Submitted by Gilvan Almeida (gilvan.almeida@icict.fiocruz.br) on 2016-10-11T17:34:20Z No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 72038.pdf: 3196059 bytes, checksum: 8c47650717cf5a0ee1266bcc0b5d389d (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-10-24T11:51:02Z (GMT) No. of bitstreams: 2 72038.pdf: 3196059 bytes, checksum: 8c47650717cf5a0ee1266bcc0b5d389d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-24T11:51:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 72038.pdf: 3196059 bytes, checksum: 8c47650717cf5a0ee1266bcc0b5d389d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A dengue é caracterizada como a principal arbovirose humana, representando um grave problema de saúde pública. A superativação de células do sistema imune pode ser destacada como um dos fatores envolvidos na progressão da doença para as formas mais graves. Embora os monócitos sejam reconhecidos como importante fonte de citocinas, a participação das plaquetas na patogênese da dengue permanece pouco explorada. Recentemente, nosso grupo mostrou a contribuição da interação plaqueta-monócito na resposta inflamatória observada durante a dengue. De fato, o papel das plaquetas na resposta imune e inflamatória é cada vez mais frequente. Dentro deste contexto, foi proposto que plaquetas ativadas por estímulo específico sinalizam para mudanças fenotípicas nos monócitos, incluindo a diferenciação em células espumosas que é caracterizada pelo aumento da biogênese de corpúsculos lipídicos (CL) \2013 organelas citoplasmáticas dinâmicas ricas em lipídios relacionadas a processos inflamatórios e infecciosos. Nossos estudos prévios demonstraram um aumento da biogênese de CL tanto em leucócitos isolados de pacientes com a forma grave da doença quanto em células infectadas com o vírus dengue (DENV) in vitro, com participação na localização da proteína do capsídeo viral e na produção de partículas virais infecciosas. Entretanto, os mecanismos que regulam a biogênese e a função destas organelas durante a infecção pelo DENV precisam ser melhor caracterizados. Assim, pretende-se com este trabalho (i) analisar os mecanismos que levam à biogênese de CL em distintos tipos celulares infectados com o DENV in vitro; (ii) estudar os efeitos de plaquetas ativadas com o DENV in vitro sobre a imunomodulação dos monócitos, no que diz respeito, principalmente, à formação de CL; (iii) investigar o efeito de drogas que atuam na gênese de CL e o seu impacto na replicação viral e na secreção de mediadores inflamatórios Inicialmente, nossos resultados demonstram um aumento na formação e/ou tamanho de CL em distintos tipos celulares infectados in vitro, de uma maneira dependente da integridade viral, visto que o vírus inativado por aquecimento falhou em induzir a biogênese destas organelas. Observamos que a modulação da lipogênese e da formação de CL afetam a capacidade replicativa do vírus. Além disso, constatamos que o DENV é capaz de modular positivamente a expressão de genes envolvidos no metabolismo de lipídios, de forma independente do MIF \2013 citocina que induz a gênese de CL em monócitos \2013 secretado durante a infecção. Na segunda parte deste estudo, observamos que plaquetas ativadas com o DENV in vitro rapidamente formam agregados com monócitos quando comparado com plaquetas estimuladas com mock. Adicionalmente, plaquetas ativadas com o DENV sinalizam para que monócitos aumentem a expressão de COX-2 e a secreção de PGE2 e CXCL8/IL-8. De forma recíproca, observamos que estas células contribuem para uma maior ativação das plaquetas, que então secretam níveis elevados de CCL5/RANTES e CXCL4/PF4. Em seguida, constatamos que plaquetas ativadas com o DENV in vitro são capazes de promover a biogênese de CL em monócitos, de uma maneira dependente da enzima ácido graxo sintase Ao utilizarmos o C75, inibidor desta enzima, também observamos uma redução nos níveis de PGE2, mas não de CXCL-8/IL-8, sugerindo um papel dos CL na produção deste mediador lipídico. O MIF, secretado durante a ativação de plaquetas