No description available.

La F1FO-ATP synthase mitochondriale produit la majorité de l’énergie cellulaire chezles eucaryotes aérobes sous forme d’ATP par le processus des oxydations phosphorylantes.Chez la plupart des espèces, cette enzyme possède une origine génétique double, nucléaire etmitochondriale. Dans la première partie de ce travail, je décris la construction de modèles delevure de mutations du gène mitochondrial ATP6 de l’ATP synthase découvertes chez despatients atteints de maladies neurologiques (9185T>C and 9191T>C) ou dans des tumeurs(8716A>G, 8914C>A, 8932C>T, 8953A>G and 9131T>C). Le gène ATP6 code une sousunitéessentielle (a/6) du domaine FO de l’ATP synthase. J’ai trouvé que la mutation 9185T>Cn’affecte pas l’assemblage de l’ATP synthase, mais conduit à une diminution de la vitesse desynthèse d’ATP d’environ 30%. La mutation 9191T>C empêche presque entièrementl’incorporation de la sous-unité a/6 dans l’ATP synthase. Les cinq mutations identifiées dansles tumeurs ont un effet modeste à nul, indiquant que ces mutations ne favorisent pas latumorigenèse en affectant le processus énergétique mitochondrial, comme évoquéprécédemment. J’ai ensuite étudié la régulation de la synthèse des sous-unités a/6 et 9 dans lesmitochondries de levures. La sous-unité 9 est présente sous la forme d’un anneau de 10 copiesqui interagit avec la sous-unité 6. Durant la catalyse, la rotation de cet anneau provoque deschangements conformationnels favorisant la synthèse d’ATP dans le secteur F1 de l’ATPsynthase. Je montre que la synthèse de ces protéines est couplée à leur assemblage, demanière à ce qu’elles soient produites dans une stoechiométrie adéquate et pour éviterl’accumulation d’intermédiaires d’ATP synthase potentiellement délétères / Mitochondrial F1FO-ATP synthase produces most of the cellular energy in aerobiceukaryotes under the form of ATP in the process of oxidative phosphorylation. This enzymehas in most species a double genetic origin, nuclear and mitochondrial. In the first part of thiswork, I describe the construction of yeast models of ATP synthase mutations in themitochondrial ATP6 gene, that have been found in patients presenting with neurologicaldisorders (9185T>C and 9191T>C) and in tumors (8716A>G, 8914C>A, 8932C>T,8953A>G and 9131T>C). The ATP6 gene encodes an essential subunit (called a/6) of theATP synthase proton-translocating domain (FO). The 9185T>C mutation had no effect on theassembly of ATP synthase, but reduces the rate of ATP synthesis by 30%. The 9191T>Cmutation almost completely prevented incorporation of the subunit a/6 into the ATP synthase.The five mutations found in tumors had modest, if at all, effect, indicating that thesemutations probably do not favor tumorigenesis, as was hypothesized. In the second part of mythesis, I studied the regulation of synthesis of subunits a/6 and 9 in yeast mitochondria. Thesubunit 9 is present in 10 copies forming a ring that interacts with subunit 6. Protonmovements through the FO induce the rotation of the subunit 9-ring, which results inconformational changes that promote ATP synthesis in the catalytic sector (F1) of ATPsynthase. I discovered mechanisms that enable the coupling of the synthesis of these proteinsto their assembly, as a means to ensure the production of subunits 6 and 9 in the rightstoichiometry and to avoid accumulation of potentially harmful assembly intermediates of theATP synthase.

