Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:10:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327698.pdf: 3972802 bytes, checksum: 1da6e9808db92915061ccdf97179435c (MD5) Previous issue date: 2014 / Araucaria angustifolia é conhecida como pinheiro brasileiro. Faz parte da floresta ombrófila mista, e ocupou originalmente uma área coberta de 20 milhões de hectares no Brasil e atualmente restam apenas 2% da área inicial. Em função da exploração comercial, foi classificada como criticamente ameaçada pela União Internacional para a Conservação da Natureza (UICN) e aparece na Lista Oficial de Espécies Brasileiras Ameaçadas de Extinção. Para se estabelecer programas de recuperação das áreas degradadas, entre outras ações, seria necessário produzir mudas a partir de sementes de A. angustifólia. Mas as sementes perdem a viabilidade ao serem desidratadas, não sobrevivendo à conservação por longos períodos. Para se tentar resolver o problema da perda da viabilidade das sementes é necessário estabelecer tecnologias para a conservação da espécie, que utilizam conhecimentos básicos sobre o ciclo reprodutivo e a o desenvolvimento o embrião zigótico. No entanto, pouco se sabe sobre o desenvolvimento do embrião zigótico de araucária e sobre etapas que ocorrem entre a polinização e a formação da semente madura. Neste trabalho foram utilizadas análises morfológicas, ultraestruturais e histoquímicas para se conhecer a organização morfológica do desenvolvimento embrionário em A. angustifolia. O material vegetal para as análises foi obtido dos megaestróbilos coletados periodicamente a partir de plantas femininas selecionadas e dos microestróbilos, coletados aleatoriamente em uma propriedade rural na região de Curitibanos-SC. Os megaestróbilos foram mensalmente fotografados e das escamas férteis foram obtidos nucelos, megagametófitos, proembriões e embriões dominantes para retirada dos meristemas. Os grãos de pólen foram obtidos de microestróbilos. Os materiais vegetais foram processados para as técnicas de microscopias de luz, confocal e fluorescência, análises histoquímicas, além das microscopias eletrônicas de varredura e de transmissão. Observou-se que a polinização ocorreu em agosto e setembro e os grãos de pólen de A. angustifolia apresentaram superfície granulosa, parede espessa, com compostos de reserva como grãos de amido, vacúolos e núcleos. Nas escamas férteis coletadas a partir de janeiro do primeiro ano do ciclo reprodutivo, pode ser observada a formação de núcleos livres na região central dos nucelos em desenvolvimento, permanecendo esta formação até julho do primeiro ano do ciclo reprodutivo. Entre julho e setembro do mesmo ano, os núcleos livres dão lugar a células em arranjo elipsóide, evoluindo para a formação de um tecido protalial. A partir de setembro foram identificadas as primeiras arquegônias no tecido16protalial, já no segundo ano do ciclo reprodutivo. Em novembro os proembriões estavam formados, concluindo-se que a fertilização ocorreu em outubro. Como ocorre em outras coníferas, nos proembriões de A. angustifolia são identificados três tipos celulares: células da capa, embrionárias e do suspensor. Observou-se que as células da capa apresentaram núcleos compactados e muitos vacúolos no citoplasma. As células embrionárias apresentam formato poliédrico, núcleo grande, ativo e central, enquanto as células do suspensor apresentam formato alongado, raramente eram nucleadas e apresentaram grandes vacúolos. O embrião dominante foi identificado em fevereiro de 2012, no segundo ano do ciclo reprodutivo. Nos meristemas do embrião dominante de A. Angustifolia na fase cotiledonar, foi observado que as células exibem características pluripotentes, como mecanismos de comunicação intercelular e de diferenciação - parede celular fina e irregular com plasmodesmos. No interior das células, mitocôndrias, vacúolos, muitos corpos lipídicos, corpos de Golgi, muitos amiloplastos, retículo endoplasmático e grandes núcleos foram observados. Os resultados ampliam o conhecimento sobre o desenvolvimento reprodutivo de A. angustifolia, fornecendo informações científicas iniciais para o aprofundamento em estudos evolutivos, biotecnológicos, de melhoramento genético e programas de conservação da espécie.