pelo DENV in vitro, também está envolvido na sinalização que culmina na formação de CL em monócitos expostos a plaquetas ativadas. De forma surpreendente, o sobrenadante de plaquetas ativadas com o DENV não induz a biogênese de CL em monócitos, sugerindo a importância do contato direto entre essas células. De fato, a interação com plaquetas ativadas mostrou-se crucial para que os monócitos respondam funcionalmente, incluindo a secreção de mediadores inflamatórios e o aumento da formação de CL. Por fim, a biogênese destas organelas é maior nos agregados formados com plaquetas ativadas com o DENV, corroborando esta hipótese. Sendo assim, esses dados fortemente sugerem que a interação direta com plaquetas ativadas com o DENV seja crucial para que os monócitos respondam com funções específicas e contribuam para a patogênese da doença. Portanto, o conjunto dos resultados obtidos nos revela a importância em estabelecer estratégias terapêuticas adequadas para controlar a resposta do hospedeiro frente à infecção, onde a própria modulação dos CL possa vir a representar um potencial alvo terapêutico para o tratamento da dengue / Dengue is characterized as the most important arthropod-borne human viral disease worldwide, representing a public health problem. Increased activation of immune cells could be involved in the progression of disease to severe forms. Although monocytes have been recognized as important sources of cytokines, the role of platelets in dengue pathogenesis remains understood. Recently our group showed the contribution of platelet-monocyte interaction to inflammatory responses observed in dengue. In fact, it is becoming increasingly clear that platelets have inflammatory functions and can influence innate response. Evidences suggest that specific stimuli-activated platelets can promote phenotypic changes in monocytes, including enhanced foam cell formation, that is characterized by an increase in lipid droplets (LD) \2013 dynamic cytoplasmic lipid-rich organelles, associated to inflammatory and infectious conditions \2013 biogenesis. Our previous works showed a significant increase in LD accumulation in leukocytes from dengue hemorrhagic fever patients, as well as in different cell types infected in vitro. Besides, these organelles were involved in capsid protein localization and virus particle morphogenesis. However, the mechanisms involved in LD biogenesis and function during dengue virus (DENV) infection still unclear. Therefore, this study aim to (i) investigate the mechanisms related to LD formation in distinct cell types during DENV infection; (ii) evaluate the roles of DENV-activated platelets on monocytes immunomodulation in vitro, focusing on LD biogenesis; (iii) analyze the effects of drugs that abrogate LD formation and your impact on viral replication and secretion of inflammatory mediators Our results demonstrate a significant increase in LD number and/or area in distinct cell types infected in vitro. Importantly, heat inactivated DENV failed to induce LD biogenesis in vitro. Besides, modulation of lipogenesis and LD formation, by C75- or triacsin C-treated cells, impair DENV replication. We also observe that DENV is able to modulate genes involved in lipid metabolism, in a MIF \2013 cytokine that induces LD genesis in monocytes \2013 independent fashion. In the second part of this study, we show that platelets exposed to DENV in vitro form aggregates with monocytes and activate signaling cascade in these cells, which culminates in CXCL8/IL-8 secretion. In addition, platelet-monocyte aggregates formation reciprocally increase platelet activation, observed by an enhanced production of CCL5/RANTES and CXCL4/PF4. DENV-activated platelets increase LD formation and COX-2 activation in monocytes, leading to secretion of PGE2. Damping LD biogenesis through treatment with the fatty acid synthase (FAS) inhibitor C75 prevents PGE2, but not CXCL8/IL-8, secretion by platelet-monocyte aggregates. We also demonstrate that DENV-activated platelets secrete high