[ES] Los sistemas CRISPR-Cas se basan en un mecanismo del sistema inmune adaptativo que se encuentra en bacterias y arqueas. Funcionan utilizando endonucleasas guiadas por ARN (proteínas Cas) para localizar y reconocer secuencias específicas de ácidos nucleicos. Los sistemas CRISPR-Cas son revolucionarios en el campo de la ingeniería genética, permitiendo la edición específica del genoma, ensayos de regulación genética y, desarrolladas en los últimos años, aplicaciones de diagnóstico. Los métodos de detección de ácidos nucleicos son la técnica de diagnóstico de referencia en la clínica debido a su alta sensibilidad y especificidad. Sin embargo, de cara al futuro, debemos desarrollar métodos versátiles de detección de virus que permitan diagnósticos rápidos y fiables, que superen las limitaciones de las técnicas actuales y puedan usarse fácilmente fuera del laboratorio para aplicaciones en puntos de atención (POC). Los sistemas CRISPR-Cas se han reconvertido en herramientas de diagnóstico de ácidos nucleicos gracias a la capacidad de algunas proteínas Cas de realizar cortes colaterales no específicos al reconocer su diana. Nuestro objetivo es ampliar el conjunto de herramientas de diagnóstico CRISPR-Cas mediante el desarrollo de una nueva estrategia de detección de ácidos nucleicos basada en CRISPR-Cas9, cuyo modo de acción se basa en el desplazamiento de hebra en lugar de en la catálisis colateral. Demostramos que los amplicones de ADN del SARS-CoV-2 generados a partir de muestras de pacientes pueden detectarse con CRISPR-Cas9. También demostramos la capacidad de realizar la detección simultánea de diferentes amplicones de ADN con la misma nucleasa, ya sea para identificar diferentes regiones de SARS-CoV-2 o diferentes virus respiratorios. Para avanzar hacia aplicaciones POC, acoplamos el paso de preamplificación isotérmica con oligos biotinilados para producir amplicones marcados. Cuando se combina con CRISPR-Cas9 y sondas marcadas con FAM, esto permite la visualización colorimétrica de la detección mediante ensayos de flujo lateral (LFA) en tiras disponibles en el mercado. La lectura colorimétrica permite la interpretación de los resultados a simple vista, superando la necesidad de un fluorímetro. Detectamos con éxito SARS-CoV-2 a partir de muestras de pacientes en la configuración LFA, y cuando se combinó con RT-RPA multiplexado, se logró la detección de dos regiones distintas del virus en una sola prueba. Además, la ausencia de actividad colateral en nuestra metodología permite el procesamiento de secuencias posteriores adicionales. Por lo tanto, también pretendemos explorar la capacidad de integración de señales de nuestro método de detección basado en CRISPR-Cas9. Demostramos que diseños de circuitos lógicos de ADN pueden procesar diferentes señales de SARS-CoV-2 detectadas por los complejos CRISPR. También nos propusimos mejorar nuestro sistema CRISPR-Cas9 para detectar tanto proteínas como ácidos nucleicos. Nos propusimos diseñar un ARN guía condicional que respondiera a la presencia de la proteína spike del SARS-CoV-2. Para ello, insertamos un aptámero en el ARN guía para bloquear la actividad de Cas9 en ausencia de la proteína. En presencia de la proteína spike, la interacción aptámero-proteína hace que el motivo de bloqueo sufra un cambio conformacional, liberando el ARN guía y activando Cas9. Aunque logramos con éxito el escenario de bloqueo utilizando las secuencias reguladoras, es necesario seguir trabajando para identificar una secuencia que pueda inducir el cambio conformacional específico necesario para restaurar la actividad de Cas9 en presencia de la proteína spike. En conjunto, esta plataforma de diagnóstico CRISPR-Cas9 permite una detección multiplexada en un solo tubo, complementando los métodos existentes basados en CRISPR, y ofreciendo un sistema extensible para aplicaciones en diagnóstico en el punto de atención y biocomputación. / [CA] Els sistemes CRISPR-Cas es basen en un mecanisme del sistema immunitari adaptatiu que es troba en bacteris i arqueus. Funcionen utilitzant endonucleases guiades per ARN (proteïnes Cas) per tal de dirigir-se i reconéixer seqüències específiques d'àcids nucleics. Els sistemes CRISPR-Cas siguen revolucionaris en el camp de l'enginyeria genètica, permetent l'edició específica del