brain of the patients with AD. The progression of the disease symptoms is associated with structural changes in cholinergic synapses in certain brain regions and consequent impairment of cholinergic neurotransmission. The various interconnected pathological events contribute for the progression of the disease and drive several studies in the search for multitarget treatments based on the multifactorial process of AD. Therefore, this work describes the synthesis of dual binding site tacrine-donepezil hybrids, with the potential to act in two therapeutics targets by: (i) inhibition of the acetylcholinesterase in both peripheral and active sites, as demonstrated in molecular modeling studies, and (ii) the peptide A? neurotoxic aggregation induced by acetylcholinesterase, in an attempt to stop the progression of the disease. The synthetic strategy was based on the condensation between 5,6- dimethoxy-indanone and the 4-piperidinyl carbaldehyde core, which afforded the 5,6- dimethoxy-indanone-4-piperidinyl-methylene-1-[(4-chloroquinolin-2-yl)methyl] intermediate, followed by the reduction of the olefinic bond, formed in the previous condensation, and substitution of the chloro-quinoline atom by amine group to give the final product, or keeping the olefin function, followed by replacement of the chloro-quinoline atom by azide or amine to produce five structural related hybrids. The hybrids were tested in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase inhibition assays using Ellman method, and the unsaturated hybrid containing the amino-quinoline function was the most active of the series with IC50 in a nanomolar range (0,014 ?M). The ability of the hybrids to inhibit protein A? neurotoxic aggregation will be assessed by thioflavin T method. In addition, the blood brain and intestinal barrier permeation by PAMPA methodology were also predicted.

A acetilcolinesterase (AChE) é uma enzima essencial que encerra a transmissão colinérgica através de uma rápida hidrólise do neurotransmissor, acetilcolina (ACh). Uma ampla série de evidências mostraram que os inibidores da AChE podem interferir com a progressão da doença de Alzheimer (DA). O desenvolvimento bem sucedido de compostos inibidores da AChE foi baseado na teoria de que o declínio nas funções cognitivas e mentais associadas a DA está relacionado com a perda da neurotransmissão cortical colinérgica, sendo assim, esses compostos podem ser usados para tratar as deficiências colinérgicas. Uma coleção de moléculas orgânicas foi escaneada para ser avaliada a capacidade dessas moléculas em inibir a atividade enzimática da AChE com o objetivo de se encontrar compostos líderes para posteriores otimizações, conduzindo a fármacos com aumento da eficácia e/ou menores efeitos adversos. As estratégias aplicadas incluem o screening ou triagem virtual baseado na estrutura e também no ligante, modelagem farmacofórica, docking molecular e buscas por similaridade (forma e eletrostática). Os estudos foram também concentrados na descoberta de novas classes de inibidores da AChE, tendo como molécula de referência o fármaco donepezil, o qual inaugurou uma nova classe de inibidores da AChE com a ação mais longa e mais seletiva com efeitos adversos manejáveis. Do total de compostos triados, 50 foram selecionados com adequadas propriedades físico-químicas e ADME/Tox. Em geral, esses compostos possuem substancial interação com o sítio periférico aniônico (PAS) da AChE e a maioria deles faz interações adicionais com o sítio catalítico (CAS) e com outros resíduos de aminoácidos importantes ao longo da enzima. Destes 50 compostos, oito foram comercialmente adquiridos e os ensaios enzimáticos revelaram que estes compostos exibem uma alta afinidade pela AChE. Os resultados apontam, ainda, que o composto entitulado ZINC30019441 exibiu a mais potente atividade inibitória para a AChE, com 1,8 micromolar de concentração, e os demais ficaram ainda situados em baixo micromolar, de 2 a 3 micromolar de concentração. Estes resultados, além das modificações químicas ora propostas in silico para estes inibidores protótipos, apontam para o desenvolvimento de uma nova e promissora série de potentes anticolinesterásicos, contendo propriedades de fármacos, as quais são ainda apropriadas para atuarem no Sistema Nervoso Central e interagirem com o peptídeo beta-amiloide, com vistas ao tratamento quimioterápico da doença de Alzheimer. A perspectiva imediata inclui os ensaios de anti-agregação do peptídeo com os oito inibidores já testados com a Acetilcolinesterase. / Acetylcholinesterase (AChE) is an essential enzyme that terminates cholinergic transmission by rapid hydrolysis of the neurotransmitter acetylcholine (ACh). A wide range of evidence shows that AChE inhibitors may interfere with the progression of Alzheimer\'s disease (AD). The successful development of AChE inhibitor compounds was based on the theory that the decline in cognitive and mental functions associated with AD is related to the loss of cortical cholinergic neurotransmission, thus, these compounds can be used for treating cholinergic deficiencies. A collection of organic molecules has been scanned to evaluate the ability of these molecules to inhibit the enzymatic activity of AChE in order to find lead compounds for further optimization, leading to drugs with increased efficacy and/or fewer adverse effects. The strategies applied include structure-based virtual screening and also in ligand-based virtual screening, pharmacophoric modeling, molecular docking and similarity searches (shape and electrostatic). Studies have also focused on the discovery of new classes of AChE inhibitors, having as a reference molecule the drug donepezil, which has opened a new class of AChE inhibitors with longer and more selective action with manageable side effects. 