levels of MIF. LD formation in monocytes exposed to DENV-activated platelets is partially dependent on platelet-derived MIF However, the supernatant from DENV-activated platelets is not sufficient to induce LD biogenesis in monocytes. Finally, LD formation is higher in monocytes which have platelets adhered on surface compared to monocytes that do not contact platelets, suggesting that beyond soluble mediators, platelet adhesion is a major event in platelet-mediated modulation of lipid metabolism in monocytes. Thus, our results indicate that DENV infection promotes LD biogenesis and that this event seems to be dependent of host lipid metabolism, since specific inhibition of enzymes involved in lipogenesis blocks the formation of these organelles. This inhibition also leads to decreased DENV replication, suggesting a role of LD in this process. Moreover, our data provide new evidence that DENV-activated platelets modulate LD formation as well as cytokine signaling in monocytes, during cellular aggregates formation, and these events may contribute to dengue pathogenesis. Therefore, the modulation of LD formation might represent an attractive therapeutic target for dengue

Introdução: A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) é uma das formas mais comuns de doença hepática, que acomete cerca de 20% a 30% da população adulta, sendo encontrada mais frequentemente em indivíduos obesos (~90%). Dentre os principais fatores etiológicos estão: resistência à insulina, disfunção mitocondrial e estresse oxidativo. Até o presente momento não há tratamento farmacológico específico para a DHGNA, por isso modificações no estilo de vida como redução do peso corporal (PC), dieta e prática regular de exercício físico são eficazes no combate a DHGNA. Entretanto ainda não está elucidado quais os principais impactos do exercício físico na DHGNA. Objetivos: Com isso, propusemos um estudo experimental que avaliou o efeito do treinamento físico sobre metabolismo oxidativo, funcionalidade mitocondrial hepática e muscular (soléo) e lipogênese hepática em modelo de DHGNA em camundongos obesos (ob/ob). Métodos: Utilizou-se 14 (ob/ob) com déficit em leptina e forma divididos em dois grupos: Sedentário (SED)=7 e treinados (TF=7) de acordo com o equilíbrio na média do PC. Estes animais foram submetidos a um protocolo de 8 semanas de treinamento físico aeróbio (TFA) a 60% da velocidade máxima obtida no teste de corrida realizado no último dia da semana de adaptação ao TFA. Na quarta semana foi realizado o reajuste da intensidade apenas nos TF e o teste de capacidade de corrida foi aplicado na oitava semana em ambos os grupos para se avaliar o desempenho dos animais nas variáveis ligadas ao TFA. Avaliou-se durante todo o protocolo: peso corporal (PC) em média, percentual, evolução do PC e consumo de água e ração. Na expressão gênica intra-hepática e muscular foram analisados: PGC-1Alfa, CPT-1Alfa e PPAR-Alfa relacionados a funcionalidade mitocondrial, em adição analisou-se no fígado: SREBP1. No metabolismo oxidativo analisou-se: biomarcadores (MDA e carbonilas), atividade enzimática de SOD, CAT e GST, sistema antioxidante não enzimático: sulfidrilas, GSH e GSH/GSSG, enzimas metabólicas (Citrato sintase e Beta-HAD). Foi realizada análise histopatológica hepática por HE, além do peso absoluto e relativo dos tecidos hepático e adiposo branco retroperitoneal, periepididimal e inguinal. Resultados: Na análise intergrupo em relação ao PC, observou-se redução significativa no grupo TF, assim como nos consumos de água e ração que foram significativamente menores após 8 semanas: Na análise de expressão gênica hepática encontramos aumento de PGC-1Alfa (p=0,002) e menor de CPT-1Alfa p=0,03) no grupo LTF após 8 semanas de TFA. No músculo Soléo encontramos maior expressão dos genes: PGC-1Alfa (p=0,002) e CPT-1Alfa (p=0,01). Em relação a MDA e carbonilas não houve diferença intergrupo, assim como em SOD, CAT e GST. Entretanto, quando analisamos o sistema antioxidante não enzimático, encontramos que os