<br> / Abstract : Araucaria angustifolia is known as Brazilian pine. Part of the Araucaria forest, and originally occupied a covered area of 20 million hectares in Brazil and currently there are only 2 % of the initial area. Depending on the commercial exploitation has been classified as critically endangered by the International Union for Conservation of Nature (IUCN) and appears in the official list of Brazilian endangered species. To establish the recovery of degraded areas, among other actions, would be necessary to produce seedlings from seeds of A. angustifolia. But the seeds lose viability when they are dehydrated, not surviving the conservation for long periods. To solve the problem of the loss of seed viability is necessary to establish technologies for the conservation of the species , using basic knowledge about the reproductive cycle eao the zygotic embryo development. However, little is known about the development of zygotic embryos of Araucaria and on steps that occur between pollination and formation of the mature seed. In this work morphological, ultrastructural and immunohistochemical analyzes to know the morphological organization of embryonic development in A. angustifolia were used. The plant material for analysis was obtained from megastrobili collected periodically from selected female plants and microstrobili randomly collected from a farm in the region of Curitibanos - SC. The monthly megastrobili collected were photographed and from fertile scales nucellus, megagametophytes, proembryos and dominant embryos for withdrawal of meristems were obtained. The pollen grains were obtained from microstrobili. The plant materials were processed for light microscopy techniques, confocal and fluorescence histochemical analyzes, besides the electronic scanning microscopy and transmission. It was observed that pollination occurred from August to September and the pollen grains of A. angustifolia showed granular surface, thick-walled, with reserve compounds such as starch grains, vacuoles and nuclei. In the fertile scales collected from January of the first year of the reproductive cycle, the formation of free nuclei in the central region of the nucellus in development can be observed, remaining this training until July of the first year of the reproductive cycle. Between July and September of the same reproductive year, free nuclei give rise to cells ellipsoid arrangement, progressing to the formation of a protalial tissue. From September to October, the first arquegonia were identified, in the second year of the reproductive cycle in protalial tissue. In November the proembruos were already formed, concluding that fertilization occurred in October. Cap,18embryonic and suspensor cells: in coniferous proembryos these three cell types are identified. It was observed that the cells of the compressed nuclei and cover have vacuoles in the cytoplasm. Embryonic cells have polyhedral shape, large, active and central nucleus, while cells of the hanger feature elongated, nucleated and were rarely showed large vacuoles. The dominant embryo was identified in February 2012, the second year of the reproductive cycle. Meristems of dominant A. angustifolia embryo on cotyledon stage was observed that cells exhibit pluripotent characteristics, such as intercellular communication mechanisms and differentiation - irregular and thin cell wall with plasmodesmata. Inside the cells, mitochondria, vacuoles, many lipid bodies, Golgi bodies, many amyloplasts, endoplasmic reticulum and large nuclei were observed. The results extend the knowledge on the reproductive development of A. angustifolia, providing early scientific information to deepen in, biotechnology, evolutionary studies of breeding programs and conservation of the species.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-04-29T21:10:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 332938.pdf: 2859795 bytes, checksum: 523a3a9e18ae4c8eea7515a8ed33815a (MD5) Previous issue date: 2015 / A deficiência intelectual (DI) é caracterizada por limitações significativas no funcionamento intelectual e no comportamento adaptativo, origina-se antes dos 18 anos de idade e afeta cerca de 1 a 3% da população do Mundo e 1,37% da população brasileira. As causas etiológicas da DI são variadas e de difícil identificação, devido a sua heterogeneidade. Entre as causas genéticas, a variação no número de cópias (CNVs) de trechos do DNA no genoma vem sendo amplamente estudada em distúrbios do desenvolvimento, através da técnica de hibridização comparativa por arrays (CGH array). CNVs são comumente classificadas como benignas (CNVs comum), de significado clínico incerto (raras), potencialmente patogênicas (raras) e patogênicas (raras). O presente estudo teve como objetivo avaliar as CNVs encontradas em indivíduos com DI e distúrbios do desenvolvimento e interpretar a sua contribuição para o aparecimento do fenótipo. Foram analisados 109 resultados de exames de CGH array, realizados pelo Laboratório de Genética Humana Neurogene, em Santa Catarina, com