Das COP9 Signalosom ist ein hochkonservierter Proteinkomplex bestehend, aus acht Untereinheiten. In der vorgelegten Promotionsarbeit konnte ein bislang unbekannter Regulationsmechanismus der Biogenese des COP9 Signalosoms identifiziert werden. Die siRNA-vermittelte Reduktion der CSN1-Expression führte zu einer Reduktion der Expression aller CSN-Untereinheiten. Die Transfektion von His-CSN1 in siCSN1-Zellen induzierte die CSN-Neusynthese und ferner einen Anstieg der c-Myc- und STAT1 Expression. Durch die Stimulation der Zellen mit IFN alpha bzw. IFN gamma konnte die de novo Synthese des CSN-Komplexes induziert werden. Die siRNA-vermittelte Inhibition von STAT1, c-Myc bzw. Lin28B führte ebenso wie die Behandlung der Zellen mit AG9 bzw. AG490, pharmakologischen Inhibitoren der JAK-Kinasen, zu einer Reduktion der Proteinexpression der CSN-Untereinheiten. Dabei standen signifikanten Veränderungen auf der Proteinebene geringfügige Änderungen auf der mRNA-Ebene gegenüber. Daher wurde ein post-transkriptioneller Mechanismus zur Regulation der Expression der CSN-Untereinheiten unter Beteiligung von miRNAs postuliert. Diese Regulation wird vermutlich durch die Aktivität von c-Myc und Lin28B verstärkt. Dies stellt einen neuen, bislang unbekannten Mechanismus für die Regulation der Biogenese des COP9 Signalosoms, vermutlich über den c-Myc/Lin28B/let-7-Weg, dar. Die Co-Transfektion der siCSN1-Zellen mit spezifischen komplementären Inhibitoren dieser miRNAs führte zu einer Induktion der Proteinexpression der CSN-Untereinheiten. Die Transfektion von let-7 miRNA-Mimics bewirkte eine Reduktion der Expression der CSN-Untereinheiten in den siCSN1-Zellen. Ferner konnten im Rahmen dieser Arbeit mittels der miRBase Sanger Datenbank und der Software MicroInspector Bindestellen für let-7 miRNAs an den mRNAs der CSN- und der proteasomalen Lid-Untereinheiten identifiziert werden. Der gezeigte Regulationsmechanismus könnte auch für die Biogenese des proteasomalen Lids von Bedeutung sein. / The COP9 signalosome is a highly conserved protein complex composed of eight subunits. In this study a novel, regulatory mechanism of CSN biogenesis was identified. We used stable transfected siCSN1 cells in which the protein and the mRNA expression of CSN subuntis were downregulated. Transfection of His-CSN1 in those siCSN1 cells led to the induction of the de novo Synthesis of the whole CSN complex. In addition the expression of the transcription factors STAT1 and c-Myc was elevated. The cells were treated with IFN alpha or IFN gamma, respectively. This resulted in the induction of the CSN de novo synthesis. Moreover, the siRNA-mediated inhibition of STAT1, c-Myc, Lin28B as well as treatment with the pharmacological inhibitors AG9 or AG490 led to a reduced protein expression of the analysed CSN subunits. We found that in all experiments there was a significant change on protein level in contrast to a marginal change on the RNA level. Based on our study we hypothesized that the CSN biogenesis ist regulated post-transcriptionally by miRNAs. The participation of miRNAs in the regulation of CSN biogenesis was further analysed. The siCSN1 cells were transfected with complementary hairpin inhibitors of let-7 miRNAs, leading to an induction of the CSN synthesis. The transfection of let-7 miRNA-mimics, which enhance the impact of miRNA on target mRNAs, resulted in an decrease of the CSN expression. These findings prove the involvement of miRNAs in CSN biogenesis, presumably via the c-Myc/Lin28B/let-7 pathway. Furthermore, using miRBase Sanger database and MicroInspector software, potential binding sites for let-7 miRNAs were detected within the mRNA sequences of CSN subunits as well as of subunits of the proteasomal lid. Therefore, there is evidence to suggest that this mechanism is crucial for the regulation of the biogenesis of the proteasomal lid as well.