TF obtiveram maior nível de: sulfídrilas (p=0,02), GSH (p=0,001) e GSH/GSSG (p=0,02), além maior ativação das enzimas metabólicas: citrato sintase (p=0,004) e Beta-HAD (p=0,01). No peso dos órgãos, o TF demonstrou menor peso absoluto e relativo hepático e retroperitoneal. Na análise histológica, não houve diferença significante. Conclusões: Nossos dados demonstram que TFA melhorou o controle do PC, hiperfagia e peso do fígado e retroperitoneal, funcionalidade mitocondrial e metabolismo oxidativo em (ob/ob) com DHGNA. Há necessidade uma intervenção a longo prazo com TFA, para que se posso visualizar possíveis melhorias histológicas / Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is one of the most common forms of liver disease, affecting about 20% to 30% of the adult population, being found more often in obese individuals (~ 90%). Among the main etiological factors are insulin resistance, mitochondrial dysfunction and oxidative stress. To date, no specific pharmacological treatment for NAFLD, so lifestyle modifications such as: reduction in BW, diet and regular practice of physical exercise are effective, however it is not yet elucidated what the main impacts of physical exercise on NAFLD. Therefore, we proposed an experimental study that evaluated the effect of physical training on oxidative metabolism, hepatic and muscular mitochondrial function (soles) and hepatic lipogenesis in an ob / ob model of NAFLD. We used 14 (ob / ob) with leptin deficiency and divided into two groups: Sedentary (SED) = 7 and Trained (TF = 7) according to the mean BW balance. These animals were submitted to an 8-week protocol of aerobic physical training (AET) at 60% of the maximum velocity obtained in the running test performed on the last day of the week of adaptation to AET. In the fourth week the intensity adjustment was only done in the TF and the running capacity test was amplified in the eighth week in both groups to evaluate the performance of the animals in the variables linked to the AET. It was evaluated throughout the protocol: body weight (BW) on average, percentage, BW evolution and water and feed consumption. In the intrahepatic and muscular gene expression were analyzed: PGC-1Alpha, CPT-1Alpha and PPAR-Alpha related to mitochondrial functionality, in addition liver was analyzed: SREBP1. In the oxidative metabolism, we analyzed: biomarkers (MDA and carbonyls), enzymatic activity of SOD, CAT and GST, non-enzymatic anti-oxidant system: sulfhydryl, GSH and GSH / GSSG, metabolic enzymes (Citrate synthase and Beta-HAD). Hepatic histopathological analysis was performed by HE, in addition to the absolute and relative weight of the hepatic and white retroperitoneal, periepididimal and inguinal adipose tissues. In the intergroup analysis in relation to BW, a significant reduction was observed in the TF group, as well as in the water and feed intakes that were significantly lower after 8 weeks: In the analysis of hepatic gene expression we found an increase of PGC-1Alpha (p = 0.002) and CPT-1 = 0.0Alpha 3) in the TF group after 8 weeks of AET. In the soleus we found higher expression of the genes: PGC-1Alpha (p= 0.002) and CPT-1Alpha (p = 0.01). In relation to MDA and carbonyls there was no intergroup difference, as in SOD, CAT and GST. When we analyzed the non-enzymatic anti-oxidant system, we found that the TF had a higher activity of: sulfhydryls (p = 0.02), GSH (p = 0.001) and GSH / GSSG (p = 0.02) metabolic enzymes: citrate synthase (p = 0.004) and Beta-HAD (p = 0.01). In the weight of the organs the TF showed lower absolute and relative hepatic and retroperitoneal weight. In the histological analysis, there was no significant difference. Our data demonstrate that AET improved BW control, hyperphagia and liver and retroperitoneal weight, mitochondrial functionality and oxidative metabolism in (ob / ob) with NAFLD. Long-term AET intervention is needed so that we can visualize possible histological improvements. We considered the effective AET to improve aspects related to NAFLD