as informações clínicas e fenotípicas fornecidas através do preenchimento de questionários pelos médicos responsáveis pela solicitação dos exames. Houve uma prevalência de dois terços do sexo masculino na população estudada, sendo que os principais fenótipos que levaram a solicitação da investigação foram ADNPM, dismorfias de cabeça e face e DI. Oesclarecimento diagnóstico foi maior para DI severa, DI leve e hiperatividade associada a outros distúrbios. Os indivíduos testados apresentaram um total de 276 CNVs (187 microduplicações e 89 microdeleções); 81,2% benignas, 7,2% de significado incerto, 9,4% patogênicas e 2,2% potencialmente patogênicas. Os cromossomos 18, 19 e 21 apresentaram o menor número de CNVs. Não foi encontrada nenhuma CNV rara nos cromossomos 5, 10, 12, 19, 21 e Y. Seis casos potencialmente patogênicos foram descritos em mais detalhe, um desses casos representa uma deleção em 3 p13-p14.1 de 1.9MB, que confirma que a haploinsuficiência do gene MITF é suficiente para causar surdez congênita. Este estudo vem destacar a importância do CGH array para o diagnóstico de distúrbios do desenvolvimento inclusive para que seja inserido nos programas de saúde pública como um primeiro teste diagnóstico a ser ofertado pelo SUS.<br> / Abstract : Intellectual disability (ID) is characterized by significant limitations in intellectual functioning and in adaptive behavior. It originates before the age of 18, and affects about 1-3% of the world population and about 1.37% of the Brazilian population (CENSO 2010). ID has different levels of severity: mild, moderate, severe or profound, depending on the degree of intellectual impairment combined with adaptive behaviour. The etiological causes of ID are varied and difficult to identify due to clinical and genetic heterogeneity. Among the genetic causes, copy number variation (CNV) of DNA stretches in the genome has been widely studied in developmental disorders. CNVs are commonly classified as benign (common CNVs), of uncertain clinical significance (rare), potentially pathogenic (rare), and pathogenic (rare). This study aims to evaluate the CNVs found in patients with ID and developmental disorders and classify them according to their contribution to the appearance of the phenotype. We analyzed 109 results for CGH array investigation to obtain the phenotype of each individual. We observed: (1) a higher prevalence of males in the population studied, (2) that the major phenotypes observed were developmental delay, dysmorphic face and head and ID, and (3) the higher diagnostic rates were obtained for individuals with severe ID, mild ID, and hyperactivity. An overall of 276 CNVs (187 microduplications and 89 microdeletions) were observed. Ofthese changes 81.2% were benign, 7.2% of uncertain significance, 2.2% potentially pathogenic and 9.4% pathogenic. Chromosomes 18, 19 and 21 had the lowest number of CNVs. Rare CNVs were not observed in chromosomes 5, 10, 12, 19, 21 and Y. Six cases of potentially pathogenic CNVS were studied in more detail, and in one of these cases a deletion of 1.9MB in 3p13-p14.1 was observed, confirming that the haploinsufficiency of the MITF gene is sufficient to cause congenital deafness. This study highlights the importance of the investigation of CNVs in the diagnosis of developmental disorders, underscoring the importance to include array CGH as first investigation for ID in the public health system (SUS).

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-11-07T03:25:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 347991.pdf: 3464947 bytes, checksum: 4b9adce4d95c51c30b0828be864fb06e (MD5) Previous issue date: 2017 / A crista neural (CN) é composta por células heterogêneas e multipotentes, e pode ser dividida em CN cefálica (CNC) e truncal (CNT). As células da CNC originam, in vivo, células neurais e mesenquimais, neste último caso, formando parte do esqueleto craniofacial (condrócitos, osteócitos e odontoblastos) e tecido conjuntivo da face (adipócitos e fibroblastos dermais). As células da CN truncal (CNT), por sua vez, originam in vivo, células gliais e neurônios do sistema nervoso periférico, além de células cromafins do sistema endócrino. Melanócitos são formados por células da CNC e CNT. In vivo, as células da CNT não apresentam a capacidade de se diferenciarem em fenótipos mesenquimais. Entretanto, in vitro, sob estímulo com fatores químicos e físicos, estas células podem se diferenciar em condrócitos, osteócitos e adipócitos. Frente a estas capacidades que as células da CNT apresentam in vitro, avaliamos a utilização de uma matriz sintética e pura chamada PuraMatrix , para cultivo e diferenciação