genoma, assajos de regulació gènica i, desenvolupades en els darrers anys, aplicacions de diagnòstic. Els mètodes de detecció d'àcids nucleics són la tècnica de diagnòstic de referència a la clínica degut a la seua alta sensibilitat i especificitat. No obstant, de cara al futur, hem de desenvolupar mètodes versàtils de detecció de virus que permeten diagnòstics ràpids i fiables, que superen les limitacions de les tècniques actuals i puguen utilitzar-se fàcilment fora del laboratori per a aplicacions en punts d'atenció (POC). Els sistemes CRISPR-Cas han estat reorientats com a eines de diagnòstic d'àcids nucleics, fet possible per la capacitat d'algunes proteïnes Cas de realitzar un tall col·lateral no específic en reconèixer un objectiu. El nostre objectiu és ampliar el conjunt d'eines de diagnòstic CRISPR-Cas desenvolupant una nova estratègia de detecció d'àcids nucleics basada en CRISPR-Cas9, el mode d'acció del qual es basa en el desplaçament de cadena en lloc de la catàlisi col·lateral. Mostrem que es poden detectar amplicons de DNA de SARS-CoV-2 generats a partir de mostres de pacients amb CRISPR-Cas9. També demostrem la capacitat de realitzar la detecció simultània de diferents amplicons de DNA amb la mateixa nucleasa, ja siga per identificar diferents regions de SARS-CoV-2 o diferents virus respiratoris. Per avançar cap a aplicacions de punt d'atenció (POC), vam combinar el pas de preamplificació isotèrmica amb oligos biotinilats per produir amplicons etiquetats. Quan es combinen amb l'orientació CRISPR-Cas9 i sondes etiquetades amb FAM, això permet la visualització colorimètrica de la detecció mitjançant assajos de flux lateral (LFA) en tires comercials disponibles. La lectura colorimètrica permet la interpretació dels resultats a simple vista, superant la necessitat d'un fluorímetre. Vam detectar amb èxit el SARS-CoV-2 a partir de mostres de pacients en el sistema LFA, i quan es va combinar amb RT-RPA multiplexada, es va aconseguir la detecció de dues regions diferents del virus en una sola prova. A més, l'absència d'activitat col·lateral en la nostra metodologia permet el processament de seqüències addicionals. Per tant, també ens proposem explorar la capacitat d'integració de senyals del nostre mètode de detecció basat en CRISPR-Cas9. Demostrem que els circuits lògics d'ADN dissenyats poden processar diferents senyals de SARS-CoV-2 detectats pels complexos CRISPR. També vam intentar millorar el nostre sistema CRISPR-Cas9 per detectar tant proteïnes com àcids nucleics. Ens vam proposar dissenyar un ARN guia condicional que respon a la presència de la proteïna spike del SARS-CoV-2. Per aconseguir-ho, vam inserir una seqüència d'aptàmer dins de l'ARN guia per bloquejar l'activitat de Cas9 en absència de la proteïna. En presència de la proteïna spike, la interacció aptàmer-proteïna fa que el motiu de bloqueig experimente un canvi conformacional, alliberant l'ARN guia i activant Cas9. Tot i que vam aconseguir amb èxit el bloqueig utilitzant les seqüències reguladores, es necessita més treball per identificar una seqüència que puga induir el canvi conformacional específic necessari per restaurar l'activitat de Cas9 en presència de la proteïna spike. Col·lectivament, aquesta plataforma de diagnòstic CRISPR-Cas9 permet una detecció multiplexada en un sol tub, complementant els mètodes existents basats en CRISPR i oferint un sistema extensible per a aplicacions en diagnòstics de punt d'atenció i biocomputació. / [EN] CRISPR-Cas systems are based on an adaptive immune system mechanism found in bacteria and archaea. They function using RNA-guided endonucleases (Cas proteins), to target and recognize specific nucleic acid sequences. CRISPR-Cas systems are revolutionary in the field of genetic engineering, enabling specific genome editing, gene regulation assays and, developed in recent years, diagnostic applications. Nucleic acid detection methods are the gold-standard diagnostic technique in the clinic due to their high sensitivity and specificity. However, going forward, we must develop versatile virus detection methods that enable fast and reliable diagnostics and that can overcome the limitations of the current techniques and can be easily used outside the laboratory for point-of-care (POC) applications. CRISPR-Cas systems have been