Das Überleben und die Vermehrung der parasitär lebenden Apicomplexa setzen eine effiziente Synthese von Phospholipiden während ihres gesamten Lebenszyklus voraus. In dieser Arbeit nutzten wir zunächst Eimeria falciformis um den Prozess der Lipid-Biogenese in Sporozoiten zu untersuchen. Durch Lipidomics-Analysen wurde das Auftreten von zwei exklusiven Lipiden, Phosphatidylthreonin (PtdThr) und Inositolphosphorylceramid. Der Parasit exprimiert fast das gesamte Lipid-Biogenese- Netzwerk aus eukaryotischen und prokaryotischen Enzymen. Toxoplasma gondii diente als genmanipulierbarer Ersatz für die Untersuchung der Eimeria-Enzyme, mit dem wir ein stark räumlich segmentiertes Netzwerk der Lipidsynthese im Apicoplast, ER, Golgi und Mitochondrium zeigen konnten. Ebenso legte die Komplementierung einer T. gondii-Mutante mit einer PtdThr-Synthase von E. falciformis eine konvergente Funktion von PtdThr für den lytischen Zyklus von Kokzidien-Parasiten nahe. Außerdem setzten wir T. gondii als etablierten Modelorganismus ein, um die De- novo-Synthese und die metabolische Rolle eines bedeutenden Lipidvorläufers, CDP- Diacylglycerin (CDP-DAG), zu untersuchen. Wir konnten zwei phylogenetisch divergente CDP-DAG-Synthase (CDS) Enzyme in T. gondii nachweisen. Das eukaryotisch-typische TgCDS1 und das prokaryotisch-typische TgCDS2 lokalisieren im ER bzw. im Apicoplast. Der konditionierte Knockdown von TgCDS1 bremst das Parasitenwachstum stark ab, was den fast vollständigen Verlust der Virulenz im Mausmodell hervorruft. Das restliche marginale Wachstum der TgCDS1 Mutante wird durch zusätzliche Deletion der TgCDS2 verhindert. Lipidomics-Analysen zeigten eine signifikante und spezifische Abnahme der Phosphatidylinositol (PtdIns)- und Phosphatidylglycerol (PtdGro)-Level bei Verlust der TgCDS1- bzw. TgCDS2-Gene. Zusammengenommen zeigt unsere Arbeit ein Phospholipid-Biogenese-Modell mit erstaunlicher Kooperation verschiedener Organellen und einem extensiven Lipidtransport im Parasiten. / The survival and proliferation of apicomplexan parasites oblige efficient synthesis of phospholipids throughout their life cycles. Here, we first deployed Eimeria falciformis to investigate the process of lipid biogenesis in sporozoites. Lipidomics analyses demonstrate the occurrence of two exclusive lipids phosphatidylthreonine (PtdThr) and inositol phosphorylceramide along with other prototypical lipids. The parasite expresses nearly the entire lipid biogenesis network, which is an evolutionary mosaic of eukaryotic- and prokaryotic-type enzymes. Using Toxoplasma gondii as a gene- tractable surrogate to examine the Eimeria enzymes, we show a highly compartmentalized network of lipid synthesis distributed primarily in the apicoplast, ER, Golgi and mitochondrion. Likewise, trans-species complementation of a T. gondii mutant with a PtdThr synthase from E. falciformis suggests a convergent function of PtdThr in promoting the lytic cycle in coccidian parasites. We also employed the well-established model parasite T. gondii to explore de novo synthesis and metabolic roles of one major lipid precursor CDP-diacylglycerol (CDP- DAG). We report the occurrence of two phylogenetically divergent CDP-DAG synthase (CDS) enzymes in T. gondii. Eukaryotic-type TgCDS1 and prokaryotic-type TgCDS2 reside in the ER and apicoplast, respectively. Conditional knockdown of TgCDS1 severely attenuates parasite growth, which translates into a nearly complete loss of virulence in a mouse model. Residual growth of the TgCDS1 mutant is abolished by subsequent deletion of TgCDS2. Lipidomics analyses reveal significant and specific decline in phosphatidylinositol (PtdIns) and phosphatidylglycerol (PtdGro) upon loss of TgCDS1 and TgCDS2, respectively. Taken together, our work establishes a phospholipid biogenesis model involving significant inter-organelle cooperation and lipid trafficking in apicomplexan parasites.