50 of the compounds screened, were selected with appropriate physical and chemical properties and ADME/Tox. In general, these compounds possess substantial interaction with the peripheral anionic site (PAS) of AChE and most of them make further interact with the catalytic site (CAS) and other key amino acid residues throughout the enzyme. Out of these 50 compounds, eight were commercially purchased and the enzyme assays have shown that these compounds exhibit a high affinity for AChE. The results show also that the compound titled ZINC30019441 exhibited the most potent inhibitory activity for AChE, with 1.8 micromolar concentration, and the rest were still located in low micromolar, 2-3 micromolar concentration. These results as well as chemical modifications herein proposed for these prototypes, indicate the development of a new and promising series of potent anticholinesterase containing drug properties, which are still suitable to act on the central nervous system and interact with the ?-amyloid peptide, for chemotherapy treatment of Alzheimer\'s disease. The immediate prospect includes the peptide anti-aggregation assays with the eight inhibitors already tested against acetylcholinesterase

La hipótesis amiloide de la enfermedad de Alzheimer fue la base, hace algunos años, para el desarrollo de una línea de investigación cuyo objetivo principal es la obtención de pequeñas moléculas peptídicas capaces de interferir en la formación de fibras amiloides de la proteína beta-amiloide, pretendiendo reducir de esta manera la toxicidad de la misma. Así mismo, se quiere verificar la existencia de una correlación entre la presencia de fibras amiloides y la neurotoxicidad de la proteína beta-amiloide.Como pequeñas moléculas peptídicas, nos planteamos inicialmente el diseño y síntesis de una serie de N-metilpéptidos con capacidad inhibidora de la toxicidad de beta-amiloide. Esta colección de compuestos, además, se enfocó de forma que permitiese identificar los factores que favorecen la interacción proteína-inhibidor y el carácter de dicha interacción, estudiando entre otros aspectos el papel que juega la esteroquímica de los aminoácidos de estos inhibidores (L ó D) en el reconocimiento molecular. Se planteó correlacionar la inhibición de la toxicidad con la formación/ausencia de fibras amiloides. Para ello se decidió evaluar y utilizar algunos de los métodos descritos en la bibliografía para la detección y cuantificación de fibras amiloides. Para la evaluación de los inhibidores, se decidió obtener un modelo simplificado del proceso de fibrilogénesis de la proteína que tiene lugar durante la enfermedad de Alzheimer. La puesta a punto del mismo ha de permitir ensayar de forma paralela la capacidad de diversos compuestos para inhibir la toxicidad de la proteína in vitro.Por último se planteó la puesta a punto de ensayos de estabilidad de los péptidos sintetizados frente a la acción de proteasas. Este tipo de experimentos permite predecir, de forma aproximada, la biodisponibilidad relativa de diferentes péptidos en medios biológicos, pudiéndose así extrapolar su comportamiento en condiciones in vivo.

La malaltia d'Alzheimer (MA) es caracteritza per la presència a l'hipocamp i l'escorça de plaques senils de la proteïna β-amilode (Aβ), cabdells neurofibrilars de la proteïna tau hiperfosforilada i pèrdua de sinapsis. La hipòtesi neurovascular de la MA dóna una especial importància a les alteracions de la Barrera Hematoencefàlica (BHE) i els increments de la proteïna β-amilode (Aβ). Els ratolins modificats genèticament són els models animals més utilitzats en la investigació de la MA. Tanmateix, aquests ratolins imiten aspectes de la MA de tipus familiar, on alteracions genètiques predisposen a patir la malaltia. Els ratolins d'edat avançada poden ajudar a discernir la frontera entre l'envelliment normal i el patològic. En aquest context prenen especial rellevància els ratolins amb senescència accelerada SAMP8. Aquesta soca ja ha estat descrita com a model de MA i presenta vàries característiques de la MA com dèficits en l'aprenentatge i la memòria, alteracions emocionals, nivells elevats d'APP i Aβ, patologia neuronal associada a tau, alteracions en el sistema colinèrgic, neurodegeneració i estrès oxidatiu entre d'altres. En aquesta tesi hem investigat: 1-Les alteracions i l'evolució temporal de les modificacions en la integritat de la BHE en escorça i hipocamp de ratolins SAMP8; 2-La presència de dipòsits amiloides en aquests ratolins a les zones cerebrals abans esmentades així com el seu increment amb l'edat i 3-La relació temporal i en la localització de les alteracions de la BHE i els dipòsits d'Aβ d'aquests ratolins. Les conclusions que hem estret són que en ratolins SAMP8: 1- Presenten alteracions de la BHE a partir dels 9 mesos d'edat. 2- Presenten acumulacions d'Aβ a partir de 6 mesos d'edat. 3- Presenten nivells més elevats d'angiopatia amiloïdal cerebral (CAA) a partir dels 3 mesos d'edat. 4- Tots els vasos amb CAA mostren també alteracions de la BHE, tot i que hi ha altres basos amb la BHE alterada sense CAA. 5- No hi ha relació directa entre la localització dels dipòsits amiloides i la localització dels vasos sanguinis, els vasos amb CAA ni amb els vasos amb la BHE alterada.