repurposed as nucleic acid diagnostic tools made possible by the ability of some Cas proteins to perform non-specific collateral cleavage upon target recognition. We aim to expand the CRISPR-Cas diagnostic toolkit by developing a novel nucleic acid detection strategy based on CRISPR-Cas9, whose mode of action relies on strand displacement rather than on collateral catalysis. We show that SARS-CoV-2 DNA amplicons generated from patient samples can be detected with CRISPR-Cas9. We also demonstrate the ability to perform simultaneous detection of different DNA amplicons with the same nuclease, either to identify different SARS-CoV-2 regions or different respiratory viruses. To advance toward POC applications, we coupled the isothermal preamplification step with biotinylated oligos to produce labelled amplicons. When combined with CRISPR-Cas9 targeting and FAM-labelled probes, this allows for colorimetric visualization of detection using lateral flow assays (LFA) on commercially available strips. The colorimetric readout enables interpretation of the results with the naked eye, surpassing the need for a fluorimeter. We successfully detected SARS-CoV-2 from patient samples in the LFA setup, and when combined with multiplexed RT-RPA, the detection of two distinct regions of the virus was achieved in a single test. Furthermore, the absence of collateral activity in our methodology allows for the processing of additional downstream sequences. Therefore, we also aim to explore the signal integration capability of our CRISPR-Cas9-based detection method. We demonstrate that engineered DNA logic circuits can process different SARS-CoV-2 signals detected by the CRISPR complexes. We also aimed to enhance our CRISPR-Cas9 system to sense both proteins and nucleic acids. We aimed to engineer a conditional guide RNA that responds to the presence of the SARS-CoV-2 spike protein. To achieve this, we inserted an aptamer sequence within the guide RNA to block Cas9 activity in the absence of the protein. Upon the presence of the spike protein, aptamer-protein interaction makes the blocking motif undergo a conformational change, releasing the guide RNA and activating Cas9. While we successfully achieved the blocking scenario using the regulatory sequences, further work is needed to identify a sequence that can induce the specific conformational change required to restore Cas9 activity upon spike protein presence. Collectively, this CRISPR-Cas9 diagnostic platform allows a multiplexed detection in a single tube, complementing the existing CRISPR-based methods, and offering an extensible system for applications in point-of-care diagnostics and biocomputing. / This work was supported by a predoctoral fellowship from the Spanish Ministry of Science and Innovation (PRE2019-088531). / Márquez Costa, R. (2024). Engineering of CRISPR-Cas9-Based Systems for Diagnostics and Biocomputing [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/210634

[ES] El empleo de organismos vivos como biofactorías ha ganado una atención significativa en la industria debido a la creciente demanda de sistemas de producción sostenibles y la escasez de recursos. Entre sus muchas aplicaciones, las biofactorías pueden ser diseñadas para producir feromonas de insectos, las cuales sirven como alternativa ecológica a los pesticidas para el control de plagas en la agricultura. Como prueba de concepto, en esta tesis doctoral se caracterizaron plantas de Nicotiana benthamiana modificadas genéticamente con una ruta multigénica para producir las feromonas de polillas (Z)-11-hexadecenol (Z11-16OH) y (Z)-11-hexadecenil acetato (Z11-16OAc). Las plantas resultantes produjeron cantidades moderadas de ambas feromonas (111.4 µg g-1 FW y 11.8 µg g-1 FW para Z11-16OH y Z11-16OAc, respectivamente), y tasas de emisión diarias de ~10 ng g-1 FW para cada feromona. La producción de feromonas afectó negativamente al desarrollo de las plantas, probablemente debido a la sustancial carga metabólica y posible toxicidad de estos productos. Una estrategia para superar estas limitaciones es diseñar un sistema de expresión condicional que permita a las plantas crecer con normalidad antes de inducir la producción de feromonas. Para ello desarrollamos un conjunto de promotores sintéticos personalizables, llamados GB_SynP, activables