de células da CNT. Inicialmente, testamos e padronizamos anticorpos para marcação de osteócitos (SB-1, SB-2, SB-3 e SB-5) em membros posteriores de embriões de codornas. Em seguida, realizamos culturas de células da CNT com embriões de 18-22 pares de somitos, com meio básico de cultivo e com adição de Fatores de Diferenciação Mesenquimais (FDM) para estimular as células a se diferenciarem em adipócitos e osteócitos. Foram testadas as concentrações de PuraMatrix 0,15%; 0,25%, 0,5% e 1%. Análises fenotípicas de frequência e quantitativas através da técnica de imunocitoquímica e colorações específicas foram realizadas nos 14º e 21º dias de cultivos para todos os fenótipos da CN. As quatro concentrações de PuraMatrix suportaram o cultivo de células da CNT. Entretanto, pelo baixo número de células observado, a concentração de PuraMatrix 1% foi descartada de nossas análises. As concentrações de PuraMatrix 0,15%; 0,25% e 0,5% possibilitaram a diferenciação de células da CNT para células gliais, neurônios, melanócitos, células musculares lisas e condrócitos, tanto em culturas controles quanto estimuladas com FDM. Adipócitos estiveram presentes nas três concentrações quando estimuladas com FDM, e também nas concentrações de PuraMatrix 0,15% e 0,25% na condição controle. Osteócitos foram analisados nas duas concentrações mais baixas de PuraMatrix , onde marcações para SB-3 ocorreram, mas em co-localização com cartilagem, assim como observado in vivo. SB-5 mostrou-se muito específico para osteoblastos/osteócitos e apresentou marcação tanto em cultivos controles quanto tratados. Apenas no 21º dia, houve marcação de alcalina fosfatase e de matriz mineralizada. PuraMatrix abre novas perspectivas para o desenvolvimento de estudos clonais de progenitores da CN e poderá permitir a identificação de novos progenitores com as potencialidades neurais-mesenquimais para CNT. / Abstract : The neural crest (NC) is composed of heterogenous and multipotent cells, and can be divided into cephalic (CNC) and trunkal (TNC) NC. CNC cells originate, in vivo, neural and mesenchymal cells, the last one forming part of the craniofacial skeleton (chondrocytes, osteocytes and odontoblasts) and connective tissue of the face (adipocytes and dermal fibroblasts). The TNC cells, in turn, originated in vivo, glial cells and neurons of the peripheral nervous system, in addition to chromaffin cells of the endocrine system. Melanocytes are formed by CNC and TNC cells. In vivo, TNC cells don?t have the ability to differentiate into mesenquimal phenotypes. However, in vitro, under stimulation with chemical and physical factors, these cells can differentiate into chondrocytes, osteocytes and adipocytes. Faced with these capabilities that TNC cells present in vitro, we evaluated the use of a pure synthetic matrix called PuraMatrix , for TNC cell culture and differentiation. Initially, we tested and standardized antibodies for marking osteocytes (SB-1, SB-2, SB-3 and SB-5) on hind limbs of quail embryos. Then, we performed cell cultures of TNC cells with embryos of 18-22 pairs of somites, with basic culture medium and with addition of Mesenchymal Differentiation Factors (MDF) to stimulate the cells to differentiate into adipocytes and osteocytes. The concentrations of PuraMatrix 0.15%; 0.25%, 0.5% and 1% were tested. Frequency and quantitative phenotypic analyzes using the immunocytochemistry technique and specific staining were performed on the 14th and 21st day of cultures for all NC phenotypes. The four concentrations of PuraMatrix supported the cultivation of CNT cells. However, due to the low number of cells observed, the concentration of PuraMatrix 1% was discarded from the analyzes. The concentrations of PuraMatrix 0.15%; 0.25% and 0.5% allowed the differentiation of TNC cells into glial cells, neurons, melanocytes, smooth muscle cells and chondrocytes in both control and MDF stimulated cultures. Adipocytes were present in the three concentrations when stimulated with MDF, and also in the concentrations of PuraMatrix 0.15% and 0.25% in the control condition. Osteocytes were analyzed for the two lowest concentrations of PuraMatrix , where SB-3 marker occurred with co-localization with cartilage as well as observed in vivo. SB-5 showed to be very specific for osteoblasts/osteocytes and showed labeling in both control and treated cultures. On day 21 only, there was marking of alkaline phosphatase and mineralized matrix. PuraMatrix opens new perspectives for the development of clonal studies of NC progenitors and may allow the identification of new progenitors with the neural-mesenchymal potentialities for TNC.