A doença de Alzheimer (DA) é a forma mais comum de demência, representando cerca de 80% dos casos. A DA é caracterizada por um processo de declínio progressivo e irreversível das funções cognitivas e da memória, que se estende para a desorganização do comportamento. Atualmente, 46,8 milhões de pessoas em todo o mundo foram diagnosticadas com demência. Embora vários fatores tenham sido implicados na DA, sua etiologia ainda não é completamente conhecida. Do ponto de vista neuropatológico, é observado no cérebro de indivíduos com DA atrofia cortical difusa, presença de grande número de placas senis, emaranhados neurofibrilares, processo inflamatório e perda neuronal. A progressão dos sintomas está associada a mudanças estruturais nas sinapses colinérgicas em certas regiões do cérebro, que consequentemente, apresentam neurotransmissão colinérgica reduzida. Os vários eventos patológicos interligados contribuem para o avanço da doença e direcionam diversas pesquisas na busca por tratamentos multialvos com base no processo multifatorial de DA. Assim o presente trabalho descreve a síntese de derivados híbridos dual binding site de donepezila-tacrina (fármacos inibidores de acetilcolinesterase), com potencial para agir em dois alvos terapêuticos pela (i) inibição da acetilcolinesterase em ambos os sítios ativo e periférico, como demonstrado pelos estudos de modelagem molecular, e (ii) na agregação do peptídeo A? neurotóxico induzido pela acetilcolinesterase, na tentativa de interromper a progressão da doença. A estratégia sintética envolveu a condensação da 5,6-dimetóxiindanona com a unidade 4-piperidinil carbaldeído, a qual forneceu o intermediário 5,6- dimetóxindan-1-ona-4-piperidinil-metileno-1-[(4-cloroquinolin-2-il)metil], seguido de redução da dupla ligação, gerada na reação de condensação anterior, e substituição do átomo de cloro-quinolina por amino para obtenção do produto final, ou manutenção da função olefina, seguido de substituição do átomo de cloro-quinolina por azido ou amino, gerando cinco híbridos estruturalmente correlacionados. Os híbridos foram testados em ensaio de inibição de acetilcolinesterase e butirilcolinesterase pelo método de Ellman, e o híbrido insaturado, contendo a função amino-quinolina foi o mais ativo da série com IC50 na faixa de nanomolar (0,014 ?M). Futuramente, os intermediários da reação e produto final serão submetidos ao ensaio de inibição da agregação do peptídeo A? neurotóxico pelo método da tioflavina T. Neste trabalho, também são descritos os testes de predição in vitro para permeação pela barreira hematoencefálica, bem como sua absorção intestinal, pelo método PAMPA. / Alzheimer\'s disease (AD) is the most commom form of dementia in almost 80% of the cases. AD is a process that causes a progressive and irreversible decline of cognitive functions, memory and includes disorganized behavior. Currently, 46.8 million people live with dementia around the world. Although several factors have been implicated in AD, its etiology is not fully understood. In the point of neuropathologic view, diffuse cortical atrophy, presence of senile plaques, neurofibrillary tangles, inflammatory process and neuronal loss are observed in the brain of the patients with AD. The progression of the disease symptoms is associated with structural changes in cholinergic synapses in certain brain regions and consequent impairment of cholinergic neurotransmission. The various interconnected pathological events contribute for the progression of the disease and drive several studies in the search for multitarget treatments based on the multifactorial process of AD. Therefore, this work describes the synthesis of dual binding site tacrine-donepezil hybrids, with the potential to act in two therapeutics targets by: (i) inhibition of the acetylcholinesterase in both peripheral and active sites, as demonstrated in molecular modeling studies, and (ii) the peptide A? neurotoxic aggregation induced by acetylcholinesterase, in an attempt to stop the progression of the disease. The synthetic strategy was based on the condensation between 5,6- dimethoxy-indanone and the 4-piperidinyl carbaldehyde core, which afforded the 5,6- dimethoxy-indanone-4-piperidinyl-methylene-1-[(4-chloroquinolin-2-yl)methyl] intermediate, followed by the reduction of the olefinic bond, formed in the previous condensation, and substitution of the chloro-quinoline atom by amine group to give the final product, or keeping the olefin function, followed by replacement of the chloro-quinoline atom by azide or amine to produce five structural related hybrids. The hybrids were tested in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase inhibition assays using Ellman method, and the unsaturated hybrid containing the amino-quinoline function was the most active of the series with IC50 in a nanomolar range (0,014 ?M). The ability of the hybrids to inhibit protein A? neurotoxic aggregation will be assessed by thioflavin T method. In addition, the blood brain and intestinal barrier permeation by PAMPA methodology were also predicted.