con dCasEV2.1, un activador transcripcional potente y programable desarrollado recientemente para la inducción de genes en plantas. Los promotores GB_SynP permitieron una regulación precisa de los transgenes, con unos niveles de transcripción robustos y modulables en el estado "encendido" (presencia de dCasEV2.1 y la correspondiente guía de ARN), y una expresión mínima en el estado "apagado". Para implementar el sistema de producción condicional de feromonas en plantas se generó una nueva ruta multigénica para la biosíntesis de feromonas de polilla bajo el control de los promotores GB_SynP. Paralelamente, el activador dCasEV2.1 se reguló transcripcionalmente mediante el módulo CUP2:GAL4 sensible a sulfato de cobre, un inductor químico ampliamente utilizado en la agricultura. La funcionalidad del sistema se probó mediante expresión transitoria en N. benthamiana, resultando en unos rendimientos en el estado "encendido" de 32.7 µg g-1 FW y 25 µg g-1 FW para Z11-16OH y Z11-16OAc, respectivamente, y unos niveles insignificantes en ausencia de cobre. Sin embargo, la expresión en estable de esta ruta en N. benthamiana produjo unos niveles de expresión de los transgenes significativamente menores y una marcada disminución en la producción de feromonas. Esto supone que el sistema en su forma actual resulte inviable como biofactoría de feromonas en términos prácticos. La optimización de este sistema debe centrarse en mejorar la cascada de activación, en el uso de especies de plantas alternativas con mayor biomasa, y/o en incrementar las tasas de emisión en planta. Como alternativa a la producción de feromonas en plantas, la intercambiabilidad de piezas génicas entre plantas y hongos filamentosos puede aprovecharse para crear biofactorías fúngicas de feromonas. En este sentido, nuestro grupo adaptó previamente el sistema GoldenBraid a hongos filamentosos, llamado FungalBraid. En esta tesis ampliamos la colección de FungalBraid incorporando 27 piezas nuevas que incluyen diferentes marcadores de selección y promotores constitutivos e inducibles, los cuales se caracterizaron funcionalmente en Penicillium digitatum y P. chrysogenum. Además, se expresaron con éxito los promotores GB_SynP en P. digitatum, en combinación con el sistema de dCas9 activadora contenido en el vector pAMA18. Aunque los niveles de expresión de GB_SynP en hongos filamentosos fueron menores que los observados previamente en plantas, ésta y otras herramientas disponibles en la colección FungalBraid pueden utilizarse en el futuro para el desarrollo de biofactorías fúngicas que produzcan feromonas de insectos y otras biomoléculas de alto valor. / [CA] L'ús d'organismes vius com biofàbriques ha guanyat una atenció significativa a la indústria a causa de la creixent demanda de sistemes de producció sostenible i l'escassetat de recursos. Entre les seues moltes aplicacions, les biofàbriques poden ser dissenyades per a produir feromones d'insectes, les quals serveixen com a alternativa ecològica als pesticides per al control de plagues a l'agricultura. Com a prova d'aquest concepte, en aquesta tesi doctoral es van caracteritzar plantes de Nicotiana benthamiana modificades genèticament plantes de amb una ruta multigènica per a produir les feromones d'arnes (Z)-11-hexadecenol (Z11-16OH) i (Z)-11-hexadecenil acetat (Z11-16OAc). Les plantes resultants van produir quantitats moderades de totes dues feromones (111.4 µg g-1 FW i 11.8 µg g-1 FW per a Z11-16OH i Z11-16OAc, respectivament), i taxes d'emissió diàries d'aproximadament 10 ng g-1 FW per a cada feromona. La producció de feromones en aquestes plantes va afectar negativament el seu desenvolupament, probablement a causa de la substancial càrrega metabòlica i possible toxicitat d'aquests productes. Una estratègia per superar aquestes limitacions és dissenyar un sistema d'expressió condicional que permeta a les plantes créixer amb normalitat abans d'induir la producció de feromones. Per això hem desenvolupat un conjunt de promotors sintètics personalitzables, anomenats GB_SynP, activables amb dCasEV2.1, un activador transcripcional potent i programable desenvolupat recentment per a la inducció de gens en plantes. Els promotors GB_SynP van permetre una regulació precisa des transgens, amb uns nivells de transcripció robustos i