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:17:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337733.pdf: 2596779 bytes, checksum: c5381f2da78b8237b60b5e66535caf71 (MD5) Previous issue date: 2015 / Os decápodes representam um grupo de crustáceos que obteve sucesso evolutivo em ambientes diferentes, e apresentam características que os tornam de interesse para estudos de biologia do desenvolvimento. A espécie Macrobrachium olfersi destaca-se por ter sido estudada amplamente, desde sua distribuição geográfica até biologia reprodutiva e desenvolvimento embrionário. Foram padronizados diferentes estagiamentos para caracterizar a ontogenia dessa espécie, sendo observados alguns processos restritos ao grupo em que ela está inserida. A diferenciação da região posterior do corpo, correspondente a papila caudal, é realizada pelo mecanismo de teloblastia. Esse mecanismo forma os segmentos corporais e é controlado por genes conservados entre os artrópodes. O objetivo desse trabalho foi caracterizar a morfologia dos embriões nos estágios que compreendem o pré-nauplius (E3), nauplius (E4) e pós-nauplius inicial (E5 a E7) e relacionar esses dados com a quantificação da expressão relativa dos genes caudal, engrailed e even-skipped. Foram realizadas marcações nucleares com Hoechst nos preparados totais de ovos e de embriões nas idades que correspondem aos estágios E3 a E7, e observou-se o crescente rearranjo celular organizado pelo processo de teloblastia na região pós-naupliar, sendo visualizados os ectoteloblastos, dispostos em fileiras ao longo da papila caudal. A expressão relativa do gene caudal decresce com o avanço do crescimento da papila caudal e sua expressão também foi identificada nos ovários das fêmeas, comprovando a contribuição materna desse gene nessa espécie. Para o gene even-skipped foram identificadas duas isoformas, na primeira há decréscimo de expressão relativa com o avanço da embriogênese, o que possivelmente está relacionado com a segmentação corporal, e na segunda isoforma há aumento de sua expressão, o que pode estar relacionado com a neurogênese, outra função conhecida desse gene. engrailed se apresentou expresso linearmente entre as diferentes idades, sendo que pode atuar tanto no processo de segmentação quanto no processo de neurogênese. O presente estudo relacionou temporalmente os aspectos morfológicos com o controle a nível molecular, propiciando resultados para melhor compreender a evolução dos artrópodes.<br> / Abstract : Decapods constitute a group of crustaceans with evolutionary success in different environments, and have features that make them interesting for developmental biology studies. M. olfersi stands out for having been studied widely, since its geographical distribution to reproductive biology and embryonic development. Different stagings were standardized to characterize the ontogeny of this species, being analyzed some processes restricted to the group in which it is inserted. The differentiation of the posterior region of the body, corresponding to caudal papilla, is performed by the teloblastic mechanism. This mechanism forms the body segments and is controlled by genes whose are conserved among the arthropods. The objective of this work was to characterize the morphology of embryos in stages that comprise the pre-nauplius (E3), nauplius (E4) and post-nauplius (E5 to E7) and correlate that data with the genes relative expression quantification caudal, engrailed and even-skipped. Nuclear stainings were held with Hoechst in whole-mounted eggs and embryos in the stages E3 to E7, and noted the growth on cellular rearrangement organized by teloblastic mechanism process in the post-naupliar region, being identified the ectoteloblasts, arranged in rows along the caudal papilla. The relative gene expression of caudal decreases with the advance on the caudal papilla growth and their expression was also identified in oocytes of females, proving the maternal contribution of this gene in this species. For the gene even-skipped, two isoforms have been identified, in the first one there is a decrease on its relative expression with the advancement of embryogenesis, which possibly is related to body segmentation, and in the second isoform there is an increase on its expression, which may be related to neurogenesis, another known function of this gene. engrailed is expressed linearly between the different ages, and possibly acts on both the segmentation process as in the process of neurogenesis. The present study related temporally on the morphological aspects with the control at the molecular level, providing results to better understand the arthropods evolution.