Die Identifizierung des albostrians Gens erfolgte mittels Karten-basiertem Klonieren. Begonnen wurde mit der Kartierung in zwei kleinen F2-Kartierungspopulationen, MM4205 und BM4205, die zur Lokalisierung des Genes auf dem langen Arm von Gerstenchromosom 7H führte. Durch Kartierung mit hoher Auflösung in Verbindung mit extensiver Markersättigung konnte der betreffende DNA-Bereich schrittweise von anfangs 14,29 cM auf schließlich 0,06 cM eingeschränkt werden, wobei insgesamt 1344 F2-Pflanzen analysiert wurden. Zwischen den nächsten flankierenden genetischen Markern konnte in einem Bereich von 46 Kbp ein einzelnes Gen identifiziert werden. Durch Sequenzvergleich des abgeleiteten Genprodukts mit Einträgen in Datenbanken konnte das Protein der CMF-Genfamilie putativer Transkritionsregulatoren mit DNA-bindenden oder Protein-Protein-Wechselwirkungs-Eigenschaften zugeordnet werden. Eine erste Bestätigung der Identität des Kandidatengens mit dem albostrians-Gen konnte durch Analyse einer EMS-induzierten TILLING-Population (abgeleitet von der Gerstensorte ‚Barke’) erreicht werden. Unter den 42 gefundenen induzierten Mutationen gab es eine Mutation, die zu einem vorzeitigen Stopcodon und damit nach der Translation potenziell zu einem verkürztem Protein führt. Die Nachkommenschaft dieser heterozygoten Mutante spaltete in grüne und albino Pflanzen auf. Der albino-Phänotyp war perfekt mit dem homozygoten Status der nonsense-Mutation in den untersuchten 245 M4-Nachkommen von fünf heterozygoten M3-Pflanzen der Mutantenfamilie verbunden. Nach transienter Transformation von Gerstenblatt-Epidermiszellen mittels biolistischem Cobombardement von ALBOSTRIANS::GFP-Fusionsprotein mit dem mCherry-markierten Organellenmarker pt-rk-CD3-999 konnte die Lokalisation des ALBOSTRIANS-Proteins in den Plastiden und im Kern beobachtet werden. / Map-based cloning was employed for identification of the albostrians gene. Starting with mapping in two small F2 mapping populations, MM4205 and BM4205, the locus could be assigned to the long arm of barley chromosome 7H. High-resolution genetic mapping in conjunction with extensive marker saturation allowed to reduce the genetic target interval iteratively from initially 14.29 cM to finally 0.06 cM by analyzing a total of 1344 F2 plants. A single gene could be identified in a physical distance of 46 Kbp between the closest flanking genetic markers. Functional annotation of the deduced protein revealed it to represent a member of the CMF gene family of putative transcriptional regulators comprising DNA binding or protein-protein interaction properties. The identified candidate gene was first confirmed by screening an EMS-induced TILLING population derived from barley cv. ‘Barke’. Among the 42 identified induced mutations a single mutation introduced a premature stop codon potentially resulting in a shorter protein upon translation. Progeny of this heterozygous mutant segregated for green and albino plants. The albino phenotype was perfectly linked with the homozygous state of the stop codon mutation in 245 M4 offspring of five heterozygous M3 plants of the mutant family. Transient transformation by biolistic co-bombardment of barley epidermal cells with an ALBOSTRIANS::GFP fusion protein and an mCherry labelled organelle marker pt-rk-CD3-999 revealed the ALBOSTRIANS protein is targeting to plastids and nucleus.

No description available.

Outer membrane proteins (OMPs) maintain the viability of Gram-negative bacteria by functioning as receptors, transporters, ion channels, lipases, and porins. Folding and assembly of OMPs involves synchronized action of chaperones and multi-protein machineries which escort the highly hydrophobic polypeptides to their target outer membrane in a folding competent state. Previous studies have identified proteins and their involvement along the OMP biogenesis pathway. Yet, the mechanisms of action and the intriguing ability of all these molecular machines to work without the typical cellular energy source of ATP, but solely based on thermodynamic principles, are still not well understood. Here, we highlight how different single-molecule studies can shed additional light on the mechanisms and kinetics of OMP biogenesis.