modulables a l'estat "encès" (presència de dCasEV2.1 i la corresponent guia d'ARN), i una expressió mínima a l'estat "apagat". Per implementar el sistema de producció condicional de feromones en plantes es va generar una nova ruta multigènica per a la biosíntesi de feromones d'arna sota el control dels promotors GB_SynP. Paral·lelament, l'activador dCasEV2.1 es va regular transcripcionalment al mòdul CUP2:GAL4 sensible al sulfat de coure, un inductor químic àmpliament utilitzat en l'agricultura. La funcionalitat del sistema es va provar mitjançant expressió transitòria en N. benthamiana, resultant en uns rendiments a l'estat "encès" de 32.7 g-1 FW i 25 µg g-1 FW per a Z11-16OH i Z11-16OAc, respectivament, i uns nivells insignificants en absència de coure. No obstant això, l'expressió estable d'aquesta ruta a N. benthamiana va produir uns nivells d'expressió dels transgens significativament menors i una marcada disminució en la producció de feromones. Això suposa que el sistema en la seua forma actual resulte inviable com a biofàbrica de feromones en termes pràctics. L'optimització d'aquest sistema ha de centrar-se en millorar la cascada d'activació, en l'ús d'espècies de plantes alternatives amb major biomassa, i/o en incrementar les taxes d'emissió a la planta. Com a alternativa a la producció de feromones en plantes, la intercanviabilitat de peces gèniques entre plantes i fongs filamentosos pot aprofitar-se per crear biofàbriques fúngiques de feromones. En aquest sentit, el nostre grup va adaptar prèviament el sistema GoldenBraid a fongs filamentosos, anomenat FungalBraid. En aquesta tesi, vam ampliar la col·lecció de FungalBraid incorporant 27 peces noves que inclouen diferents marcadors de selecció i promotors constitutius i induïbles, els quals es van caracteritzar funcionalment a Penicillium digitatum i P. chrysogenum. A més, es van expressar amb èxit els promotors GB_SynP en P. digitatum, en combinació amb el sistema de dCas9 activadora contingut en el vector pAMA18. Encara que els nivells d'expressió de GB_SynP en fongs filamentosos van ser menors que els observats prèviament en plantes, aquesta i altres eines disponibles a la col·lecció FungalBraid poden utilitzar-se en el futur per al desenvolupament de biofàbriques fúngiques que produeixin feromones d'insectes i altres biomolècules de gran valor. / [EN] The use of living organisms as biofactories have gained significant attention in the industry due to the increasing demand for sustainable production systems and the shortage of resources. Among their many applications, biofactories can be engineered to produce insect pheromones, which serve as eco-friendly alternatives to pesticides for pest management in agriculture. As a proof of concept, in this thesis we characterized Nicotiana benthamiana plants engineered with a multigene pathway to produce the moth pheromones (Z)-11-hexadecenol (Z11-16OH) and (Z)-11-hexadecenyl acetate (Z11-16OAc). The resulting transgenic plants produced modest amounts of both pheromones (111.4 µg g-1 FW and 11.8 µg g-1 FW for Z11-16OH and Z11-16OAc, respectively), and daily emission rates of ~10 ng g-1 FW for each pheromone. Pheromone production in these plants significantly affected their fitness, likely due to the substantial metabolic burden and possible toxicity of lipid-derived products. One strategy to address these developmental abnormalities consists of engineering conditional transgene expression systems, thus allowing plants to grow normally before inducing the production of pheromones. To achieve this goal, in this thesis we developed a set of customizable synthetic promoters called GB_SynP, which can be activated by dCasEV2.1, a strong programable transcriptional activator recently developed for plant gene regulation. These GB_SynP promoters enabled tight regulation of single and multiple transgenes, with robust and tunable transcription levels in the ON state (presence of dCasEV2.1 loaded with the corresponding gRNA), and minimal or undetectable expression in the OFF state. To implement a conditional expression system for pheromone production in plants, a newly engineered multigene pathway for the biosynthesis of moth pheromones was constructed under the control of GB_SynP promoters. In parallel, the dCasEV2.1 activator was transcriptionally