A transferência gênica baseada em retrovírus permite o carregamento e integração de um material genético exógeno ao genoma de uma célula alvo, o que permite a expressão estável do transgene tanto in vitro quanto in vivo. Até o momento não existiam lentivetores que permitam a clonagem de diferentes genes sob promotores de expressão gênica regulada por tetraciclina e também a análise de expressão através do IRES - sistema repórter. No presente trabalho, foi criada uma série de lentivetores contendo plasticidade estrutural para permitir a clonagem de diferentes genes, sítios únicos de clivagem para clonagem de diferentes promotores, elemento TRE para regular a expressão do transgene com tetraciclina ou doxiciclina e o sítio IRES expressando duas proteínas repórteres: GFP ou DsRed. A série de vetores produzidos, denominados pLR1, pLR2 e pLR3 possue o promotor RSV antecedido pelo elemento TRE e um sítio de clonagens múltiplas. Além disso, o pLR2 possui o sistema IRES-GFP e o pLR3 o sistema IRES-DsRed para geração de mRNA bicistrônico. A eficiência funcional de cada um dos elementos utilizados nas estruturas de cada um dos plasmídeos os transforma numa boa ferramenta biotecnológica para transferência gênica estável. / Gene transfer based upon lentiviral vectors allows the integration of exogenous genes into the genome of a target cell, turning these vectors into a powerful tool that allows stable expression of transgenes in mammalian cells both in vitro as well as in vivo. Currently, no plasmids for lentivirus are available that allow cloning of different genes to be regulated for different promoters or regulates by tetracycline and, also, that permit the analysis of the expression through a IRES - reporter gene system. In this work, we have generated a series of lentiviral vectors containing: a malleable structure to allow the cloning of different target genes in a multicloning site (mcs); unique sites to exchange promoters; TRE element to regulate the transgene expression with molecules such as tetracycline or doxicycline, and internal ribosome entry site followed by one of two reporter genes: GFP or DsRed. The series of vectors were named pLR1, pLR2 and pLR3. This vector serie has the RSV promoter flanked by a TRE element and a multicloning site. Also, the pLR2 plasmid has the IRES-GFP sequence after the mcs while pLR3 has IRES-DsRed for the generation of a bicistronic mRNA. The functional efficiency of each element used in the different plasmid structures transforms the plasmid serie into a powerful biotechnology tool for stable gene transfer.

Tuberculosis (TB) is a neglected disease, which continue to be major cause of morbidity and mortality worldwide, killing together around 5 million people each year. Mycolic acids, the hallmark of mycobacteria, are high-molecular-weight α-alkyl, β-hydroxy fatty acids. Biochemical and genetic experimental data have shown that the product of the M. tuberculosis inhA structural gene (InhA) is the primary target of isoniazid mode of action, the most prescribed anti-tubercular agent. InhA was identified as an NADH-dependent enoyl-ACP(CoA) reductase specific for long-chain enoyl thioesters and is a member of the Type II fatty acid biosynthesis system, which elongates acyl fatty acid precursors of mycolic acids. M. tuberculosis is a target for the development of anti-tubercular agents. Here we present a brief description of the mechanism of action of, and resistance to, isoniazid. In addition, data on inhibition of mycobacterial enoyl reductase by triclosan are presented. We also describe recent efforts to develop inhibitors of M. tuberculosis enoyl reductase enzyme activity.

Resumo: A dengue tornou-se, na última década, a mais importante arbovirose em temos de morbidade e mortalidade, afetando, aproximadamente, 100 milhões de pessoas ao ano. A doença é causada por um vírus de RNA cadeia simples, o qual é transmitido através da picada de mosquitos do gênero Aedes, presentes ao longo de toda a região tropical e subtropical do mundo. Uma vez que não existem vacinas contra a dengue e seus sintomas são semelhantes aos de outras doenças, um método diagnóstico rápido e confiável é fundamental para o controle efetivo de epidemias. Os principais métodos diagnósticos utilizados atualmente são os ensaios imunoenzimáticos de captura de IgM (MAC-ELISA) e a detecção do RNA virai através de RT-PCR. A eficiência dessas duas técnicas, no entanto, é variável e depende da qualidade dos reagentes e do protocolo utilizado. A fim de contribuir para a melhoria das técnicas de diagnóstico atualmente utilizadas no Brasil, desenvolveu-se esse trabalho, cujos principais objetivos foram: 1) obter antígenos específicos e a um baixo custo, capazes de substituir antígenos produzidos em cérebro de camundongo, utilizados em um teste de MAC-ELISA desenvolvido no Brasil; 2) estabelecer um protocolo de PCR em tempo real para detectar o RNA do vírus da dengue em amostras de soro humano, utilizando como protótipo o sorotipo 1 do vírus (DEN1). Os antígenos usados no teste de MAC-ELISA foram produzidos em cultivo celular e foram testados utilizando-se 50 soros de indivíduos suspeitos de infecção por dengue. Os resultados foram comparados com os do teste original. Apenas dois resultados discordantes foram obtidos. A análise dessas duas amostras por uma terceira técnica (dot-blot) confirmou os resultados obtidos com o antígeno feito em cultura, sugerindo que este, além de ser mais facilmente produzido, é mais sensível e específico. Os dois testes sorológicos detectaram um número maior de amostras positivas entre os soros coletados após o sétimo dia de início dos sintomas. O protocolo de PCR em tempo real desenvolvido nesse trabalho foi comparado com um protocolo de nested PCR descrito na literatura. Ambos os testes foram avaliados quanto sua sensibilidade e especificidade utilizando RNA de vírus da dengue dos sorotipos 1 (DEN1) e 2 (DEN2) e de vírus da febre amarela. A nested PCR foi capaz de detectar o RNA proveniente de 2x102 FFU/ml, enquanto que a sensibilidade da PCR em tempo real foi inferior a 6,25x10"1 FFU/ml. A PCR em tempo real para DEN1 não foi capaz de amplificar amostras de DEN2, mas detectou como positivas as amostras de febre amarela, o que não ocorreu na nested PCR. O mesmo painel de soros testado por ELISA foi submetido às duas técnicas de PCR e os resultados obtidos foram comparados. A baixa sensibilidade da nested PCR foi confirmada pela baixa taxa de detecção observada quando RNAs extraídos diretamente dos soros foram usados na reação. Quando os soros foram passados em cultura celular antes da extração do RNA, porém, o número de amostras positivas aumentou consideravelmente, indicando que essa etapa é importante para o melhor funcionamento dessa técnica. A maior sensibilidade da PCR em tempo real parece compensar, no entanto, esse problema. As duas técnicas de PCR detectaram um número maior de amostras positivas entre os soros coletados antes do sétimo dia após o início dos sintomas, indicando que os métodos moleculares são complementares aos testes sorológicos e as duas abordagens devem, portanto, ser utilizadas em conjunto a fim de garantir um diagnóstico preciso. Além disso, os resultados até o momento obtidos sugerem que, devido sua maior sensibilidade e simplicidade, a PCR em tempo real é mais apropriada, do que a nested PCR, para o diagnóstico da dengue.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-03-14Bitstream added on 2014-06-13T20:39:57Z : No. of bitstreams: 1 ortiz_rj_me_botib.pdf: 1189542 bytes, checksum: 04857e6dfde7c2b12ebae4a0e55e4065 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A ordem Siluriformes compreende um imenso e diversificado grupo de peixes, distribuído nas regiões tropicais de todo o mundo. Apesar de bastante estudadas, as hipóteses de relacionamento entre as famílias nessa ordem ainda são contraditórias, inclusive aquelas que dizem respeito aos Doradidae. Os Doradidae compreendem uma famíla de bagres de água doce, endêmica da América do Sul, facilmente reconhecíveis pela presença de uma fileira de placas ósseas em ambos os lados do corpo e podem ser separados em dois grupos segundo a presença de barbilhão maxilar simples ou ramificado. Compõem um grupo reconhecidamente monofilético, cujas relações intra-genéricas são ainda pouco definidas. Os Doradidae apresentam um complexo produtor de som compartilhado com algumas outras famílias de Siluriformes com as quais guardam diferentes níveis de relações de parentesco. O estudo das relações de parentesco entre as diferentes famílias de Siluriformes, e também entre os diferentes gêneros e espécies de uma mesma família, em geral têm por base características osteológicas e de partes moles, além de dados moleculares. Sabe-se que as características sexuais das espécies e conseqüentemente o tipo de espermatogênese e de espermiogênese, e a morfologia dos espermatozóides podem conter traços filogenéticos e serem úteis nas análises cladísticas. Portanto, nesse estudo, descreveu-se a espermatogênese, a espermiogênese e os caracteres ultraestruturais dos espermatozóides, de representantes da família Doradidae. Descreveu-se também a espermatogênese, a espermiogênese e os caracteres ultraestruturais dos espermatozóides de representantes de Auchenipteridae e Ariidae. Os dados obtidos foram testados em análises comparativas segundo as hipóteses vigentes sobre as relações de parentesco: entre os representantes dos Doradidae; entre os Doradidae e os Auchenipteridae... / The order Siluriformes comprises a large and diversify group of fishes, distributed throughout the Tropical regions of the world. Despite the many studies available, the hypotheses about the relationship among the families of Siluriformes are still controversial. The same occurs within the family Doradidae. Doradidae is a monophyletic family of freshwater catfishes endemic of the South America in which the inter-generic relationships are still not well definite. Doradidae are easily externally recognizable by having a single row of bony plates along the sides of the