regulated with the CUP2:GAL4 sensor for copper sulphate, an agronomically-compatible chemical trigger. The functionality of this system was tested transiently in N. benthamiana, resulting in estimated yields of 32.7 µg g-1 FW and 25 µg g-1 FW for Z11-16OH and Z11-16OAc respectively in the ON state, and negligible levels in the absence of copper. However, stable transformation of the same copper-regulated pheromone pathway in N. benthamiana plants resulted in significantly lower transgene expression levels, which translated into a great reduction of pheromone yields. This makes the system in its current form a non-viable pheromone biofactory in practical terms. Further optimization should focus on the improvement of the activation cascade, the use of alternative plant hosts with more biomass, and/or the enhancement of emission rates in planta. As an alternative to pheromone production in plants, the interchangeability of DNA parts between plants and filamentous fungi could also be exploited to create fungal biofactories for pheromone production. In this regard, our research group previously adapted the GoldenBraid system for filamentous fungi, which we named FungalBraid. In this thesis, we expanded the FungalBraid collection by incorporating 27 new DNA parts, including different selection markers and several constitutive and inducible promoters, all of which were functionally characterized in Penicillium digitatum and P. chrysogenum. Furthermore, we successfully expressed the GB_SynP promoters developed for plants in P. digitatum, in combination with the non-integrative pAMA18-derived vector for the expression of a dCas9-based activator. Although further optimization of GB_SynP in filamentous fungi is required, as expression levels were lower than those previously observed in plants, this and the other tools available in the FungalBraid collection can be effectively employed in the future for the development of fungal biofactories that produce insect pheromones and other high value biomolecules. / Este trabajo ha sido financiado mediante la Ayuda para la Formación de Profesorado Universitario FPU18/02019 (Ministerio de Educación, Cultura y Deporte), así como por el proyecto europeo SUSPHIRE (PCI2018-092893, Era- CoBiotech), y los proyectos de Plan Nacional I+D PID2019-108203RB-100 y PID2021-125858OB-100 (Ministerio de Ciencia e Innovación). / Moreno Giménez, E. (2023). Synthetic biology tools for production of insect pheromones in plants and filamentous fungi [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/201180

[ES] La biología sintética tiene como objetivo diseñar y construir nuevos sistemas biológicos con funciones deseadas. Los circuitos basados en el control transcripcional han tenido preponderancia en este campo tras el trabajo pionero del toggle switch y del repressilator. Sin embargo, para avanzar en la creación de tecnologías transformadoras que utilicen circuitos genéticos sintéticos, es esencial una combinación de mecanismos de control confiables en todo el flujo de la información genética. Esta combinación es necesaria para alcanzar el nivel de integrabilidad y complejidad funcional observado en la naturaleza. En tal sentido, recientemente han ganado atención los circuitos basados en regulación postranscripcional. En particular, se ha aprovechado la gran programabilidad de ARN para crear circuitos reguladores para la biodetección de señales ambientales o para controlar la vía metabólica en la bioproducción. En esta tesis, por el contrario, proponemos explotar las proteínas de unión a ARN para diseñar circuitos sintéticos que operen a nivel de traducción en la bacteria Escherichia coli. Esta tesis pretende estudiar como surge y se propaga el ruido cuando la expresión genética está regulada por un factor de traducción, y la ampliación de la caja de herramientas de la biología sintética con una nueva caracterización de proteínas de unión a ARN adecuadas. Por un lado, hemos diseñado un circuito de control postrancripcional utilizando la proteína de cápside del fago MS2. Mediante una meticulosa monitorización a nivel unicelular tanto del regulador como del gen regulado, hemos cuantificado el comportamiento dinámico del sistema, así como su estocasticidad. Si bien los esfuerzos anteriores se centraron en comprender la propagación del ruido en las regulaciones transcripcionales, el comportamiento estocástico de los genes regulados a nivel de la traducción sigue siendo en gran medida desconocido. Nuestros datos han revelado que un factor de traducción de proteínas ha permitido una fuerte represión a nivel unicelular, ha amortiguado la propagación del ruido de un gen a otro y ha conducido a una sensibilidad no lineal a las perturbaciones globales en la traducción. Estos descubrimientos han mejorado significativamente nuestra comprensión de la expresión genética estocástica y han proporcionado principios de diseño fundamentales para aplicaciones de biología sintéticas. Por otro lado, aprovechamos el motivo de reconocimiento de ARN (RRM), el dominio proteico de unión a ARN mas prevalente en la naturaleza, a pesar de su predominio en los filos eucariotas, para diseñar un sistema de control postranscripcional ortogonal en Escherichia coli. Aprovechando la proteína de unión a ARN de mamífero Musashi-1, que contiene dos RRM canónicos, desarrollamos un circuito sofisticado. Musashi-1 ha funcionado como represor de la traducción alostérico a través de su interacción especifica con la región codificante N-terminal del ARN mensajero, mostrando capacidad de respuesta a los ácidos grasos. La caracterización integral tanto a nivel poblacional como unicelular ha destacado un cambio significativo en la expresión del reportero. Se obtuvieron conocimientos moleculares a través de la cinética de unión in vitro y evaluaciones de funcionalidad in vivo de una serie de mutantes de ARN. Este trabajo ha mostrado la adaptabilidad de la regulación basada en RRM a organismos mas simples, introduciendo una nueva capa regulatoria para el control de la traducción en procariotas y, en ultima instancia, ampliando los horizontes de la manipulación genética. / [CA] La biologia sintètica té per objectiu dissenyar i construir nous sistemes biològics amb funcions desitjades. Els circuits basats en el control transcripcional han tingut preponderancia en aquest camp després del treball pioner del toggle switch i del repressilator. Tot i això, per avançar en la creació de tecnologies transformadres que utilitzin circuits genètics sintètics, és esencial una combinació de mecanismes de control fiables en tot el flux de la información genètica. Aquesta combinació és necessària per assolir el nivel d'integrabilitat i complexitat funcional observat a la natura. En aquest sentit, recentement han guanyat atenció els circuits basats en regulació posttranscripcional. En particular, s'ha aprofitat la gran programabilitat d'ARN per crear circuits reguladors per a la biodetecció de senyals ambientals o per controlar la via metabólica a la bioproducció. En aquesta tesi, per contra, proposem exlotar les proteïnes d'unió a ARN per dissenyar circuits sintètics que operin a nivel de traducció al bacteri Escherichia coli. Aquesta tesi pretén estudiar com sorgeix i es propaga el soroll quan l'expressió genètica està regulada per un factor de traducció, il'ampliació de la caixa d'eines de la biología sintètica amb una nova caracteriació de proteïnes d'unió a ARN adequades. D'una banda, hem dissenyat un circuit de control postranscripcional utilitzant la proteína de càpsid del fag MS2. Mitjançant una meticulosa monitorització a nivel inucel·lular tant del regulador com del gen regulat, hem quantificat el comportament dinàmic del sistema, així com la seva estocasticitat. Tot i que els esforços anteriors es van centrar a comprendre la propagació del soroll en les regulacions transcripcionals, el comportament estocàstic dels gens regulats a nivell de la traducció continua sent en gran mesura desonegut. Les nostres dades han revelat que un factor de traducció de proteïnes ha permès una forta repressió a nivell unicel·lular, ha esmorteït la propagació del soroll d'un gen a un altre i ha conduït a una sensibilitat no lineal a les pertorbacions globals a la traducció. Aquest descobriments han millorat significativament la nostra comprensió de l'expressió genètica estocástica i han proporcionat principis de sisseny fonamentals per a aplicacions de biología sintètiques. D'altra banda, aprofitem el motiu de reconeixement d'ARN (RRM), el domini proteic d'unió a ARN més prevalent a la natura, malgrat el seu predomini als talls