body, and they are often separated in two groups, one with simple and the other with fimbriate maxillary barbels. Doradidae have a sound apparatus shared with some other families of Siluriformes with different levels of relationship. The study of the relationship among the different families of Siluriformes and also among the different genera and species, in general, have based on bony and/or soft characteristics of the body, beside molecular data. It is known that the sexual characteristics of the species, and consequently the type of spermatogenesis and spermiogenesis, and also the sperm morphology, can have phylogenetic traces and can be useful in the cladistic analysis. In the present study were described the spermatogenesis and the spermiogenesis, and also the ultrastructural characteristics of the spermatozoa of representatives of the family Doradidae. The spermatogenesis and the spermiogenesis, and the ultrastructural characteristics of the spermatozoa of representatives of the families Auchenipteridae and Ariidae were also described. The data obtained were utilized in comparative analysis based on the actual hypothesis about relationship: within the representatives of the Doradidae; among the representatives of the Doradidae and the Auchenipteridae, its supposed sister-group; between the Doradoidea... (Complete abstract click electronic access below)

A transferência gênica baseada em retrovírus permite o carregamento e integração de um material genético exógeno ao genoma de uma célula alvo, o que permite a expressão estável do transgene tanto in vitro quanto in vivo. Até o momento não existiam lentivetores que permitam a clonagem de diferentes genes sob promotores de expressão gênica regulada por tetraciclina e também a análise de expressão através do IRES - sistema repórter. No presente trabalho, foi criada uma série de lentivetores contendo plasticidade estrutural para permitir a clonagem de diferentes genes, sítios únicos de clivagem para clonagem de diferentes promotores, elemento TRE para regular a expressão do transgene com tetraciclina ou doxiciclina e o sítio IRES expressando duas proteínas repórteres: GFP ou DsRed. A série de vetores produzidos, denominados pLR1, pLR2 e pLR3 possue o promotor RSV antecedido pelo elemento TRE e um sítio de clonagens múltiplas. Além disso, o pLR2 possui o sistema IRES-GFP e o pLR3 o sistema IRES-DsRed para geração de mRNA bicistrônico. A eficiência funcional de cada um dos elementos utilizados nas estruturas de cada um dos plasmídeos os transforma numa boa ferramenta biotecnológica para transferência gênica estável. / Gene transfer based upon lentiviral vectors allows the integration of exogenous genes into the genome of a target cell, turning these vectors into a powerful tool that allows stable expression of transgenes in mammalian cells both in vitro as well as in vivo. Currently, no plasmids for lentivirus are available that allow cloning of different genes to be regulated for different promoters or regulates by tetracycline and, also, that permit the analysis of the expression through a IRES - reporter gene system. In this work, we have generated a series of lentiviral vectors containing: a malleable structure to allow the cloning of different target genes in a multicloning site (mcs); unique sites to exchange promoters; TRE element to regulate the transgene expression with molecules such as tetracycline or doxicycline, and internal ribosome entry site followed by one of two reporter genes: GFP or DsRed. The series of vectors were named pLR1, pLR2 and pLR3. This vector serie has the RSV promoter flanked by a TRE element and a multicloning site. Also, the pLR2 plasmid has the IRES-GFP sequence after the mcs while pLR3 has IRES-DsRed for the generation of a bicistronic mRNA. The functional efficiency of each element used in the different plasmid structures transforms the plasmid serie into a powerful biotechnology tool for stable gene transfer.

Tuberculosis (TB) is a neglected disease, which continue to be major cause of morbidity and mortality worldwide, killing together around 5 million people each year. Mycolic acids, the hallmark of mycobacteria, are high-molecular-weight α-alkyl, β-hydroxy fatty acids. Biochemical and genetic experimental data have shown that the product of the M. tuberculosis inhA structural gene (InhA) is the primary target of isoniazid mode of action, the most prescribed anti-tubercular agent. InhA was identified as an NADH-dependent enoyl-ACP(CoA) reductase specific for long-chain enoyl thioesters and is a member of the Type II fatty acid biosynthesis system, which elongates acyl fatty acid precursors of mycolic acids. M. tuberculosis is a target for the development of anti-tubercular agents. Here we present a brief description of the mechanism of action of, and resistance to, isoniazid. In addition, data on inhibition of mycobacterial enoyl reductase by triclosan are presented. We also describe recent efforts to develop inhibitors of M. tuberculosis enoyl reductase enzyme activity.