eucariotes, per dissenyar un sistema de control posttranscripcional ortogonal a Escherichia coli. Aprofitant la proteína d'unió a ARN de mamífers Musashi-1, que conté dos RRM canònics, hem desenvolupat un circuit sofisticat. Musashi-1 va funcionar com un repressor de la traducció al·lostèric a través de la seva interacció específica amb la regió codificant N-terminal de l'ARN missatger, mostrant capacitat de resposta als àcids grassos. La caracterització integral tant a nivel poblacional com unicèl·lular va destacar un canvi significatiu a l'expressió de l'informador. S'obtingueren coneixements moleculars a través de la cinètica d'unió in vitro i avaluacions de funcionalitat in vivo d'una sèrie de mutants d'ARN. Aquest treball va mostrar l'adaptabilitat de la regulació basada en RRM a organismos més simples, introduint una nova capa regulatòria per al control de la traducció en procariotes i, en darrer terme, ampliant els horitzons de la manipulació genètica. / [EN] Synthetic biology seeks to design and construct new biological systems with desired functions. Circuits based on transcriptional control have been preponderant in the field following the pioneering work of the toggle switch and repressilator. However, to advance the creation of transformative technologies using synthetic genetic circuits, a blend of dependable control mechanisms throughout the genetic information flow is essential. This combination is necessary to attain the level of integrability and functional complexity observed in nature. In this regard, circuits based on post-transcriptional regulation have recently gained attention. In particular, the great programmability of RNA has been exploited to create regulatory circuits for biosensing of environmental signals or for controlling metabolic pathway in bioproduction. In this thesis, in contrast, we propose to exploit RNA-binding proteins to engineer synthetic circuits that operate at the level of translation in the bacterium Escherichia coli. This thesis intends to study how noise emerges and propagates when gene expression is regulated by a translation factor, and the expansion of the synthetic biology toolbox with new characterization of suitable RNA-binding proteins. On the one hand, we engineered a post-transcriptional control circuit using the phage MS2 coat protein. Through meticulous single-cell level monitoring of both the regulator and the regulated gene, we quantified the dynamic behavior of the system, as well as their stochasticity. While previous efforts focused on understanding noise propagation in transcriptional regulations, the stochastic behavior of genes regulated at the translation level remain largely unknown. Our data revealed that a protein translation factor enabled strong repression at the single-cell level, buffered noise propagation from gene to gene, and led to a nonlinear sensitivity to global perturbations in translation. These findings significantly enhanced our understanding of stochastic gene expression and provided foundational design principles for synthetic biology applications. On the other hand, we harnessed the RNA recognition motif (RRM), the most prevalent RNA-binding domain in nature, despite its predominance in eukaryotic phyla, to engineer an orthogonal post-transcriptional control system in Escherichia coli. Leveraging the mammalian RNA-binding protein Musashi-1, which contains two canonical RRMs, we developed a sophisticated circuit. Musashi-1 functioned as an allosteric translation repressor through its specific interactions with the N-terminal coding region of messenger RNA, exhibiting responsiveness to fatty acids. Comprehensive characterization at both population and single-cell levels highlighted a significant fold change in reporter expression. Molecular insights were gleaned through in vitro binding kinetics and in vivo functionality assessments of a series of RNA mutants. This work showcased the adaptability of RRM-based regulation to simpler organisms, introducing a novel regulatory layer for translation control in prokaryotes, ultimately expanding the horizons of genetic manipulation. / Dolcemascolo, R. (2023). Engineering post-transcriptional regulation of gene expression with RNA-binding proteins [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/202194